Antitelo – struktura

Antitelo
 At specifično vezuje Ag
- u fazi prepoznavanja (kao R za antigen na membrani B limfocita) - u efektorskoj fazi humoralnog imunskog odgovora

 Distribucija antitela
- u biološkim tečnostima:

plazmi/serumu, sekretima (mukus, mleko) intersticijskoj tečnosti u tkivima

- u B limfocitima:

u citoplazmatskim organelama (ER i Goldži kompleks) na membrani

- vezuju se za površinu nekih ćelija (fagociti, NK i mast ćelije imaju FcR)

Izdvajanje (prečišćavanje) antitela
Krv (plazma) serum (antiserum; pojam titra)

koagulacija

Proteini plazme (seruma): -albumini -globulini Elektroforezom: III frakcija globulina – gamaglobulini Imunoglobulini =Antitela

Izdvajanje Ig iz bioloških tečnosti: 1. Precipitacija amonijum sulfatom 2. Hromatografske tehnike

Struktura antitela
dva međusobno identična kraća polipeptidna lanca (laki lanci, eng. light, L, oko 24 kDa) i dva međusobno identična duža polipeptidna lanca (teški lanci, eng. heavy, H, od 55 do 70 Kda)
Lanci su aranžirani u obliku slova Y

Molekulske veze između H i L lanaca

 Kovalentne veze koje povezuju L i H lance su disulfidne veze  Disulfidne veze povezuju i dva H lanca

Domeni  Rane studije su pokazale određenu pravilnost u strukturi svih Ig  I L i H lanci : Svakih 100-110 AK ima 60AK uvijenih u globularnu strukturu: DOMEN .

međusobno povezane disulfidnim mostom .Domeni nastaju mnogostrukim savijanjem lanca. već tako da se od niza antiparalelno postavljenih lanaca stvaraju dve b-nabrane ploče. ne u strukturu aheliksa.

VH) VL i VH formiraju antigen-vezujuće mesto (paratop) Ostali domeni su relativno konstantni Konstantni (C) domeni L i H lanca (CL i CH) CH domeni su odgovorni za ostvarivanje efektorskih (bioloških) funkcija At H lanci: 1 V domen i 3 do 4 C domena L lanci: 1 V domen i 1 C domen .Domeni Varijabilnost u sekvenci je ograničena na prvi domen L i H lanca Varijabilni (V) domeni L i H lanca (VL.

Varijabilni i hipervarijabilni regioni Ig  Amino terminalna AK sekvenca (V domen. V region) varira od jednog do drugog L i H lanca Ig  Varijabilnost u AK sekvenci je koncentrisana u određenim segmentima V domena hipervarijabilni regioni (HV regioni)  Kabat i Wu su razvili plot varijabilnost da bi merili distribuciju varijabilnih AK  Nađena 3 HV regiona. i u L i u H lancu . dužine oko 10AK.

okvirne sekvence.complementarity determining regions) HV regioni su AK regioni koji ostvaruju kontakt sa epitopom i u prostoru formiraju površinu koja je komplementarna trodimenzionalnoj strukturi antigena  Regioni između HV regiona koji čine ostatak V domena pokazuju manju varijabilnost (eng.Varijabilni i hipervarijabilni regioni Ig  HV regioni = CDR (engl. postoje 4 u svakom V domenu) . framework.

Serin se pojavio 41 put. tj.15 varijabilnost . 4/0.65. učestalost 41/63=0.Definicija varijabilnosti  Odnos broja različitih AK na datoj poziciji u odnosu na učestalost najčešće AK na toj poziciji se definiše kao VARIJABILNOST  Primer: sekvencirano je 63 L lanaca i četiri različite AK su nađene na poziciji 7.65=6. Otuda.

Plot varijabilnosti .

Plot varijabilnosti CDR Petlje .

jedan ili više CDR mogu biti van regiona kontakta sa antigenom •Neke AK okvirnog regiona takođe mogu formirati kontakt sa Ag . Višestruki kontakti sa Ag-om.Vezivanje antitela za antigen (globularni protein) •Sa globularnim proteinom. kontakt se ostvaruje duž velike ravne površine. Najjači kontakt je sa CDR3 •Prilikom vezivanja nekih antigena.

Antigeni variraju u veličini i kompleksnosti Protein: Influenza haemagglutinin Hapten: 5-(para-nitrofenil fosonat)pentanoična kiselina .

Antitela reaguju sa antigenima na različite načine Hapten se umeće u džep antitela Antigen reaguje sa izduženom površinom antitela .

IgA2) kod miševa: IgG izotip je podeljen u IgG1. ali svaka klasa ima jedinstvenu strukturu H lanca  Postoji pet klasa: IgA. IgG2a. IgA ima 2 subklase (IgA1.Konstantni (C) regioni Ig  C regioni L i H lanca sastavljeni su od C domena  Na osnovu razlika u strukturi C regiona H lanaca antitela se mogu podeliti u različite klase (izotipove) i subklase  Sličnosti u AK sekvenci. IgD. IgE. IgG i IgM  Kod čoveka:IgG ima 4 subklase (IgG1 do IgG4). IgG2b i IgG3 .

05 U tragovima 2 3 . trimer monomer Nema IgE IgD Nema Nema 0.5 5 6 pentamer monomer.5 23 monomer IgM IgA Nema IgA1. 2 1. dimer.Klase humanih antitela Klasa Ig Subklase Koncentracija u serumu (mg/ml) Poluživot u serumu (dani) Sekretorna forma IgG IgG 1-4 13.5 3.

IgG4  Imaju oko 90% homologije u AK sekvenci  Razlikuju se u broju i rasporedu interlančanih disulfidnih veza  Ovo dovodi do razlika u funkcionalnim osobinama subklasa . IgG3.IgG subklase  IgG1. IgG2.

IgG subklase .

Cg2 i Cg3 u IgG).) U svakom izotipu. m.Teški lanci Ig  Teški lanci se obeležavaju grčkim slovima koja odgovaraju imenu klase: g. e. Cg1. a. CH2 i td.  Različite klase ili subklase antitela ostvaruju različite efektorske funkcije. IgM. IgA i IgD klase imaju 3 C domena  Ovi domeni su označeni kao CH domeni Numerišu se počev od N. d (za IgG. .do C.terminalnog kraja lanca (npr. IgA. IgD)  H lanci IgM i IgE klase imaju 4 C domena H lanci IgG. IgE. ovi regioni se mogu označiti još specifičnije (npr. CH1.

Laki lanci Ig  Postoje dva tipa lakih lanaca. ali nikada po jedan od svakog  Odnos kapa / lambda lanci kod ljudi: 2:1 kod miševa: 20:1 . označenih kao k i l  Razlikuju se po AK sekvenci konstantnih (C) domena  Molekul antitela ima ili dva k lanca ili dva l lanca.

d i a lanci imaju AK sekvencu (60 do 100 AK) između CH1 i CH2 domena koja nije homologna sa ostalim domenima  Obezbeđuje fleksibilnost IgG.Zglobni region Ig  g. IgD i IgA molekula  Bogat u cisteinu i prolinu  Ostaci cisteina formiraju interlančane disulfidne veze koje drže dva H lanca zajedno  Ig M i IgE nemaju zglobni region .

proučavao rezultujuće polipeptidne lance Edelman and Porter Nobel-ova nagrada 1972.Struktura antitela  Porter i Nisonoff su koristili enzime da razgrade Ig. proučavali funkciju izolovanih fragmenata  Edelman je tretirao Ig redukujućim agensima koji razgrađuju S-S veze. za njihova otkrića koja se odnose na strukturu antitela .

Fragmentacija Ig Fab fragment vezuje antigen Fc fragment kristališe .

Da bi dobili antitela protiv imunoglobulina neophodno je da imunoglobulini koji se koriste prilikom imunizacije u celini ili delom budu prepoznati kao strani • Ako se imunizuje životinja jedne vrste imunoglobulinima druge vrste. ALOTIPSKE i IDIOTIPSKE determinante . produkovana antitela su specifična za epitope (AK sekvence) koji su prisutni u konstantnim regionima L i H lanaca IZOTIPSKE deteminante • Kada se jedna životinja imunizuje imunoglobulinima dobijenim iz druge životinje iste vrste. produkovana antitela usmerena su na tzv.Antigenske determinante (epitopi) Ig • Molekuli antitela su proteini i stoga mogu biti imunogeni.

klase lakih lanaca i imunoglobulini različitih životinjskih vrsta. a na osnovu specifičnosti za odgovarajući antigen. idios=svoj. drugi) su epitopi (alotopi) u C regionima lakih i teških lanaca *Na osnovu alotipske specifičnosti razlikuju se imunoglobulini jedinki u okviru iste vrste.Antigenske determinante (epitopi) Ig • Izotipske determinante (grč. te su alotipovi genetski markeri jedinki. • Idiotipske determinante (grč. *Idiotipska specifičnost razlikuje molekule imunoglobulina u okviru istog izotipa i istog alotipa. isos=jednak. • Alotipske determinante (grč. *Na osnovu izotipske specifičnosti razlikuje se pet klasa humanih imunoglobulina. isti) su epitopi prisutni u C regionima lakih i teških lanaca. vlastiti) su epitopi (idiotopi) smešteni u hipervarijabilnim regionima. allos=drugačiji. . potklase.

2 različita alotipa) k lanac (Km.Alotipovi Ig  Kod čoveka alotipovi su okarakterisani za: sve četiri IgG subklase (Gm markeri. influenze tipa B . 3 različita alotipa)  Koriste ih forenzičari  Alotipovi pružaju biološku prednost na neke infektivne agense tj. preko 25 različitih alotipa) jednu IgA subklasu (za IgA2 . Km (1) alotip je efikasniji od drugih Km alotipova kapa lanaca u odbrani od H. imaju efekat u infekciji Npr. Am markeri.

g3 .Sekretorna i membranska forma Ig  Razlikuju se u AK sekvenci karboksi-terminalnog kraja C regiona H lanaca.3 AK)  Membranska forma Transmembranski region od hidrofobnih AK i citoplazmatski domen koji se značajno razlikuje između različitih izotipova .  Sekretorna forma Ima hidrofilne AK u karboksi-terminalnom kraju (“rep”) Dužina repa se razlikuje među različitim klasama (m lanac .21 AK.

citoplazmatski deo H lanca je kratak.Citoplazmatski deo samo od 3 AK .ima 3 AK *Kod membranskih IgM (slika) i IgD molekula. samo 3AK. * Kod membranskih IgG (slika) i IgE molekula nešto je duži.ima 21 AK Citoplazmatski deo je od 28 AK . do 30 AK .

i svi membranski Ig su monomerni.  IgM i IgA mogu formirati polimere Ovi polimeri se formiraju interakcijom između repnih delova. IgD. m lanac ima dugi “rep” (21 AK) koji je uključen u formiranje pentamera. .  Polimerni IgM i IgA molekuli takođe sadrže dodatni polipeptidni lanac (137 AK.Monomerni i polimerni Ig  IgG. 15 kDa) označen kao J lanac (eng. IgE. joining chain)  J lanac je disulfidno vezan za “repove” i stabilizuje multimerni kompleks.

Monomerni i polimerni Ig .

 Kovalentno vezivanje pomoću disulfidnih veza i glikozilacija takođe se odvijaju u ER. vezujući protein).Sinteza Ig  Laki i teški lanci Ig se sintetišu u ER  Savijanje i asocijacija lanaca je kontrolisana proteinima iz ER koji se nazivaju čaperoni (kalneksin i BiP. gde se vezuju za membranu ili bivaju sekretovana procesom egzocitoze.  Posle formiranja. eng. gde se mogu modifikovati ugljeni hidrati. . molekuli Ig se oslobađaju čaperona i usmeravaju u Goldži kompleks.  Zatim se antitela usmeravaju ka plazma membrani.

Funkcije antitela   Vezivanje antigena (posredovano Fab fragmentom) Efektorske funkcije (posredovane Fc fragmentom) .

Vezivanje antitela za antigen: nekovalentne veze Elektrostatičke sile Vodonične veze Van der Waal’s veze Hidrofobne veze privlačenje između suprotnih naelektrisanja H između elektronegativnih atoma Fluktuacije u elektronskim oblacima oko molekula suprotno polarizuju susedne atome Hidrofobne grupe se približavaju i isključuju vodu (uključuju Van der Waal’s veze) .

koja ukazuje na koncentraciju antigena koja je neophodna da bi antigen-vezujuća mesta polovine svih molekula antitela prisutnih u rastvoru bila zauzeta.• Afinitet: Jačina veze između jednog antigen-vezujućeg mesta antitela i epitopa antigena Afinitet se uobičajeno predstavlja konstantnom disocijacije (Kd). Mala Kd ukazuje na visoko-afinitetne interakcije • Avidnost: Ukupna jačina vezivanja između viševalentnog antitela i multivalentnog antigena .

.

tj. pri čemu svako antitelo ima različitu specifičnost. imaju istu antigensku determinantu (unakrsna reakcija). možda i do 109.Strukturne karakteristike antitela vezane za prepoznavanje antigena • Specifičnost Nekada antitela produkovana protiv jednog antigena mogu da se vežu za drugi antigen koji je strukturno (hemijski) srodan prvom antigenu. • Raznolikost Svaka individua pravi neverovatno veliki broj strukturno različitih antitela. • Afinitet i avidnost *Sazrevanje afiniteta .

Zašto antitelima treba Fc region? F(ab)2 fragment može • • Detektovati Ag Precipitirati Ag • • Neutralisati Ag tj. blokirati aktivna mesta toksina ili patogena Blokirati interakciju između domaćina i patogena ali ne može aktivirati • • Inflamatorne i efektorske funkcije vezane za ćelije Inflamatorne i efektorske funkcije komplementa .

ANTIGENI • • Antigen . antigenost .makromolekuli koji izazivaju imunski odgovor • Hapten . Vezivanjem za nosač postaju imunogena. Imunogenost.bilo koji molekul koji se vezuje za At ili TĆR Imunogen.obično jedinjenja male MM. Nemaju sposobnost da izazovu imunski odgovor. ali se vezuju za At.

prisustvo aromatičnih AK) • Osetljivost na preradu i prezentaciju (polimeri D-AK su slabi imunogeni jer se ne prerađuju u APĆ) • Oblik unošenja • Put unošenja antigena i doza • Genetski faktori (Ir geni=MHC geni). kopolimeri.polisaharid izolovan iz kapsule pneumokoka imunogen je za čoveka i miša. npr. a nije imunogen za kunića .Uslovi imunogenosti • Stranost • Relativna molekulska masa • Hemijska složenost (homopolimeri.

sličan klasi I MHC. mogu biti imunogeni. tako su dobijena antitela za prednizon. Za ćelijski-posredovan imunitet. ali nije kodiran MHC genima) . najbolji imunogeni. glikoproteini) .Polisaharidi. ukoliko nisu u kompleksu sa proteinima ili polisaharidima za stimulaciju B ćelijskog imunskog odgovora lipidi se koriste kao hapteni. Prirodni antigeni -Proteini. vitamin E itd.Lipidi i nukleinske kiseline generalno nisu imunogeni. gd+T Ly i NK-T Ly) prepoznaju lipide u sklopu CD1 (nepolimorfan. bez obzira da li su sami ili su u kompleksu sa drugim jedinjenjima (lipoproteini . HCG.Prirodni i veštački antigeni A. neki T limfociti (npr. leukotriene. imunogeni su proteini i neki lipidi i glikolipidi (npr. mogu biti u kompleksu sa proteinima i lipidima .

Najviše su proučavani antigeni eritrocita. limfocita i bakterija. . ugljenih hidrata i lipida.Ćelijski antigeni (antigeni membrane. organela i jedra) i tkivni antigeni Najčešće kompleksi proteina. citozola.

sintetski polipeptidi su uglavnom polimeri lizina.kao nosač najčešće se koristi protein ili ćelija .homopolimeri i kopolimeri. tirozina i alanina *postoji mogućnost da se sintetišu najimunogeniji antigeni mikroorganizama ili njihovi epitopi i da se koriste kao vakcine • Konjugovani antigeni (hapten+nosač) .sastav haptena mora biti poznat . Veštački antigeni • Sintetski antigeni .B.u celini proizvedeni u laboratoriji . glutaminske kiseline.Vezivanje za nosač može biti in vitro i in vivo (vezivanje lekova za proteine u organizmu može dovesti do alergijskih reakcija) .

uglavnom ugljeni hidrati i nukleinske kiseline.globularni proteini nisu multivalentni. epitopi su peptidni fragmenti vezani za MHC molekule Polivalentni (multivalentni) antigeni .ANTIGENSKE DETERMINANTE (EPITOPI) • • • Antigenske determinante su delovi makromolekularnih antigena za koje se vezuju antitela U slučaju proteinskih antigena koje prepoznaju T limfociti. ukoliko nisu u agregatima .imaju identične epitope koji se ponavljaju . i površine ćelija .

koje funkcionišu na maloj udaljenosti. Za jaku vezu. peptidi i hapteni) se smeštaju u džep Ag-vezujućeg mesta • Globularni proteini reaguju sa antigenom na drugačiji način: At ostvaruju kontakt sa ovakvim antigenima duž velike ravne površine .B ćelijski epitopi • At se vezuje za epitop slabim NEKOVALENTNIM interakcijama. Ag-vezujuće mesto i epitop moraju imati komplementarne oblike koji omogućavaju da grupe koje reaguju budu blizu jedna drugoj • Mali ligandi (kao što su mali oligonukleotidi.

B ćelijski epitopi Na nativnom proteinu generalno se sastoje od hidrofilnih AK na površini proteina koje su topografski pristupačne membranski vezanim ili slobodnim At - . i mogu funkcionisati kao B ćelijski epitopi tek kada se protein denaturiše .AK sekvence koje su sakrivene u unutrašnjosti proteina često se sastoje od pretežno hidrofobnih AK.

B ćelijski epitopi • Nepreklapajuće determinante .prostorno su odvojene.blizu jedna drugoj. pa vezivanje At za jednu determinantu može sterički ometati vezivanje At za drugu determinantu . pa se dva ili više molekula At može vezati za jedan antigen • Preklapajuće determinante .

epitopi koji nastaju promenom kovalentne strukture proteina (npr. putem fosforilacije ili proteolize) . kontinualne) determinante epitopi formirani od susednih AK rezidua. ali su prostorno približene uvijanjem molekula proteina Sekvencijalne i nesekvencijalne determinante generalno se ponašaju drugačije kada je protein denaturisan ! • Neoantigenske determinante .B ćelijski epitopi mogu sadržavati sekvencijalne ili nesekvencijalne AK • Linearne (sekvencijalne. približno 6 AK • Konformacione (nesekvencijalne) determinante formiraju se od AK rezidua koje su udaljene u primarnoj AK sekvenci.

.

god. a ne denaturisani. 1980. prepoznaju samo linearne determinante (a ne konformacione. a takvi peptidi ne mogu formirati konformacione determinante) .god: 1o imunizacija sa nativnim proteinom: samo nativni protein. može izazvati 2o humoralni i.: postalo je jasno da T Ly ne prepoznaju nativni protein. Suprotno. i nativni i denaturisani protein mogu izazvati 2o ćelijski i. nalaze se “unutar” proteinskog molekula • T limfociti su specifični za AK sekvencu peptida tj.o. jer se za žleb MHC molekula mogu vezati samo peptidi u linearnoj konformaciji. već protein prerađen do peptida • Većina T limfocita prepoznaje samo peptide vezane za APĆ u sklopu MHC molekula što znači da T ćelijski imuni odgovor izazivaju samo proteinski antigeni (jer se jedino peptidi vezuju za MHC) • Epitopi koje prepoznaju T Ly su često “unutrašnji” tj.T ćelijski epitopi 1959.o.

Timus (T) .zavisni antigeni  Proteini  Prepoznaju ih i T i B limfociti  T i B limfociti prepoznaju različite epitope proteinskog antigena .

Pored toga mnogi polisaharidi aktiviraju komplement alternativnim putem (stvara se C3d koji se vezuje za Ag i obezbeđuje drugi signal za aktivaciju B limfocita) . lipidi i nukleinske kiseline  Aktiviraju B limfocite i stimulišu produkciju At u odsustvu T limfocita  Ne mogu da se prerađuju i prezentuju u sklopu MHC molekula  Većina T-nezavisnih antigena su polivalentni mogu izazvati maksimalno povezivanje tj.Timus (T)-nezavisni antigeni  Neproteinski antigeni: polisaharidi. što dovodi do aktivacije B Ly u odsustvu T Ly. grupisanje IgR na B Ly.

afinitetno sazrevanje i sekundarni imunski odgovor (memorijske B ćelije) . afinitetno sazrevanje i sekundarni imunski odgovor (memorijske B ćelije) Karakteristike humoralnog imunskog odgovora na T-nezavisne antigene Ne postoji : switch (promena) izotipa.Humoralni imunski odgovor na proteinske (T-zavisne) i neproteinske (T-nezavisne) antigene se razlikuje ! Karakteristike humoralnog imunskog odgovora na T-zavisne antigene Postoji : switch (promena) izotipa.

. osobe sa urođenim ili stečenim deficijencijama humoralnog imuniteta su posebno osetljive na infekcije izazvane pneumokokom. meningokokom i Haemophilus-om  Prirodna antitela u cirkulaciji zdravih osoba su antitela na Tnezavisne antigene (polisaharide).Praktični značaj T. pa je humoralni imunitet glavni mehanizam odbrane protiv infekcija izazvanih ovim bakterijama.nezavisnih antigena:  Mnogi polisaharidi ćelijskog zida bakterija pripadaju ovoj grupi antigena. Ova antitela su niskoafinitetna (primer: antitela na A i B glikolipidne antigene krvnih grupa).  Zbog toga.

2.IMUNOGENOST PROTEINSKIH ANTIGENA Ako se na primer neka osoba imunizuje multideterminantnim proteinskim antigenom. Ekspresija određenih alela II klase MHC u nekoj osobi određuje sposobnost te osobe da odgovori na pojedine antigene. obično su T limfociti koji odgovaraju na takav antigen specifični za jednu ili nekoliko linearnih AK sekvenci. Imunogenost proteinskih antigena određena je MHC molekulima: 1. Ovi epitopi se nazivaju IMUNODOMINANTNI epitopi ili determinante. ovo je uslovljeno time što se različiti aleli II klase razlikuju u svojoj sposobnosti da vežu različite antigenske peptide i zbog toga stimulišu specifične Th ćelije. . Kao što je poznato. Imunodominantni epitopi su najverovatnije oni koji se najbolje vezuju (sa najvećim afinitetom) za MHC molekule.