Professional Documents
Culture Documents
SLOBODA N RADULOVI]
Prvo izdanje
ELI T MEDICA
Izdava~ ELIT MEDICA Simina 9a, Beograd, Tel/fax: 011/ 2185-340 e-mail: elitmed @ sezampro.yu Direktor Milu tin Gavrilovi} Urednik Dr Milena Gavrilovi} Lektor i korektor Zora Tvrtkovi} Priprema za {tampu Zo ra Tvrtkovi} Tira` 500 primeraka [tampa ,,Grafolib ISBN 978-8 86-7 7222-0 073-5 5
SLOBODAN R. RADULOVI]
ELIT MEDICA
RECENZENTI: Prof.dr Radmilo Jovanovi} Prof.dr Ratomir Ganovi} Prof.dr Tomislav \oki}
O d l u k o m N a u ~ n o -n nastavnog ve}a Unuverziteta u Pri{tini br.513 od 14. 04. 2005.god. ova knjiga je odobrena kao ud`benik za specijalisti~ku, subspecijalisti~ku i poslediplomsk u nastavu humane reprodukcije.
SARADNICI
BOJANA SAVI]EVI], dr sci {ef embriolo{ke laboratorije Specijalne ginekoloske bolnice za le~enje steriliteta, Beograd MARKO BABI], dr sci profesor Stomatolo{kog fakulteta u Beogradu Katedra za biologiju SLAVI[A STANI[I], dr sci profesor ginekologije Medicinskog fakulteta u Pri{tini MIROSLAV OPRI], dr sci profesor patologije KBC "Be`anijska kosa" Beograd
IZ R E C E N Z I J E Knjiga ASISTIRANA REPRODUKTIVNA TEHNOLOGIJA U HUMANOJ REPRODUKCIJI predstavlja monumentalno delo, rekao bih enciklopedijsko, iz domena humane reprodukcije. Iako se naslovom vezuje najvi{e za asistiranu reproduktivnu tehnologiju, ono je znatno vi{e i znatno {ire od toga. U knjizi se nalaze sakupljeni podaci iz oblasti reprodukcije ~oveka koji poti~u iz vremena Starog veka, pa se ona prati sve do dana{njih dana. Najzna~ajniji deo knjige, koji je po mi{ljenju recenzenta prvi put kompletno, potpuno i savremeno obra|en u na{oj literaturi, odnosi se na mesto reproduktivne tehnologije u humanoj reprodukciji. Kako se i sam autor ovim metodama dugo godina bavi, jedan od prvih u na{oj zemlji, on je sa posebnom stru~nom ozbiljno{}u, kao veliki znalac, rekao bih, ~ak, sa posebnom ljubavlju pristupio obradi ovog zna~ajnog problema, ne samo za ginekologiju, nego i za dru{tvo, i za dr`avu u celini. Uradio je to na najbolji na~in i osvetlio je i prikazao metode koje danas postoje. Kako i sam primenjuje sve ove metode, on je bez te{ko}a ovu materiju pribli`io svim lekarima koji se bave le~enjem steriliteta, ali i svim drugim, koji se za reprodukciju interesuju. Recenzent Prof. dr Radmilo Jovanovi} Predsednik Akademije medicinskih nauka Srpskog lekarskog dru{tva
VI
PREDGOVOR
Knjiga "Asistirana reproduktivna tehnologija u humanoj reprodukciji" pojavljuje se kao rezultat dugogodi{njeg bavljenja tematikom i problematikom plodnosti i ra|anja, i to, u vreme kada se u na{oj medicinskoj literaturi, namenjenoj edukaciji medicinskih stru~njaka, ose}ala velika potreba za jednom knjigom takvog obima i sadr`aja u kojoj bi obiman materijal iz ove oblasti bio sistematizovan i stru~no - nau~no izlo`en. Prate}i veoma slo`ena zbivanja na nivou organa, tkiva, }elije, pre svega, spermatozoida i jajne }elije, knjiga zadire u domen molekularne biologije, gde se prikazuje stvaranje, razvoj i funkcija reproduktivnih ~inilaca bez ~ega se ne mo`e zamisliti razumevanje nastanka novog bi}a homo sapiens-a. Ova knjiga izlazi u trenutku kada u na{oj zemlji, kao i u mnogim drugim dolazi do opadanja broja novoro|ene dece, vi{e osoba umre nego {to se rodi. Depopulacija je problem ne samo `ene, porodice i njihovog bliskog okru`enja, ve} i zna~ajan, ~ini nam se najva`niji dru{tveni, ali i dr`avni problem. U Srbiji se godi{nje ra|a oko 65 000 dece, a umire oko 90 000 lica. Ovaj podatak zabrinjava i sugeri{e neizvesnu budu}nost i opstanak srpskog naroda. Ovo je okvir u koji treba smestiti ovu knjigu, koja nudi ne samo informacije, znanja i predloge, nego ukazuje i put kojim treba usmeriti dalji rad. Danas je preko 15% brakova infertilno. To je podatak koji zabrinjava. Ako medicina uspe da taj procenat smanji, u~ini}e mnogo u borbi protiv depopulacije. Prvi deo knjige posve}en je istorijatu neplodnosti. Predstavljena su prva saznanja iz domena reprodukcije ~oveka. Ovaj problem je interesovao i najzna~anije predstavnike iz stare Gr~ke i starog Rima. Lekari starog Egipta su shvatili da neplodnost mo`e da se pojavi i kod mu{karaca i kod `ena. Prepoznali su ulogu mu{kog ejakulata u nastajanju trudno}e. Treba pomenuti Soranosa iz Efesa koji je bio vode}i ginekolog svog vremena. Radio je u Rimu i pisao je o porodiljstvu i bolestima `ena. Lekari ranog Srednjeg veka su se, tako|e, bavili ginekologijom i aku{erstvom, kao Abu Bakr i Avicenna, koji je autor kanona iz domena medicine, ginekologije i aku{erstva. Smatrao je da neplodnost mo`e nastati i zbog problema psihi~kog porekla `ene ili mu{karca. Tu navodi strah, melanholiju i zabrinutost, {to se i danas uzima u obzir kada se razmatraju uzroci neplodnosti. De Graf (1672. god.) je prvi opisao testise, jajnike i folikule, a Leeuwenhoek je 1694. godine otkrio spermatozoide u semenu mu{karca. Pri tome je koristio mikroskop, koji je sam konstruisao i izradio. VII
Razmatraju}i razvoj medicinske nauke posve}ene neplodnosti ukratko su predstavljeni radovi i dostignu}a velikog broja autora: Spallanzani-ja, Hunter-a, Von Baer-a, Sims-a, G. Mendel-a, O. Hertwig-a, H. Fol-a, R. Dickinson-a, Spemann-a, W. Sutton-a, W. Johannsen-a, G. Pinkus-a, O. Avery-a, J. Rock-a, J. Watson-a, F. Crick-a, pa sve do Roberta Edwards-a, embriologa koji je u~estvovao u stvaranju prve bebe iz programa vantelesne oplodnje, zajedno sa Patrick-om Steptoe-m, {to je rezultiralo ra|anjem Louise Brown 1978. godine. O daljem razvoju IVF - in vitro fertilizacije, kao i mnogim modifikacijama te osnovne metode bi}e re~i u ~etvrtom delu ove knjige. U delu o humanoj reprodukciji obra|ena je anatomija reproduktivnih organa sa posebnim osvrtom na reprodukciju }elije i organizma, i u okviru toga, gametogeneza, oogeneza, oocit, folikulogeneza, spermatogeneza, spajanje gameta, oplodnja, ovulacija, kao i transport oplo|ene jajne }elije, sa opisom hormonskih balansa u toku menstrualnog ciklusa, posebno u vreme ovulacije. Pa`nja se posve}uje stvaranju zigota i formiranju embriona, implantaciji sa detaljnim opisom embrionalnog razvoja budu}eg ploda. U tre}em delu o sterilitetu obra|uju se svi danas poznati uzroci bra~ne neplodnosti. Kod `ene se navode klasi~ni, ve} dugo poznati etiolo{ki faktori, kao {to su anomalije genitalnih organa, posebno uterusa, koji mogu da poremete, pa ~ak, i onemogu}e reproduktivnu funkciju, zatim miomi materice, endometrioza, infekcije bakterijske i virusne, sindrom policisti~nih ovarijuma, anovulacija, hiperprolaktinemija, hiperandrogenizam, ali i drugi endokrini poreme}aji kao {to su dijabetes melitus, poreme}aj funkcije tireoidne `lezde, poreme}aj na nivou imunoglobulina. Posebno su obra|eni stres, gojaznost i psihosomatski poreme}aj kao etiolo{ki faktor neplodnosti `ene. Uzroci neplodnosti kod mu{karca dele se prema mestu nastajanja na pretestikularne poreme}aje, testikularne i posttestikularne uzroke. Posebno se izu~avaju infekcije kod mu{karca, ali i hroni~ne intoksikacije kao {to su pu{enje, alkoholizam i narkomanija. Dijagnostika steriliteta je naredno poglavlje u ovom delu knjige. Primenjuje se i kod mu{karca i kod `ene. Postupci su klasi~ni i dobro poznati, moraju da budu kompleksno primenjeni, jer se ~esto otkrivaju udru`eni etiolo{ki faktori steriliteta. Pominju se metode: HSG-a, laparoskopija, testovi ovulacije, primena UZ dijagnostike u otkrivanju poreme}aja u funkciji ovarijuma i u otkrivanju anomalija i tumora na materici. Posebno mesto u dijagnostici ima otkrivanje infekcije kod oba partnera. U zadnjem delu ovog poglavlja obra|eno je ispitivanje spermatogeneze, spermograma, kao i mogu}nost mu{karca za optimalni seksualni zivot. Terapija steriliteta zavisi od faktora koji su do njega doveli. Treba odstraniti negativne uticaje koji onemogu}avaju koncepciju i razvoj oplo|ene jajne }elije. Terapija je hirur{ka, medikamentozna. Sve ove metode su obra|ene u svetlu dana{njih savremenih saznanja i savremenih mogu}nosti le~enja: mikrohirurgije, laserske operativne metode, primene hormona i drugi terapijski postupci. ^etvrti deo - Asistirana reproduktivna tehnologija obuhvata prikaz svih savremenih postupaka, koji su bitno pobolj{ali rezultate le~enja neplodnosti. VIII
U knjizi se ukazuje i na sve ~e{}e kori{}enje metode transfera embriona u stadijumu blastociste, a posebno se ukazuje na mogu}nosti preimplantacionih genetskih ispitivanja, {to bitno smanjuje incidencu ra|anja plodova sa hromozomskim aberacijama. Obra|ena je i krioprezervacija spermatozoida, oocita, embriona i ovarijalnog tkiva. U knjizi se tretira problem starenja i `ivotnog doba partnera u odnosu na mogu}nosti primene asistirane reproduktivne tehnologije. Pri tome se ukazuje na metode koje se sve vi{e koriste kao {to je donacija gameta i kori{}enje surogat majke. Poglavlje u ~etvrtom delu knjige se odnosi na komplikacije u programu asistirane reproduktivne tehnologije. O svim komplikacijama se otvoreno i op{irno govori. Na vlastitom materijalu u vremenu od 2000. do 2005. godine analiziraju se otkrivene hromozomske aberacije u 0,83% slu~ajeva, u odnosu na op{tu populaciju, gde je aberacija bilo 0,10%. Zna~ajno poglavlje ovog dela knjige je pregled rezultata asistirane reprodukcije u okviru parametara visokog kvaliteta ESHRE. Poseban odeljak knjige je posve}en prostoru, opremi, za{titi i uslovima rada laboratorije za primenu asistirane reproduktivne tehnologije. Svi propisani uslovi u laboratoriji moraju biti do detalja ispunjeni da bi se mogao ostvariti o~ekivani uspeh. Selektivnoj redukciji fetusa kod nastale plurifetalne trudno}e posve}ena je u knjizi posebna pa`nja. Obra|ena su nova saznanja o stem }elijama, koje }e imati sve ve}i zna~aj u re{avanju posebnih oblika neplodnosti. Na kraju ~etvrtog dela knjige obra|en je eti~ki pristup programu asistirane reproduktivne tehnologije. Izra`avam svoju duboku zahvalnost saradnicima koji su zajedno sa glavnim urednikom ulo`ili maksimum truda, znanja, sopstvenog iskustva u postizanju vidnih rezultata u ovoj zna~ajnoj oblasti ~ovekovog `ivota. Po Hipokratu, "svaka bolest ima fizi~ki i racionalni razlog, a telo se mora tretirati kao celina". [irenje lekarske pomo}i kroz razvoj medicine kao nauke, sve vi{e uliva nadu i optimizam neplodnim `enama, i mu{karcima, da lek i lekarska pomo} postoji, a stru~nim poslenicima omogu}ava sticanje novih saznanja, u ~emu se o~ituje pun doprinos svih autora u stvaranju ovog dela. Svoju zahvalnost dugujem eminentnim recenzentima, ~iji su saveti zna~ajno uticali pobolj{anju kvaliteta knjige. I na samom kraju, posebno se zahvaljujem izdava~koj ku}i Elit - Medica, koja je ulo`ila dosta rada i sredstava, kako bi ova knjiga, na obostrano zadovoljstvo, ugledala svetlo dana.
IX
SADR@AJ
DEO I
ISTORIJAT ..................................................................................................... 3
DEO II
HUMANA REPRODUKCIJA ................................................................... 21
A. REPRODUKCIJA ]ELIJE ........................................................................... 21 B. REPRODUKCIJA ORGANIZMA ................................................................ 23 1. GAMETOGENEZA ........................................................................................... 23 1.1. Oogeneza .................................................................................................24 1.1.1. M i t o z a ............................................................................................... 24 1.1.2. M e j o z a ...............................................................................................26 1.1.3. H r o m o z o m i u t o k u m e j o t i ~ k e d e o b e ...............................................30 1.1.4. K o m p e t e n t n o s t i s a z r e v a n j e o o c i t a ................................................. 34 1.1.5. A p o p t o z a } e l i j a o v a r i j u m a .............................................................. 41 1.2. Folikulogeneza .......................................................................................42 1.3. Interakcije oocit - granuloza .................................................................. 44 1.4. Spermatogeneza ..................................................................................... 56 2. SPAJANJE GAMETA - OPLODNJA ................................................................... 57 2.1 . Ovulacija ............................................................................................... 58 2.2. Transport oocita .................................................................................... 59 2.3. Cervikalni kanal u vreme ovulacije ...................................................... 60 2.4. Promene na spermatozoidu u toku oplodnje ........................................ 61 2.5. Formiranje ovuma ................................................................................. 64 2.6. Formiranje zigota ................................................................................... 64 2.7. Formiranje embriona ............................................................................. 66 2.8. Spontani hatching ................................................................................. 67 2.9. Migracija embriona kroz tubu .............................................................. 68 2.10. Genomski imprinting ............................................................................ 68 3. IMPLANTACIJA ........................................................................................... 77 3.1. Molekularni aspekti implantacije ......................................................... 86 4. EMBRIONALNI RAZVOJ ................................................................................ 89
XI
DEO III
STERILITET ................................................................................................. 93
1. POREME]AJI @ENSKE PLODNOSTI .................................................... 94 1.1. Miomi i sterilitet .................................................................................... 95 1.2. Endometrioza i sterilitet ......................................................................... 97 1.3. Infekcije kod `ene i njihov zna~aj u sterilitetu ......................................100 1.4. Gojaznost, poreme}aji ishrane i sterilitet ..............................................112 1.5. PCO- policisti~ni ovarijumi i PCOS - policisti~ni ovarijalni sindrom .....119 1.6. Disfunkcija lutealne faze i sterilitet ......................................................126 1.7. Tiroidna `lezda i neplodnost .................................................................127 1.8. Zna~aj hiperprolaktinemije kod neplodnih `ena ....................................128 1.9. Imunoglobulini, njihova funkcija i sterilitet .........................................129 1.10. Stres i sterilitet ...................................................................................... 132 1.11. Psihosomatski aspekti steriliteta ............................................................133 2. POREME[AJI MU[KE PLODNOSTI .....................................................135 2.1. Pretestikularni uzroci ............................................................................136 2.2. Testikularni uzroci ................................................................................140 2.3. Posttestikularni uzroci ...........................................................................145 2.4. Infekcije kod mu{karca i njihov zna~aj za sterilitet .............................146 3. DIJAGNOSTIKA STERILITETA ............................................................150 3.1. Dijagnostika steriliteta kod `ene ...........................................................150 3.1.1. Trodimenzionalna transvagina lna sonografija u reproduktivnoj medicini ........150 3.1.2. Histerosalpingografija .........................................................................154 3.1.3 3. Laparoskopija .....................................................................................155 3.1.4. Histeroskopija .................................................................................... 161 3.1.5. Sonohisterosalpingografija ..................................................................162 3.2. Analiza ejakulata .................................................................................. 162 3.3. Pregledi oba partnera ............................................................................167 3.3 3.1 . Molekularno biolo{ka dijagnostika .....................................................167 3.4. EBM - evidenciono bazirana medicina .................................................167 4. TERAPIJA STERILITETA .......................................................................168 4.1. Operativna terapija ...............................................................................168 4.2. Alternativne i fizikalne metode le~enja ................................................173
DEO IV
ASISTIRANA REPRODUKTIVNA TEHNOLOGIJA
1. IN VITRO FERTILIZACIJA .............................................................................177 1.1. Stimulacija folikulogeneze ...................................................................178
XII
1.2. Endometrijum u stimulisanom ciklusu ..................................................182 1.3. Punkcija i aspiracija folikula i kompentencija oocita ...........................186 1.4. Identifikacija oocita ...............................................................................187 1.5. Priprema sperme ....................................................................................188 1.6. Fertilizacija ............................................................................................197 1.7. Procena embriona i fragmentacija .........................................................198 1.8. Asistirani hatching .................................................................................203 1.9. Preimplantaciona genetska dijagnostika ................................................205 1. 10. Embriotransfer ........................................................................................210 1.11. Luteal support ........................................................................................ 211 2. ARTEFICIJALNA INSEMINACIJA ....................................................................213 3. ICSI - INTRA CITOPLASMATIC SPERM INJECTION ........................................216 4. TESE - TESTICULAR SPERM EXTRACTION .....................................................224 5. IVM - IN VITRO MATURATIO .........................................................................226 6. GENETIKA MUSKE NEPLODNOSTI, EVOLUCIJA X I Y HROMOZOMA I MOGU]NOST PRENOSA NEPLODNOSTI NA BUDU]E GENERACIJE .......................234 7. BIOHEMIJSKI PREDIKTORI ISHODA IN VITRO FERTILIZACIJE .......................251 8. KRIOPREZERVACIJA SPERMATOZOIDA ........................................................ 272 9. KRIOPREZERVACIJA OOCITA, EMBRIONA I OVARIJALNOG TKIVA ...............277 10. VITRIFIKACIJA OOCITA, EMBRIONA I OVARIJALNOG TKIVA .........................283 11. PROCES STARENJA I ASISTIRANA REPRODUKTIVNA TEHNOLOGIJA .................288 12. PROCENA OVARIJALNE REZERVE .................................................................307 13. POF - PREMATURE OVARIAN FAILURE ..........................................................311 14. DONACIJA GAMETA I EMBRIONA .................................................................. 313 15. SUROGAT MAJKA ..........................................................................................315 16. KOMPLIKACIJE PROGRAMA ASISTIRANE REPRODUKTIVNE TEHNOLOGIJE ... 317 17. OHSS - OVARIAN HYPERSTIMULATION SYNDROME ....................................318 18. HIDROSALPINKS I ASISTIRANA REPRODUKTIVNA TEHNOLOGIJA ................329 19. ELEKTIVNA REDUKCIJA FETUSA .................................................................. 331 20. U^ESTALOST HROMOZOMSKIH ABERACIJA KOD NA[IH PACIJENATA U PERIODU 2000 - 2005 GODINE ................................................332 21. STATISTI^KI PREGLED REZULTATA ASISTIRANE REPRODUKTIVNE TEHNOLOGIJE U EVROPSKIM ZEMLJAMA .........................341 22. PROFILAKSA INFEKCIJE U PROCEDURI ASISTIRANE REPRODUKTIVNE TEHNOLOGIJE ...................................................................356 23. KLINI^KA IN VITRO FERTILISATION LABORATORIJA ...................................359 24. POLSCOPE - SPINDLE VIEW IMAGING SYSTEM ............................................. 372 25. STEM ]ELIJE ..................................................................................................376 26. ETI^KI PRISTUP PROGRAMIMA ASISTIRANE REPRODUKTIVNE TEHNOLOGIJE ....382
I DEO
ISTORIJAT
ISTORIJAT
Istorija bra~ne neplodnosti po~inje u trenutku kada je ~ovek postao svestan prirodnog procesa reprodukcije i suo~io se sa problemima u vezi sa tim. Prate}i po~etke razumevanja ovog procesa kroz istoriju kao i prve korake razvoja lekarske pomo}i, idemo u korak sa razvojem medicine i civilizacije od samoga po~etka do dana{njeg dana. Plodnost i ra|anje su oduvek bile oblasti `ivota koje su zaokupljale ~ovekovo interesovanje. Prate}i kroz razli~ite periode istorije poku{aje shvatanja reprodukcije i ra|anja do dana{njeg dana, mi istovremeno u~imo, ne samo o razvoju civilizacije i tehnologije, ve} i o velikim ljudima svoga doba, vizionarima i nau~nicima, koji su nam, gledaju}i u budu}nost uz ~este individualne `rtve i nerazumevanje okoline, omogu}ili da budemo u medicinskoj nauci gde smo sada. To je isto tako i uputstvo mladim lekarima o humanosti i po`rtvovanju. Ako mi danas, posle toliko vekova, ponavljamo i verujemo Hipokratovim re~ima, pozivaju}i se na ista na~ela i ideje, u vremenu tehnolo{ke ekspanzije i neverovatnog nau~nog huka, revolucionarnih otkri}a i svakodnevnih promena u `ivotu svakog pojedinca i sveukupne nauke, shvati}emo da je to zahvaljuju}i na{im korenima iz pro{lih vekova i na{im precima koji su nam to omogu}ili. Mi koji smo danas tu, moramo isto tako da se okrenemo budu}nosti koju otvaramo svakodnevnim predanim radom i u~enjem. Lekari starog Egipta su shvatali da neplodnost mo`e da se pojavi i kod mu{karaca i kod `ena. Tako|e su prepoznali ulogu mu{kog ejakulata u trudno}i. Ve}ina njihovih lekova za neplodnost je, neznatno modifikovana, kori{}ena vekovima.
Hipokrat (460-377 p.n.e.) se smatra ocem medicine. On je verovao da svaka bolest ima fizi~ki i racionalni razlog i da telo mora da se tretira kao celina. Objavio je dela koja uklju~uju prirodu `ena i `enskih bolesti. Tretmani koji su opisani u ovim delima su brojni.
Aristotel (384-322 p.n.e.) je bio poznat po postavljanju pitanja, da li embrion oduvek postoji, ili se stvara seksualnim ~inom reprodukcije. Soranus iz Efesa (98-177 n.e.) je bio vode}i aku{er i ginekolog svog vremena. U~io je u Aleksandriji, radio u Rimu, pisao o aku{erstvu i bolestima `ena i ginekologiji. Verovao je u nau~no istra`ivanje, a ne u oslanjanje na magiju i rituale. Prvi je pisao o kontracepciji. Njegova knjiga je preporu~ivala vaginalne vunene ~epove i primenu maslinovog ulja, meda, smole kedra, aluma, smole balzamovog drveta ili belog olova radi spre~avanja prolaska sperme do uterusa. Galen (129-199) je deo svog `ivota proveo u Rimu kao lekar imperatora. On je priznat kao najbolji lekar antike posle Hipokrata. Njegove anatomske studije `ivotinja i zapa`anja o funkcionisanju ljudskog tela su dominirale medicinskom teorijom i praksom tokom 1400 godina. Posedovao je i znanja iz filozofije koja su imala veliki uticaj na njegove tretmane i medicinsku praksu.
Sl. 1.4.- Galen
I Deo: Istorijat
Abu Bakr Muhammad Bin Zakarya ArRazi, Rhazes (864-930) je bio verovatno najve}i lekar islamskog sveta u ranom srednjem veku. Bio je doktor koji je pisao i istra`ivao razne medicinske teme, uklju~uju}i i aku{erstvo. Njegovo najzna~ajnije delo je Al-Havi, medicinska knjiga koja se bavi svim znanjem o bolestima i le~enju iz njegovog vremena. Abu Ali Al-Hussain Ibn Abdallaj Ibn Sina Avicenna (981-1037) je autor al-quanun fi al-Tibb medicinskih kanona koji predstavljaju veliki rad medicinske nauke. Rad je preveo na latinski Gerard iz Kremone u XII veku. Ovaj rad je bio osnovna medicinska knjiga sve do XVII veka. Knjiga je sadr`ala vredne informacije o ginekologiji. On je shvatio da neplodnost mo`e biti mu{kog ili `enskog porekla, povezano sa abnormalno{}u semena mu{karca, ili raznih patolo{kih stanja kod `ene. Smatrao je da uzrok toga mo`e biti poreme}aj genitalnog trakta, ili psiholo{ki problemi, melanholija, strah, pa je prepisivao brojne lekove inspirisane egipatskim. 1512. godina: Lekari srednjeg veka su neplodnost, uglavnom, posmatrali kao kaznu od Boga zbog nepo{tovanja bra~nog zaveta, ili u`ivanja u seksu. Seks je po njima slu`io razmno`avanju, a ne u`ivanju. 1512. godina: Arnaud de Villeneuve je napisao Le tresor des pauvres qui parle des maladies qui peuvent venir au corps humain, gde je prepisao tehniku koju su prvo koristili stari Egip}ani. Identifikovao je nekoliko razloga neplodnosti. Tvrdio je da je gojaznost, jer salo gu{i ljudsko seme, jedan od razloga neplodnosti.
Sl. 1.7.- Arnaud de Villeneuve
1543. godina: Andreas Vesalius je objavio atlas Humani Corporis Fabrica, gde je prikazao popre~ni presek `enske anatomije i pravilno opisivao vezu izme|u deteta i majke kroz pup~anu venu.
1552. godina: Bartolomeo Eustachio, Vesalius-ov u~enik je opisao uterus i njegove sudove.
1651. godina: Villiam Harvey, anatom i lekar, je izneo novu teoriju, slede}i Aristotela, prema kojoj se specijalizovane strukture pojedinca razvijaju korak po korak iz nespecijalizovanih prete~a u jajetu, ali koje ljudi moraju da reprodukuju kroz spajanje jajeta i sperme. Ovo je bilo poznato kao teorija epigeneze. Sumirao je svoje istra`ivanje kao ex ovo omnia (sve poti~e iz jajeta). Ovo otkri}e se pojavilo 200 godina pre nego {to je otkrivena jajna }elija sisara, ali Harvey-eva teorija je bila toliko dobro promi{ljena da je ~itav svet pretpostavio da je on u pravu mnogo pre nego {to je do{lo do stvarnog otkri}a.
I Deo: Istorijat
1672. godina: Regnier de Graaf (De Mullerium Organis, 1672) je prou~avao anatomiju mu{kih genitalija pravilno opisuju}i testise. U isto vreme je opisao jajnik i folikularnu funkciju.
Jedina njegova gre{ka u ovom predstavljanju je ta {to je pogre{no interpretirao folikul kao jaje.
1677. godina: Anton von Leeuwenhoek je prona{ao mikroskop. Kada je njegov student doneo uzorak, otkrio je spermatozoide.
1694. godina: Niklas Hartsoeker (16561725) je nacrtao spermatozoid koji je otkrio Fon Leuvenhek. Hartsoeker je, me|utim, izjavio da su spermatozoidi sadr`avali ve} formiran embrion.
1707. godina: Martin Nabot je objavio raspravu o neplodnosti De Sterilitate, u kojoj je tvrdio da ovarijalna skleroza i blokada tuba mogu biti uzroci neplodnosti.
1751. godina: Pierre Louis Moreau de Maupertius (1698-1759) je napisao Systeme de la nature koji je sadr`avao teorijsku raspravu o prirodi biparentalnog nasledstva zasnovanu na njegovoj studiji pojave polidaktilije kod nekoliko generacija jedne berlinske porodice. Pokazao je da polidaktilija mo`e da se prenese, bilo sa oca ili sa majke, i objasnio ovu naslednu crtu kao rezultat mutacije u naslednim ~esticama koje poseduju roditelji. Tako je pru`io prvi nau~ni zapis prenosa dominantnih naslednih osobina kod ljudi. 1759. godina: Nema~ki anatom Kaspar Friedrich Wolff je prou~avao razvoj pili}a i izvestio je da organi poti~u od nepromenljivog materijala.
Osnovni potencijal i organizaciona struktura organizma su odre|eni genetskom konstitucijom oplo|enog jajeta.
1769. godina: Giovanni Battista Morgagni u Izvori{tu i uzroku bolesti, identifikuje razli~ite razloge neplodnosti, uklju~uju}i folikularno odsustvo, ageneziju, abnormalnosti vagine ili spoljnih genitalnih organa i aplaziju uterusa.
Sl. 1.18.- Giovanni Battista Morgagni
I Deo: Istorijat
1780. godina: Italijanski sve{tenik i nau~nik, Lazzaro Spallanzani (1729-1700) je razvio tehnike ve{ta~ke inseminacije pasa. Identifikovao je proces reprodukcije kod `ivotinja. On je, tako|e, bio prvi koji je istra`ivao uticaje niske temperature na ljudsku spermu.
1785. godina: Prve poku{aje humane inseminacije obavio je John Hunter (17281793), {kotski hirurg. Rezultat je bio ro|enje deteta iste te godine. Kod londonskog trgovca ode}om, koji je patio od hipospadije, Hunter je predlo`io da prikupljenu spermu injektuje u vaginu njegove `ene, pomo}u {prica. 1827. godina: Karl Ernst von Baer je prvi pokazao jajnu }eliju sisara. ]elije sperme je smatrao za entozoe, tj. parazite i nazvao ih je spermatozoidima. 1840. godina: Martin Barry (18021855) je objavio rad u kome je utvrdio da spermatozoid ulazi u jajnu }eliju. 1866. godina: Marion Sims (18131883), opisan kao jedan od o~eva ameri~ke ginekologije, je objavio klini~ke bele{ke hirurgije materice sa posebnim osvrtom na sterilitet. U ovom radu Sims je objasnio da neplodnost i dismenoreja imaju zajedni~ko poreklo, cerviksnu stenozu, pa je preporu~io da sterilitet treba tretirati bu`iranjem cerviksa. Smatrao je da lo{a pozicija materice doprinosi neplodnosti i preporu~io je manualni tretman. Sims je obavio 55 inseminacija kod 6 `ena sa abnormalnim cerviksima i kod jedne je do{lo do trudno}e.
10
Nizak stepen uspe{nosti je bio rezultat ~injenice da je spermu njihovih mu`eva bez kontrole smatrao normalnom, a inseminacije nisu obavljene u optimalnom trenutku ovulacije.
1886. godina: Gregor Mendel objavljuje Teoriju nasle|ivanja gde navodi da su fizi~ke karakteristike pod kontrolom naslednih faktora datih u paru. Ti faktori se tokom stvaranja gameta razdvajaju i slobodno kombinuju sa naslednim faktorima drugog roditelja, daju}i potomstvo koje li~i na roditelje. 1875. godina: Oscar Hertwig je zaklju~io nakon ispitivanja reprodukcije morskog je`a da se oplodnja, i kod `ivotinja i kod biljaka, sastoji od fizi~kog ujedinjenja dva nukleusa koje obezbe|uju mu{ki i `enski roditelj.
1877. godina: Herman Fol (1845-1892) je posmatrao kako spermatozoid morske zvezde ulazi u jajnu }eliju. Mogao je da vidi transfer netaknutog nukleusa spermatozoida u jajnu }eliju gde je postao mu{ki pronukleus, o ~emu je objavio rad. 1884. godina: William Pancoast (18151883) je obavio prvi potvr|eni slu~aj terapeutske inseminacije donorskom spermom. 1890. godina: Robert Latou Dickinson je po~eo da eksperimenti{e sa donorskom spermom, mada je njegov rad, uglavnom, obavljan u tajnosti. Napisao je brojne radove o reproduktivnom sistemu i tehnikama pora|anja, uklju~uju}i Podizanje i manipulisanje matericom kroz abdominalni zid radi kontrole postpartalnog krvarenja 1899. godine.
I Deo: Istorijat
11
Walter Heape (1855-1928) je bio prvi koji je izvukao preimplantacioni embrion zeca i prebacio ga u surogat majku u kojoj je nastavljen normalni razvoj. Smatra se pionirom reproduktivne tehnologije. Njegov rad Preliminarna bele{ka o transplantaciji i rastu jajne }elije sisara u materici surogat majke je ohrabrio druge da ispitaju mogu}nosti uzgajanja embriona u laboratoriji. 1901. godina: Hans Spemann (18691941) je podelio dvo}elijski embrion na dva dela, uspe{no stvaraju}i dve larve. Kasnije, 1938. godine Spemann je teoretisao da `ivotinje mogu da se kloniraju spajanjem }elije embriona sa jajnom }elijom. 1902. godina: Hromozomalna teorija nasle|ivanja je objavljena od strane Walter Sutton-a (1877-1916), zasnovana na zapa`anjima da tokom mejoze svaki spermatozoid ili jajna }elija prima po jedan hromozom svakog tipa. 1906. godina: Objavljen je termin genetika.
Sl.1.28.- Walter Sutton
1909. godina: Danski botani~ar Wilhelm Ludwig Johannsen (1857-1927) je prvi upotrebio re~ gen da opi{e Mendelian-ovu jedinicu nasle|ivanja. Gen je nastao od gr~ke re~i koja ozna~ava ro|enje. 1937. godina: Ideja in vitro oplodnje tj. IVF - in vitro fertilisation je predlo`ena u uvodnom ~lanku Za~e}e u staklenoj posudi u medicinskom `urnalu Nove Engleske. 1938. godina: Uspe{no zamrznuta sperma.
12
1939. godina: Gregory Goodwin Pincus (1903-1967) je bio prvi koji je objavio kako oociti raznih `ivotinja prolaze kroz fazu sazrevanja u in vitro uslovima. Poku{ao je da isto uradi sa ljudskim oocitima uz predvi|anje da }e sazrevanje trajati 12 ~asova. Njegov rad Jajne }elije sisara je objavljen 1936. godine. 1941. godina: Termin genetski in`enjering je iskovan od strane danskih mikrobiologa.
1943. godina: Oswald Avery (18771955) demonstrira da hemijsku prirodu gena ~ini DNK molekul.
1944. godina: Harvardski istra`iva~ John Rock (1890-1984) je oplodio ~etiri ljudska oocita u laboratorijskoj posudi. Iako embrioni nikada nisu bili vra}eni u matericu, ovaj eksperiment je bio prva in vitro oplodnja u istoriji.
1949. godina: Linus Pauling (19011994) pokazuje da je srpasta anemija nasledno oboljenje koje nastaje mutacijom na genu koji kontroli{e sintezu hemoglobina. Otkri}em iz 1957.god. ispostavilo se da zamena samo jednog nukleotida u genu dovodi do zamene jedne amino kiseline u polipeptidnom lancu, ~ime se zna~ajno naru{ava izgled eritrocita i transportna funkcija hemoglobina. 1951. godina: Otkrivena je kontraceptivna pilula.
I Deo: Istorijat
13
1953. godina: Objavljen je izve{taj od strane Raymond G. Bunge (1908-1998) i Jerome K. Sherman-a sa detaljima prve ~etiri uspe{ne trudno}e nakon upotrebe zamrznutih spermatozoida koji su ~uvani u suvom ledu na -80C, zamrznutih uz pomo} glicerola kao krioprotektanta.
Struktura DNK - deoksiribonukleinske kiseline, kao dvostruke spirale, je otkrivena od strane James Watson-a (1928- ), Francis Crick (1916-2004) i Rosalind Franklin (1920-1958). Watson i Crick su dobili Nobelovu nagradu 1962. godine.
Sl. 1.35.- Prvi model DNK deoksiribonukleinske kiseline Sl. 1.38.- Rosalind Franklin
14
1955. godina: Joe Hin Tjio (1916-2001) otkriva da postoji 23 para ljudskih hromozoma {to se smatra po~etkom moderne humane citogenetike. 1959. godina: Jerome Lejeune (19261944), francuski lekar i geneti~ar, otkriva da kod Down-ovog sindroma u somatskim }elijama postoji jedan hromozom vi{e. Kasnije je na|eno da je u pitanju vi{ak hromozoma 21. 1964. godina: Jerome K. Sherman je izvestio o prvim trudno}ama koje su rezultat upotrebe sperme koja je zamrznuta u te~nom azotu na - 196C, umesto u suvom ledu. 1966. godina: Ljudski oociti su prikupljeni laparotomijom. Utvr|eno je da je {ifra za sintezu proteina, geneti~ki kod, sadr`ana u tripletima azotnih baza i da su razli~ite kombinacije samo ~etiri azotne baze u tripletima odgovorne za razli~it redosled amnokiselina svih proteina. 1969. godina: Enzim je po prvi put sintetizovan in vitro. Robert Edwards (1926- ), engleski embriolog koji }e u~estvovati u stvaranju prve bebe iz epruvete, objavljuje ~lanak o arteficijalnoj oplodnji humanih jajnih }elija. 1972. godina: Napravljeni prvi snimci `enske karlice pomo}u ultrazvuka, ~ime se pomoglo u identifikaciji morfologije materice i jajnika. 1973. godina: Prva IVF - in vitro fertilisation trudno}a na svetu objavljena u Australiji, ali se okon~ala ranom smr}u embriona. 1978. godina: Louise Brown, prva beba iz epruvete, je ro|ena u Engleskoj. To je bio 104. poku{aj doktora Patrick-a Steptoe-a (1913-1988) i embriologa Robert-a Edwards-a.
I Deo: Istorijat
15
1980. godina: Prvi me|unarodni sastanak o IVF - in vitro fertilisation, odr`an u Nema~koj. 1982. godina: Planiraju se prvi eksperimenti sa transferom ljudskih gena u kojima se nova DNK - deoksiribonukleinska kiselina inkorporira u genom }elije jednog organizma. Namenjeni kao terapija za le~enje bolesti, novi geni se ubacuju u somatske }elije pacijenata. Prva odobrena procedura genske terapije se desila osam godina kasnije, 1990. godine, na detetu sa te{kom kombinovanom imunolo{kom deficijencijom. Formira se prva Gen banka, sa bazom podataka genske sekvence koja je javno dostupna nau~nicima. 1983. godina: Ostvarenje prve trudno}e koja je rezultat doniranja oocita. Sperma mu{kog partnera bra~nog para le~enog od steriliteta je uba~ena u cerviks `enskog donora jajne }elije. Kada je do{lo do oplodnje, embrion je transferiran u matericu `enskog partnera. Dve trudno}e su rezultovale iz pet transfera embriona. Tako|e je obavljen prvi uspe{an transfer ljudske sperme i oocita u falopijeve tube radi oplodnje GIFT - gamete intrafallopian transfer. Tretirane su ~etiri `ene, a dve su zatrudnele. Jedna je pobacila, a jedna iznela trudno}u. Razvijen je prvi genetski test za Huntington-ovu bolest. Ovo je bilo prvo nasledno oboljenje koje je mapirano. Utvr|eno je da se mutirani gen, odgovoran za nastanak ove bolesti, nalazi na ~etvrtom hromozomu. Gen je izolovan 10 godina kasnije. Lucinda L. Veeck je objavila ro|enje prve bebe nakon IVM in vitro maturation sa stimulisanim ciklusom. 1984. godina: Ostvarena prva trudno}a kao rezultat upotrebe zamrznutog embriona
u bolnici Queen Victoria u Melburnu od strane Alan-a Trounson i Linda-e Mohr. Ime bebe je Zoe Leyland.
1985. godina: U Australiji ro|eni prvi IVF - in vitro fertilisation blizanci iz zamrznutih embriona. 1986. godina: Na sastanku ESHRE european society for human reproduction and embryology koji je odr`an u Briselu, predsedavaju}i Jean Cohen je rekao: Govor stvaralaca beba iz epruveta je neobi~na me{avina etike i embriologije, politike i tehnologije. Evropski lekari se sada trude da se dogovore o svemu ovome, jer su ubrzani strahom od pojave zakonske regulative. Zapo~eto je zamrzavanje humanih jajnih }elija radi oplodnje. Blizanci, de~ak i devoj~ica, su ro|eni kao rezultat upotrebe zamrznutih jajnih }elija u Adelaidi, u Australiji. Proces je prvi izveo Dr Christopher Chen u Flinders medical centre. Ameri~ka Administracija za hranu i lekove odobrava prvu humanu vakcinu dobijenu genetskim in`enjeringom za spre~avanje hepatitisa B.
16
1987. godina: Predlo`en je projekat ljudskog genoma za identifikaciju svih ljudskih gena. Patentirana je procedura transfera embriona ~ime je zapo~eo trend patentiranja procesa i produkata manipulacije ljudskim tkivom me|u stru~njacima za plodnost, a kasnije i me|u geneti~arima. 1988. godina: Zabele`ena je prva trudno}a upotrebom metode SUZI - subzonalna inseminacija, tehnike putem koje se jedan spermatozoid injektuje direktno kroz zonu pelucidu. 1989. godina: Lociran genski lokus odgovoran za nastanak cisti~ne fibroze. 1991. godina: @ena stara 42 godine postaje majka, rodiv{i sopstveno unu~e. Arlette Schweizer postaje surogat majka svojoj }erci. Koreanski lekar Cha K.Y. objavljuje ro|enje prve IVM in vitro maturation bebe iz nestimulisanog ciklusa. William French Anderson (1936- ) po~inje sa prvim eksperimentima transfera ljudskih somatskih gena koje ubacuje u }elije osobe sa genetskim oboljenjem.
1996. godina: Barnes F.L. 1996. godine je utvrdio da je razvojna kompetentnost in vitro sazrelih humanih oocita niska zbog gubitka normalnih mehanizama folikularne kontrole koji reguli{u ovu etapu razvoja. 1997. godina: Ro|eno je prvo dete upotrebom nove procedure asistirane reprodukcije, citoplazmatskog transfera, na Institutu za reproduktivnu medicinu i nauku Medicinskog centra Saint Barnabas u Njujorku. Kod citoplazmatskog transfera se citoplazma donorske jajne }elije ubacuje u jajnu }eliju `ene recipijenta. Po{to citoplazma ima mitohondrijsku DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu, pokazalo se da rezultuju}i embrion nosi genetski materijal spematozoida i obe `ene. Citoplazmatski transfer je prvi korak u genetskoj manipulaciji. Bobbi McCaughey postaje prva majka sedmorki koje su rezultat procedura tretmana neplodnosti. 1998. godina: Na Univerzitetu u Wisconsin-u se izoluje i uzgaja embrionalna stem }elija. 1999. godina: Istra`iva~i sa Sismer odeljenja za reprodukciju u Bolonji su otkrili na~in pregleda aneuploidnih embriona pomo}u tehnike koja se zove FISH fluorescence in situ hybridization. Ova tehnika omogu}ava genetsku analizu iz jedne }elije koja se izvla~i iz embriona i ozna~ava po~etak PGS - preimplantation genetic screening-a. Odre|ena je kompletna sekvenca ljudskog hromozoma 22. Istra`iva~i u Seulu su uspeli u kloniranju ljudske }elije kod infertilne `ene stvaraju}i ~etvoro}elijski embrion, ali je eksperiment zaustavljen zbog eti~kih i pravnih okolnosti. 2000. godina: Ro|en je Adam Nash kao prva beba ro|ena nakon genetskog skrininga.
I Deo: Istorijat
17
Njegovi roditelji su obavili ovu proceduru radi stvaranja brata spasioca za njihovu }erku koja je imala Fanconi-jevu anemiju, retku krvnu bolest koja nastaje kao rezultat defektnog mehanizma popravke DNK. Beba je za~eta u epruveti, a potom je PGS -preimplantation genetic screening tehnikom od nekoliko embriona izabran embrion koji je najvi{e odgovarao i omogu}io da beba bude donor stem }elija iz pup~ane vrpce za svoju bolesnu sestru. 2001. godina: Doktori Univerziteta u Bolonji su predstavili nove tehnike zamrzavanja koje }e pobolj{ati stepen oplodnje zamrznutih jajnih }elija.
Objavljen je prvi nacrt ljudskog genoma koji sadr`i oko 30 000 gena. Avigen Inc dobija odobrenje od nacionalnih zdravstvenih instituta da sprovede probu genskog transfera radi ubacivanja korektivnog gena u pacijente sa hemofilijom B, uprkos mogu}nosti da gen mo`e u}i u polne }elije. U Engleskoj se zabranjuje implantiranje kloniranih embriona u matericu. 2003. godina: Projekat ljudskog genoma je kompletiran. ^itava sekvenca ljudskog genoma je de{ifrovana, i to, dve godine pre roka.
II DEO
HUMANA REPRODUKCIJA
HUMANA REPRODUKCIJA
A. REPRODUKCIJA ]ELIJE
Kontinuitet odr`anja `ive materije i njeno {irenje u prostoru sa preno{enjem genetskih informacija sa roditelja na potomstvo, predstavlja reprodukciju. Reprodukcija je prisutna u svakoj }eliji. Mitotskom deobom reprodukuju se }elije vi{e}elijskih organizama, a spajanjem gameta, osnovnih reproduktivnih jedinica, dolazi do razvi}a novog organizma. Interfaza u kojoj }elija provede dve tre}ine svoga `ivotnog ciklusa, predstavlja period izme|u nastanka }elije i njene ponovne deobe. Za to vreme }elija metaboli~ki aktivno prolazi kroz tri stadijuma. Stadijum G 1: vr{i se transkripcija gena, sinteza RNK sa delova DNK, i kasnija sinteza proteina neophodnih za normalan metabolizam }elije, Stadijum S: sinteza DNK replikacija, Stadijum G 2: vr{i se sinteza proteina uklju~enih u strukturu hromozoma, kao i sinteza proteina koji ulaze u sastav deobnog vretena. Mitoza ili deoba }elije predstavlja drugi osnovni proces `ivota }elije. Sastoji se iz ~etiri faze: profaze, metafaze, anafaze i telofaze. Profaza: Po~etak mitoze u profazi je definisan spiralizacijom i skra}enjem hromozoma kao i formiranjem deobnog vretena koje u~estvuje u povla~enju hromatida hromozoma ka polovima }elije.
22
Metafaza: Formira se ekvatorijalna, metafazna plo~a. Anafaza: Razdvajaju se hromatide i kre}u prema polovima. Telofaza: Izdu`ivanje deobnog vretena i dolazak hromatida na suprotne polove
}elije. Dolazi do despiralizacije hromozoma, podele citoplazme i }elijskih organela, i formira se deobna brazda. Opisani `ivotni ciklus }elije traje oko 16 do 20 ~asova u interfazi i oko jednog ~asa u fazi mitoze.
23
B. REPRODUKCIJA ORGANIZMA
1. GAMETOGENEZA
Humani reproduktivni proces prolazi kroz dva stadijuma. Gametogeneza je prvi stadijum u kome se iz germinativnih }elija stvaraju visoko diferencirane polne }elije, gameti, koji predstavljaju reproduktivne jedinice. Spajanje gameta je drugi stadijum. Od dve razli~ite jedinke, spajanjem njihovih polnih }elija, gameta, omogu}ava se reprodukcija organizma i geneti~ka raznovrsnost. Gametogeneza je prvi stadijum reproduktivnog procesa kada iz nediferencirane germinativne }elije nastaje visoko diferencirana polna }elija, gamet. Formiranje `enskih polnih }elija naziva se oogeneza, a mu{kih spermatogeneza. Sastoji se iz tri faze: faze razmno`avanja, faze rasta i faze sazrevanja.
24
1.1. OOGENEZA
Oogeneza je proces formiranja `enskih polnih }elija u jajnicima kada oogonije nastale od primordijalnih germinativnih }elija dosti`u stadijum primarnih oocita u toku sedmog lunarnog meseca, pre ro|enja koji zaustavljen u svom razvoju u profazi prve mejoti~ke deobe ostaje tako u neaktivnom jajniku kao {to se vidi na datoj slici. Nastavak procesa zapo~inje pubertetom, sazrevanjem folikula, kada se posle prve mejoti~ke deobe formira haploidan sekundarni oocit ostaju}i u stadijumu metafaze do momenta oplodnje.
1.1.1. Mitoza
Proces oogeneze se de{ava u ovarijumima po~ev od tre}e nedelje nakon fertilizacije kada primordijalne germinativne }elije migriraju ameboidnim kretanjem od epitela `uman~ane kese preko vezivnog tkiva do genitalne brazde pri ~emu se brzo razmno`avaju. Genitalna brazda je formirana izme|u sredine ~etvrte i pete nedelje gestacije u vidu ~vori}a mezenhima koje prekriva epitel. Oko sedme nedelje gestacije, }elije koje poti~u od mezonefrosa i epitela migriraju ka unutra{njoj strani genitalne brazde formiraju}i primitivnu medularnu vrpcu i seksualnu vrpcu.
25
Faza razmno`avanja
Primitivna vrpca je kolonizovana primordijalnim germinativnim }elijama iz kojih se mitoti~kom deobom stvaraju oogonije, stem }elije. To je prva faza gametogeneze, faza razmno`avanja. Oogonije su u ovoj fazi jo{ uvek me|usobno povezane intercelularnim vezama. Primitivna medularna vrpca degeneri{e da bi bila zamenjena jako vaskularizovanom ovarijalnom stromom. ]elije vrpce proliferi{u, a mezenhimalne }elije se kondenzuju, formiraju}i individualne primordijalne folikule. Formacije primordijalnih folikula nalazimo u unutra{njem delu ovarijuma blizu rete ovarii izme|u 16. i 18. nedelje fetalnog `ivota. Mezenhimalne }elije sekretuju spolja{nju bazalnu membranu, a od njih }e pote}i i granulozne }elije rastu}eg folikula. Primordijalni folikuli su locirani u slabo vaskularizovanom sloju debljine oko 2mm ispod tunice albugine. Poznato je da su folikuli, uklju~uju}i razvoj od primordijalnih do primarnih, nezavisni od gonadotropina i njihov rast je regulisan intraovarijalnim faktorima.
Faza rasta
U drugoj fazi gametogeneze, fazi rasta, oogonije rastu zbog akumulacije hranljivih materija, vitelusa, diferenciraju}i se u primarne oocite sa repliciranom DNK. Hromozomi primarnih oocita sastavljeni su iz dve hromatide i svaka hromatida sadr`i identi~ni DNK molekul. U trenutku poro|aja primarni oociti su okru`eni jednim tankim slojem folikularnih epitelnih }elija koje predstavljaju primordijalni folikul.
folikul. Tokom perioda rasta op{ti nivo metilacije DNK se pove}ava, sa razvojem folikula od preantralnih etapa do pune zrelosti {to za posledicu ima inhibiciju genske aktivnosti. U proces metilacije uklju~ene su razli~ite forme enzima Dnmtdeoxyribonukleik ACID methyltransferase, koje su aktivne u razli~itim stadijumima oogeneze, a tako|e i kasnije tokom embriogeneze. Tokom postnatalnog rasta oocita registruje se sinteza tri proteina koji u~estvuju u metilaciji DNK, metiltransferaze iz familije Dnmt 3, forme Dnmt 3a, Dnmt 3b i Dnmt 31. Zapa`eno je da je nivo ekspresije gena koji kontroli{e sintezu Dnmt 31 vi{i od nivoa ekspresije gena za druge dve forme, ali je tako|e utvr|eno da forma Dnmt 31 sama ne poseduje kataliti~ka svojstva ve} svoju funkciju ostvaruje formiranjem kompleksa sa formama Dnmt 3a ili Dnmt 3b. DNK metiltransferaze iz familije 3, prisutne su kod oba pola i mutacije na nekim od gena koji kontroli{u sintezu ovih enzima izazivaju poreme}aje u procesima spermatogeneze i embriogeneze. Tako mutacija na genu za Dnmt 31 koja je dominantne prirode, ispoljava se u heterozigotnom stanju, kod mu{karaca izaziva sterilnost, po{to je zbog prisustva mutiranog Dnmt 31 proteina onemogu}eno sazrevanje spermatozoida. Kod `ena mutirani Dnmt 31 protein nema uticaja na normalan rast oocita i njegovu oplodnju, ali je letalan za embrion zbog ~injenice da je metilacija DNK embrionalnih }elija zna~ajno smanjena. Pored DNK metiltransferaza iz familije 3, u proces metilacije DNK uklju~ene su i forme Dnmt 1 i Dnmt 10. Obe forme nastaju kao rezultat prepisivanja istog gena, razli~itom obradom istog primarnog transkripta, tzv. alternativnim splajsingom. Dok je forma Dnmt 1 aktivna u ranijim stadijumima oogeneze, forma Dnmt 10
26
prisutna je kod rastu}ih oocita u citoplazmi i germinalnom vezikulu, kod zrelih oocita u citoplazmi, kao i kod preimplantacionih embriona. Dominantno prisustvo Dnmt 10 u kasnijim stadijumima oogeneze mo`e se objasniti ~injenicom da je transkript gena sa koga }e se translatovati Dnmt 10, zrela iRNK, znatno stabilniji od i-RNK koja }e se translatovati u enzim Dnmt 1. Iako se translacija DNK metiltransferaze 10 odvija u ranoj fazi razvoja oocita, aktivnost ovog enzima ostaje o~uvana i kod embrionalnih }elija. Ovaj podatak ukazuje na zna~aj koji Dnmt 10 metiltransferaza ima u blokiranju aktivnosti gena, kako tokom oogeneze tako i tokom rasta embriona. Uprkos rastu}oj metilaciji tokom rasta oocita, odre|eni delovi genoma ostaju nemetilisani. Primer epigenetskog delovanja, aktiviranje specifi~nih gena u odre|eno vreme, potkrepljuje eksperiment u kome su analizirani embrioni dobijeni partenogenezom putem transfera nukleusa oocita iz razli~itih etapa razvoja folikula. Na osnovu rezultata ovog eksperimenta utvr|eno je da se transkripcija gena: Snrpn- small nuclear ribonucleoprotein polypeptide n, Znf 127zinc finger, i Ndn - nectin encoding, de{ava u ranom razvoju folikula u periodu prelaska primordijalnog u primarni folikul. Geni kao {to su Peg 3 - paternally expressed, i Igf 2r - insulin like growth factor, prepisuju se kod sekundarnog folikula. Prepisivanje nekih gena odvija se i u kasnijim fazama razvoja folikula, sve do antralne faze, Peg 1- paternally expressed, a postoje i geni ~ija je aktivnost specifi~na samo za fazu antralnog folikula. Do ranog antralnog perioda delovi genoma ozna~eni kao diferencijalno metilisane regije DMR - differentially methylated DNK, skoro su u potpunosti metilisani. Izuzetak predstavlja gen Peg1 - paternally
expressed, ~ija aktivnost biva blokirana metilacijom kod zrelih oocita. Na osnovu svega izlo`enog mo`e se uo~iti da proces selektivnog blokiranja genoma putem metilacije DNK traje do stadijuma zrelog folikula koji je spreman da ovulira. Kod razli~itih tehnika asistirane reprodukcije u kojima se sazrevanje oocita i folikula arteficijalno stimuli{e, od posebnog je zna~aja uzimanje u obzir kompleksnog biolo{kog programa oocita koji podrazumeva vremenski preciznu aktivaciju i inhibiciju genoma {to kasnije predstavlja klju~ za normalno odvijanje procesa oogeneze, oplo|enja i embriogeneze.
1.1.2. Mejoza
Prva mejoti~ka deoba
Faza sazrevanja
U tre}oj fazi gametogeneze, fazi sazrevanja, dolazi do dve deobe i taj proces nosi naziv mejoza. Prva mejoti~ka deoba je redukciona, jer od jedne }elije sa diploidnim brojem hromozoma nastaju dve }erke }elije sa dvostruko manjim brojem hromozoma, haploidni broj. Prva profaza mejoti~ke deobe je podeljena u pet podfaza:
leptonema - hromozomi postaju vidljivi; zigonema - homologi hromozomi se sparuju - sinapsis, formiraju se bivalenti; pahinema - uo~avaju se hromatide sparenih homologih hromozoma, tetrade. Razmenjuju se geni izme|u nesestrinskih hromatida homologih hromozoma - rekombinacija ili krosingover; diplonema - dolazi do razdvajanja sinapti~kog kompleksa, homologi hromo-
27
zomi ostaju vezani samo na hijazmama. Nastavlja se geneti~ka razmena izme|u nesestrinskih hromatida homologih hromozoma, naj~e{}e izme|u dve unutra{nje ili spolja{nje; dijakineza - i{~ezava jedrova membrana, dolazi do pomeranja hijazmi ka krajevima hromozoma, tzv. terminalizacija hijazmi. Profaza prve mejoti~ke deobe, kao duga neaktivna faza, traje od ro|enja, tokom de~ijeg doba do reproduktivnog doba kada se nastavlja zapo~eti proces. Pod uticajem hormona, gonadotropina i estrogena, jednom mese~no u samo jednom od jajnika desi}e se sazrevanje dominantnog folikula. Prva mejoti~ka deoba zavr{ava se nastankom dve haploidne }elije, oocitom II i prvim polarnim telom i ovaj proces predstavlja ovulaciju. Hromozomi su dekondenzovani, odnosno despiralizovani i
spakovani unutar nukleusa poznatog kao germinativni vezikul. Maksimum od oko 7 miliona primordijalnih folikula nalazi se u korteksu ovarijuma u 20-toj nedelji graviditeta. Nakon poro|aja broj se smanjuje na oko 1 do 2 miliona. Tokom detinjstva jajnik ostaje endokrinolo{ki neaktivan i broj folikula i dalje opada. Procenjeno je da na po~etku puberteta preostaje najvi{e 250 hiljada folikula na svakom ovarijumu. U jajniku folikul ima dve opcije, mo`e nestati atrezijom ili biti regrutovan u "pool" rastu}ih folikula. Dok atrezija predstavlja sigurnu smrt, sudbina rastu}eg folikula je tek malo bolja. Kona~no, tokom svakog menstrualnog ciklusa samo jedan folikul pre`ivi ovaj proces dosti`u}i punu zrelost. Ovulira pribli`no 400 oocita, od oko po~etnih 7 miliona. Na kraju dolazi do menopauze.
Sl. 2.7 - Primarni oocit u De Grafovom folikulu: 1.Theca interna i externa, 2. bazalna membrana, 3. granuloza, 4. De Grafov folikul, 5. primarni oocit, 6. cumulus oophorus, 7. ovarijalno tkivo, 8. tunica albuginea ovarijuma, 9. peritonealna {upljina, 10. zona pellucida, 11. jedro u podfazi dijakinezis profaze prve mejoti~ke deobe, 12. granulozne }elije, 13. zavr{etak granuloznih }elija, 14. mikrovile
28
Po zavr{etku profaze prve mejoti~ke deobe spareni homologi hromozomi, jedan poreklom od oca, drugi od majke, postavljaju se u ekvatorijalnu ravan i obrazuje se segmentaciono vreteno, metafaza prve mejoti~ke deobe. Pozicija sparenih homologih hromozoma odredi}e geneti~ku specifi~nost gameta, jer od nje zavisi koje }e kombinacije maj~inskih i o~evih hromozoma krenuti ka jednom od polova. S obzirom da primarni oocit sadr`i 23 para homologih hromozoma broj mogu}ih razdvajanja, a samim tim i broj razli~itih kombinacija o~evih i maj~inskih hromozoma u gametima iznosi 223. Treba ista}i da geneti~koj raznovrsnosti gameta doprinosi i razmena gena izme|u homologih hromozoma, crossing-over ili rekombinacija, koja se desila u profazi prve mejoti~ke deobe. U anafazi prve mejoti~ke deobe homologi hromozomi se razdvajaju i kre}u ka suprotnim polovima segmentacionog vretena. Svaki hromozom sastoji se iz dve hromatide, tzv. dijade, a svaka hromatida sadr`i jedan molekul DNK. Telofazu prve mejoti~ke deobe karak-
teri{e dolazak celih hromozoma, dijada, na jedan od polova. Formiraju se nova jedra budu}ih }elija sa haploidnim brojem hromozoma, 23 hromozoma. Promene koje se de{avaju na primarnom oocitu pra}ene su promenama i na folikulu. Granulozne }elije se povla~e sa zonom pelucidom {to omogu}ava formiranje perivitelinskog prostora u koji se osloba|a polarno telo na zavr{etku prve mejoti~ke deobe. Podelom primarnog oocita nosioca diploidnog broja hromozoma, redukcionom deobom formira se sekundarni oocit u kome ostaje skoro sva citoplazma sa haploidnim jedrom i primarna polocita sa malo citoplazme i haploidnim jedrom. Promene kumulusnih }elija koje postaju rastresite omogu}avaju odvajanje jednog njihovog dela zajedno sa oocitom koji slobodno pliva u folikularnoj te~nosti pred po~etak rupture. Ovulacija predstavlja zavr{etak prve mejoti~ke deobe kada dolazi do prskanja tercijarnog folikula i osloba|anja sekundarnog oocita i primarnog polocita, ili prvog polarnog tela, u jajovod.
Sl. 2.8 - Zavr{etak prve mejoze i nastanak sekundarnog oocita: 1. zona pellucida, 2. perivitelinski prostor, 3. deobno vreteno u anafazi prve mejoze, 4. zavr{etak granuloznih }elija, 5. mikrovili, 6. granuloza }elije, 7. polocit
29
Sl. 2.9 - Sekundarni oocit u predrupturiraju}em folikulu: 1. peritonealna {upljina, 2. folikul, 3. kumulus (corona radiata) sa oocitom, 4. rastresiti kumulus, 5. sekundarni oocit, 6. corona radiata, 7. ovarijalno tkivo
veoma malom koli~inom citoplazme, sekundarna polocita. Ootida predstavlja reproduktivnu }eliju.
Sl. 2.10.- Sekundarni oocit u drugoj metafazi: 1. deobno vreteno sa hromozomima postavljenim u ekvatorijalnu ravan, 2. deobno vreteno polarnog tela 3. perivitelinski prostor
30
Sumiraju}i proces mejoze mo`e se konstatovati da od jedne }elije sa diploidnim brojem hromozoma, primarni oocit, na kraju nastaju ~etiri }elije sa haploidnim brojem hromozoma kod kojih se koli~ina DNK ~etiri puta smanjila u odnosu na }eliju koja je u{la u mejozu.
mejoti~ke deobe. Smatra se da je za nerazdvajanje bivalenata jedan od glavnih razloga pove}ana brzina mejoti~ke rekombinacije.
Sl. 2.11- Hromozomi u metafazi druge mejoti~ke deobe snimljeni elektronskim mikroskopom
Sa pojavom IVF - in vitro fertilisation, postalo je mogu}e prou~avanje hromozoma kod neoplo|enih oocita. Abnormalnosti u broju hromozoma koje su se registrovale u metafazi II nisu predstavljale dovoljno pouzdan pokazatelj na osnovu kojih bi se predvidela u~estalost ootida sa aneuploidnim kariotipom, jer su se gre{ke u mejozi de{avale i posle ovog stadijuma. U zavisnosti od primenjene tehnike kojom je analiziran kariotip, kao i od faze mejoze u kojoj su hromozomi analizirani, u literaturi postoje veoma razli~iti procenti o u~estalostima aneuploidija kod oocita, koji se kre}e od 8,1% do 54,2%. Analiza hromozoma dobijenih pretvaranjem mejoti~kih hromozoma u mitoti~ke putem partenogene aktivacije podstaknute puromicinom pokazala je da hipohaploidnosti kod druge mejoti~ke deobe oocita nisu izazvane arteficijalno.
31
Do nedavno je postojalo verovanje da aneuploidne ootide nastaju, uglavnom, kao posledica nerazdvajanja bivalenata u prvoj mejoti~koj deobi. Me|utim, nedavne studije nagovestile su da nerazdvajanje hromatida zna~ajno doprinosi ukupnom broju gre{aka u procesu mejoze, pokazuju}i zavisnost u~estalosti gre{aka od starosne dobi majke. Da bi se stekla kompletna slika u kom momentu se de{avaju gre{ke u mejozi veoma su bitne informacije o podudarnom setu hromozoma prvog polarnog tela PB1 polar body. Naime, svaki poreme}aj u broju hromozoma sekundarnog oocita koji je nastao kao rezultat gre{ke u mejozi I mora biti pra}en odgovaraju}om aneuploidijom prvog polarnog tela. Zbog toga se analizom kariotipa PB1 indirektno dobijaju informacije o mogu}im aneuploidijama sekundarnog oocita. Novije studije su pokazale da hromozomi PB1 - polar body postaju prepoznatljivi i prebrojivi posle 2-3 ~asa u in vitro uslovima i tokom slede}ih 2 do 3 ~asa, sa degeneracijom koja sledi posle 6-7 ~asova nakon ekstruzije. Ipak, analiza kariotipa prvog polarnog tela, PB1, ~esto je veoma ote`ana zbog hromozomskog preklapanja. Kao pomo}no sredstvo u analizi kariotipa PB1 koristi se ~esto FISH - fluorescence in situ hybridization, metoda. Na osnovu FISH metode proverava se prisutnost broja hromatida za svaki konkretan hromozom. Za }elije koje nastaju na kraju mejoze I, kao {to su sekundarni oocit i prvo polarno telo, koje imaju haploidan broj hromozoma i kod kojih se svaki hromozom sastoji iz dve hromatide, broj signala, ta~aka, za odre|eni hromozom treba biti dva. Svako odstupanje od ovog broja, nedostatak jednog ili oba signala kao i vi{ak jednog ili oba signala govori o gre{ci koja se desila
tokom mejoze. Za izvo|enje FISH metode koriste se specijalne DNK probe koje fluoresciraju i koje su specifi~ne za odre|eni hromozom. Ovom metodom proverava se prisutnost hromatida hromozoma za jedan ili vi{e hromozoma, pa se ne dobija uvid o eventualnim poreme}ajima kompletnog kariotipa. U prvim analizama hromozoma kori{}ene su fluoroscentne alfa-satelit DNK, sonde za hromozome 18 i X. Svi podaci koji su dobijeni analizom hromozoma PB1 klini~ki su primenjeni tako {to su kori{}eni za predselekciju oocita, koji nemaju aneuploidnosti, kod IVF in vitro fertilisation starijih pacijenata. Iskustvo je pokazalo da su informacije o kariotipu PB1 ipak nedovoljne da bi se utvrdilo da ne postoji abnormalnost oplo|enog oocita. Precizne informacije mogu se dobiti tek kada se sa sigurno{}u utvrdi krajnji ishod druge mejoti~ke deobe, na osnovu analize kariotipa drugog polarnog tela PB2 - polar body. Sekvencijalno uklanjanje PB1 - polar body i PB2 - polar body se koristi za testiranje poreme}aja gena, PCR - polymerase chain reaction ili FISH - fluorescence in situ hybridization analizom. Biopsirani oociti se vra}aju u kulturu, posle provere postojanja deobe i obavlja se transfer u zavisnosti od genotipa oocita. Embrioni se transferi{u u implantacionom periodu. Kako se PB1 i PB2 izbacuju iz oocita tokom normalnog procesa sazrevanja, njihovo uklanjanje nema biolo{ku ulogu u razvoju embriona. Kompetentnost embriona se nije promenila nakon uklanjanja PB1. Studije koje su pratile rast i razvoj ovih embriona kroz implantacioni i postimplantacioni period kao i prate}e studije kod dece ro|ene nakon ove procedure, potvrdile su da nema {tetnih uticaja ove metode.
32
Podaci o hromozomskim abnormalnostima oocita u mejozi II dobijeni indirektno na osnovu analize kariotipa PB1 pokazali su se od velikog zna~aja. Upotrebom specifi~nih fluoroscentnih sondi za hromozome 13, 16, 18, 21 i 22, detektovan je stepen aneuploidnosti od 41,7%. Verlinsky sa saradnicima uradio je op{irnu studiju ~iji se rezultati uklapaju sa ostalim studijama iz ove oblasti. Tabelarni prikaz je slede}i:
Tabela 2-1: Pregled FISH - fluorescence in situ hybridization analize prvih polarnih tela PB1 - polar body druge metafaze
Kao {to se mo`e videti iz donje tabele ve}ina abnormalnosti druge metafaze oocita su rezultat poreme}aja broja hromatida u procentu od 63,5%.
Tabela 2-2: Tipovi hromatidnih i hromozomskih promena u prvoj mejoti~koj deobi
Tip gre{aka Dodatna hromatida Nedostaju}a hromatida Dodatni hromozom Nedostaju}i hromozom Slo`ene gre{ke Ukupno
frekvencijom od frekvencije hromozomskih gre{aka. Odnos hromatidne - hromozomske abnormalnosti je 9:1. Nema sumnje da su gre{ke prve mejoze dovele do aneuploidnosti embriona. Frekventnost nedostaju}e u odnosu na frekventnost dodatne hromatide je tri puta ve}a: 48,1% i 15,4%. Sli~na korelacija postoji i kod nedostaju}ih i dodatnih hromozoma: 5,9% i 0,5%, {to se obja{njava zadr`avanjem dodatnog hromatidnog ili hromozomskog materijala u drugoj metafazi sekundarnog oocita. Taj podatak se sla`e sa ve}om frekventno{}u trizomija nad monozomijama kod preimplantacionih i postimplantacionih embriona. Ukupno posmatrano od 2.432 promena hromozoma 387 (15,9%) su bile monozomije, a 1.313 (54%) trizomije/dizomije. Jedan broj promena kod PB1 - polar body mo`e biti svojstven tehni~kim gre{kama, kao {to je neuspeh hibridizacije. Mogu}e je da postoji i mehanizam prolaznih ta~aka u prvoj mejozi koje spre~avaju istiskivanje dodatnog hromozomnog materijala u PB1 - polar body kada se mejoti~ke gre{ke dogode tokom procesa sazrevanja oocita. Testiranja na poreme}aje druge mejoze oocita, pokazuju da i do 41,7% abnormalnih oocita mo`e biti detektovano testiranjem ishoda prve mejoti~ke deobe analizom prvog polarnog tela PB1.
Tabela 2-3: Tipovi abnormalnih oocita bazirani na FISH - fluorescence in situ hybridization analizi prvog polarnog tela PB1 i drugog polarnog tela PB2
Tipovi abnormalnih Broj oocita PB1 + PB2 965 PB1 PB2 Ukupno 1467 1077 3509
33
Kao {to se vidi u tabeli, 39,5% ispitanih oocita (965 od 2.432 oocita druge mejoze sa hromozomskim abnormalnostima) je bilo normalno posle druge mejoti~ke deobe {to je zaklju~eno iz testiranja PB2. Posle druge mejoti~ke deobe 1.077 (52,7%) oocita je postalo abnormalno. Da je testiranje bilo ograni~eno samo na PB1 polar body dobili bi pogre{ne rezultate. Da bi identifikovali sve oocite sa hromozomskim abnormalnostima morali bi ishod prve i druge mejoti~ke deobe ispitati analiziranjem prvog polarnog tela PB1 i drugog polarnog tela PB2.
Tabela 2-4: Tipovi hromozomskih abnormalnosti kod drugog polarnog tela PB2
Tipovi gre{aka Broj Dodatana hromatida 842 (dizomije) Nedostaju}a hromatida 748 (nulizomije) Slo`ene gre{ke Ukupno 452
2042 100
U tabeli je dat prikaz tipova hromozomskih abnormalnosti kod 2.042 analize drugog polarnog tela PB2 - polar body detektovanih kod 5.808 oocita FISH - fluorescence in situ hybridization tehnikom. Nije bilo razlike u u~estalosti pojave poreme}aja nedostaju}ih ili dodatnih hromatida posle druge mejotske deobe. Ukupno gledano, od 5.808 testiranih oocita 2.042 (35,2%) imalo je gre{ke druge mejoze od kojih je u 842 (41,2%) slu~aja bio pove}an broj hromatida, u 748 (36,6%) slu~ajeva smanjen broj hromatida i 452 (22,4%) slu~aja sa slo`enim gre{kama. Hromozomi 21 i 22 (20,8% i 18%) su naj~e{}e u~estvovali u mejoti~kim gre{kama.
U~estvovanje u mejoti~kim gre{kama hromozoma 13, 16 i 18 je bilo dvostruko manje (10,7%, 8,6% i 13,3%) i njihovi {abloni gre{aka nisu bili identi~ni. Gre{ke hromozoma 16 su poticale, uglavnom, iz druge mejoze, 55,9% prema 28,8% kod prve mejoze. Promene hromozoma 13 i 18 su ~e{}e poticale iz prve mejoze 47,4% i 61,8% u odnosu na drugu mejozu 36,5% i 28,5%. Ukupan broj hromozomskih gre{aka drugog polarnog tela PB2 - polar body od 35,2% gre{aka, utvr|enih kod druge mejoti~ke deobe oocita, kao i kod oocita nakon same deobe, mo`e biti obja{njen starosnim uticajima na frekventnost rekombinacije ili gre{kama u formiranju niti deobnog vretena za koje je utvr|eno da se pove}avaju sa staro{}u. Najnoviji podaci o molekularnim mehanizmima kohezije sestrinskih hromatida u mejozi, su od zna~aja za razumevanje prirode pove}anja mejoti~kih gre{aka u toku procesa starenja. Pribli`no jedna tre}ina ovih aneuploidija je predstavljena slo`enim gre{kama, {to nagove{tava da bi testiranje samo pet naj~e{}e pogo|enih hromozoma pokrilo ve}inu hromozomskih abnormalnosti oocita. Primena dodatnih hromozom-specifi~nih sondi verovatno }e rezultirati proporcionalnim porastom broja slo`enih gre{aka. Zna~aj genetskih analiza polarnog tela je veliki. Genetska dijagnoza druge mejoze oocita omogu}ava detekciju ve}ine abnormalnosti oocita. Testiranje prvog polarnog tela, PB1, bi trebalo da smanji broj aneuploidija kod embriona za dve tre}ine. S obzirom na ~injenicu da }e pribli`no jedna tre}ina ovih oocita biti aneuploidna i posle druge mejoti~ke deobe, testiranje PB1 mo`e da pove}a broj trudno}a kod pacijenata sa
34
lo{om prognozom u IVF - in vitro fertilisation, primenom ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnike oplodnje oocita kod kojih nema aneuploidije prvog polarnog tela. Treba naglasiti da je samo polovina genetskih abnormalnosti detektovana putem analize PB1 - polar body kao slo`ena gre{ka, a u cilju izbegavanja svih embriona koji su nastali iz aneuploidnih oocita, neophodno je testiranje PB1 i PB2. Kako se PB1 - polar body i PB2 - polar body u normalnom procesu sazrevanja gube, mogu}e je da se iskoriste za testiranje oocita, {to bi pomoglo u selekciji oocita i zna~ajnom pobolj{anju efikasnosti IVF - in vitro fertilisation.
diplonemi, profaze prve mejoti~ke deobe. U daljoj fazi hromozomi se podvrgavaju redukcionoj deobi do zaustavljanja u metafazi druge mejoti~ke deobe. Istovremeno sa nuklearnim - hromozomnim sazrevanjem se de{avaju i molekularne }elijske promene na nivou citoplazme. Proces sazrevanja citoplazme je neophodan za sticanje razvojne kompetentnosti. Do podsticanja nastavka druge mejoze, uz pomo} gonadotropina, LH - luteinizing hormone / HCG - human chorionic gonadotropin, koja prethodi ovulaciji, ooplazma se priprema za ovulatorne doga|aje.
Preovulatorno sazrevanje oocita se odvija unutar De Grafovog folikula kao veoma efikasan proces, jer je pri ovulaciji veliki deo oocita u odgovaraju}oj fazi mejoze sposoban za oplodnju. Razvojnu kompetentnost oocita je prakti~no nemogu}e utvrditi, ali se procenjuje da je bar 50% oocita sposobno da proizvede normalne rane embrione mada ovaj broj mo`e biti i ne{to manji kada se oplodnja i preimplantacioni razvoj odvijaju u in vitro uslovima. Kompetentnih oocita posle in vitro sazrevanja je manje sa usporavanjem ranog razvoja i zastoja u daljem razvoju embriona.
35
Kompletan razvoj oocita se odvija samo kod dominantnog folikula unutar kohorta folikula koji po~inju da se razvijaju sa svakim menstrualnim ciklusom. Iako nekompetentni oociti mogu poticati i od dominantnog folikula pretpostavlja se da su osobine dominantne intrafolikularne sredine unapre|ene evolucijom u cilju optimizacije uslova koji pobolj{avaju sazrevanje kompetentnog gameta. [ta su determinante kompatibilnosti, pitanje je od centralnog zna~aja za razumevanje reproduktivne biologije `enskog gameta. Razvoj kompatibilnih oocita, koji rezultuje normalnim embrionima je dug proces koji po~inje tokom fetalnog `ivota kada se formira pool primordijalnih folikula. Primordijalni oociti ostaju u profazi prve mejoti~ke deobe i nisu u mogu}nosti daljeg razvoja, osim ako folikul ne poraste i pru`i sredinu koja vodi ka nastavku razvoja oocita. Iako folikul raste kontinuirano od ro|enja pa sve do kraja reproduktivne sposobnosti, folikul ne dosti`e ovulatornu veli~inu i ne proizvodi zna~ajne koli~ine estrogena tokom detinjstva. U pubertetu koordinisana cikli~na stimulacija gonadotropina iz pituitarne `lezde inicira sazrevanje oocita i ovulaciju. Utvr|eno je da je folikul koji }e postati dominantan i koji }e ovulirati, obi~no najve}i folikul pre~nika od 5,5 - 8,2 mm na po~etku folikularne faze. Smatra se da njegove granulozne }elije najvi{e reaguju na FSH - follicle stimulating hormone. Modulacija osetljivosti na FSH - follicle stimulating hormon, mo`e da bude postignuta lokalnim faktorima rasta, npr. faktor -1 rasta sli~an insulinu. Dominantan folikul po~inje da sinteti{e estradiol. Sa sazrevanjem folikula granulozne }elije sti~u LH - luteinizing hormone
receptore kao odziv na stimulaciju FSH follicle stimulating hormon, prisvajaju}i sposobnost reagovanja na LH - luteinizing hormone. Sa nastavkom preovulatornog sazrevanja folikula, pove}ava se vaskularitet folikula i time se pove}ava isporuka gonadotropina folikulu koji sazreva, kao i sistemska dostupnost njegovih produkata, naro~ito steroida. Preovulatorni ve}i dotok LH - luteinizing hormona, stimuli{e sazrevanje oocita, ekspanziju kumulusa i reinicijaciju mejotskog sazrevanja koje napreduje iz prve profaze ka drugoj metafazi za otprilike 36 ~asova. Promene u ooplazmi, koje su istovremene sa mejotskim promenama i koje odlikuju sazrevanje citoplazme, uklju~uju i pove}an kapacitet emitovanja intracelularnog kalcijuma, izmene preformirane informacione, iRNK, potrebne za podupiranje razvoja embriona pre kompletne aktivacije genoma i migraciju u subplazmalemalnu citoplazmu kortikalnih granula koje u~estvuju u prevenciji polispermi~ne penetracije. Ekspanzija kumulusa se odvija kao rezultat sekrecije matrice proteglikana bogate hijaluronskom kiselinom, od strane }elija kumulusa koje okru`uju oocit. Ova ra{irena matrica dr`i oocit - kumulus kompleks koji olak{ava folikularnu ekstruziju u ovulaciji, penetraciju spermatozoida i oplodnju. Mejoza je jedinstven tip }elijske deobe koja se odvija samo u gametogenezi i rezultuje redukcionom deobom, podelom broja hromozoma za pola, radi omogu}avanja rekonstituisanja normalnog broja hromozoma nakon oplodnje. Mejoza potpoma`e genetsku varijaciju kroz rekombinaciju hromozoma i odgovaraju}ih podudarnih gena. Oogonije fetusa ulaze u
36
mejozu tokom drugog tromese~ja trudno}e, ali oocit ostaje u diplotenskoj podfazi profaze prve mejoti~ke deobe napreduju}i samo do druge metafaze u kojoj dolazi do ovulacije i oplodnje, tokom sazrevanja oocita kod odrasle osobe. Tokom produ`enog zastoja u diplotenskoj podfazi prve profaze, hromozomi oocita su se kondenzovali, spojili sa svojim homologim parovima i podvrgli rekombinaciji odvajaju}i se po njihovoj du`ini, osim na mestima ukr{tanja poznatim kao hijazme. Oociti mogu ostati u ovoj etapi tokom mnogo godina sve do ovulacije. Efikasno odr`avanje ovog stanja zastoja je od najve}eg zna~aja za osiguravanje efikasnog tro{enja zalihe oocita tokom reproduktivnog `ivota kao i za ostanak pojedina~nih oocita u stabilnom stanju sve do iniciranja daljeg folikularnog rasta. Okru`uju}e granulozne }elije su odgovorne za odr`avanje oocita, ali su ta~ni reg-
ulatorni mehanizmi jo{ uvek nepoznati. Pre nastavka mejoze nezreli oociti se podvrgavaju zna~ajnom rastu da bi pre{li prag veli~ine sazrevanja i etapne promene hromatinskih konfiguracija. Reinicijacija mejoze uklju~uje uobi~ajenu putanju signaliziranja izme|u oocita i njegovih granuloznih }elija, bez obzira da li je oocit odre|en da ovulira, ili da degeneri{e. Prime}eno je la`no sazrevanje kod atreti~nih folikula kao rezultat degenerativnih promena koje rasparuju komunikaciju oocit - granulosa. Pri sazrevanju oocit nastavlja prvu mejozu i napreduje kroz metafazu, anafazu i telofazu izbacuju}i prvo polarno telo koje sadr`i polovinu hromozomnog komplementa, zajedno sa minimalnom koli~inom citoplazme. Asimetri~na deoba ooplazme se odvija kao posledica periferne pozicije vlakana deobnog vretena {to dozvoljava hromozomu da bude prepolovljen bez zna~ajnog gubitka ooplazme.
37
Oociti napreduju direktno do druge metafaze bez replikacije DNK - deoksiribonukleinske kiseline ili formiranja nukleusa i ponovo se zaustavljaju. Ova ta~ka zastoja je manje stabilna od prve profaze i oociti mogu ostati najvi{e 24 ~asa funkcionalni i spremni za normalan razvoj nakon oplodnje. Druga mejoza se nastavlja nakon penetracije spermatozoida i partenogene aktivacije. Morfolo{ki dokaz nastavka mejoze je nestajanje nukleusa oocita i jedarne membrane germinalnog vezikula putem procesa koji je nazvan GVBD - germinal vesicle breakdown. Pretpostavlja se da se sazrevanje nukleusa odvija po izbacivanju polarnog tela. ^im se formira sekundarni folikul granulozne }elije razviju FSH - follicle stimulating hormone receptore, a teka }elije se diferenciraju oko bazalne membrane. Sa formiranjem teka }elija ispolje se i LH luteinizing hormon receptori. U toku stvaranja sekundarnih folikula dolazi do migracije ka medularnom delu ovarijuma, gde se formira rani sloj teke eksterne i po~inje vaskularizacija folikula. Tako|e se pojavljuju gonadotropni i steroidni receptori. Kao {to je poznato, LH - luteinizing hormon stimuli{e teka }elije da proliferi{u i diferenciraju i inicira produkciju androgena. Pre`ivljavanje teka }elija nije zavisno od LH-luteinizing hormona. Androstenedion koji poti~e iz teka }elija je zavistan od LH - luteinizing hormona i deluje na granulozne }elije da citodiferenciraju odgovor na FSH - follicle stimulating hormone. Dokazano je da je faza rasta do preantralnog folikula gonadotropin nezavisna. Tako se folikuli od 2 - 5 mm pre~nika identifikuju u ovarijumu i u odsustvu FSH - follicle stimulating hormone (Kallmanov sindrom).
na kompetentnost se sti~e samo kada su procesi sazrevanja nukleusa i citoplazme blisko integrisani. Sazrevanje nukleusa oocita je od posebnog zna~aja. Faktor unapre|enja sazrevanja MPF maturation promoting factor u~estvuje u mejoti~koj deobi oocita. Naime, mnogi proteini koji reguli{u mitozu tako|e reguli{u i mejozu. Tranzicija G2 i M-faze kod potpuno zrelih oocita je pokrenuta delovanjem MPF - maturation promoting factor-a pa se on smatra primarnim molekulom koji u~estvuje u napretku }elijskog ciklusa mejoze. MPF - maturation promoting factor je heterodimer serinsko-treoninskog kinaznog proteina sastavljen od regulatorne podjedinice ciklina B i kataliti~ke podjedinice p34cdc2. Ciklin B i p34cdc2 postaju povezani i defosforizacija p34cdc2, katalisana fosfatazom koja je kodirana genom cdc2 se odvija na ostacima tirozina-15 i treonina-14. Aktivan MPF - maturation promoting factor je potreban za inicijaciju nuklearnog sazrevanja i kondenzaciju hromozoma u prvoj metafazi. Aktivnost MPF maturation promoting factor-a se mo`e detektovati pre, ili za vreme GVBD - germinal vesicle breakdown. Ulazak u prvu anafazu je istovremen sa inaktivacijom MPF - maturation promoting factor-a, zbog proteoliti~ke degradacije ciklinske jedinice MPF - maturation promoting factor-a. Ulazak u drugu mejoti~ku deobu zahteva drugo pove}anje aktivnog MPF - maturation promoting factor-a i kako c-mos odr`ava MPF - maturation promoting factor na visokom nivou, napredak }elijskog ciklusa je u zastoju do oplodnje, kada penetracija spermatozoida rezultuje pove}anjem intracelularnog slobodnog Ca2+ koji podsti~e aktivnost MPF - maturation promoting
38
factor-a i dovodi do degradacije ciklina B {to dozvoljava kompletiranje mejoze. MAP - mitogen activated protein kinaze je serinsko-treoninska kinaza koja se aktivira putem kaskade proteinske kinaze na po~etku sazrevanja oocita. MAP - mitogen activated protein kinaza, iako aktivirana pre po~etka sazrevanja oocita, nije obavezno potrebna za GVBD - germinal vesicle breakdown. Kod oocita je p42ERK2 glavni oblik MAP - mitogen activated protein kinaze. MAP - mitogen activated protein kinaza nije aktivna kod nezrelih oocita, ve} samo kod zrelih i pokazuje smanjenu aktivnost nakon pronuklearnog formiranja.
Purini su va`ni faktori u procesu sazrevanja oocita. Purin cAMP, cikli~ni adenozin monofosfat, u~estvuje u mejoti~kom zastoju i mo`e spre~iti GVBD - germinal vesicle breakdown inhibicijom aktiviranja MPF maturation promoting factor-a, ili deregulacijom defosforizacije p34CdC2, smanjuju}i se ispod nivoa praga pre nastavka mejoze. Druga dva purina, hipoksantin i adenozin spre~avaju in vitro GVBD - germinal vesicle breakdown oocita potpoma`u}i visoke nivoe cAMP - cyclic adenosine monophosphate. Hipoksantin spre~ava degradaciju cAMP - cyclic adenosine monophosphate, dok adenozin potpoma`e generisanje cAMP - cyclic adenosine monophosphate stimulisanjem adenilata ciklaze deluju}i kao supstrat za proizvodnju cAMP - cyclic adenosine monophosphate. DMAP6 - dimetilaminopurin inhibira GVBD - ger minal vesicle breakdown i napredak }elijskog ciklusa inhibiranjem post-translacione defosforizacije p34cdc2 koja pokre}e aktivnost MPF - maturation promoting factora, ali se ne me{a u sintezu proteina.
Sazrevanje citoplazme se odnosi na procese koji pripremaju oocit za oplodnju, aktivaciju, formiranje pronukleusa i preimplantacioni razvoj. Kao i kod sazrevanja nukleusa, kompetentnost sazrevanja citoplazme se sti~e sekvencijalnim koracima tokom sazrevanja, dok oocit napreduje od faze germinalnog vezikula. Za ve}inu deficijencija oocita, koje uti~u na kompetentnost, veruje se da su u vezi sa defektima u reprogramiranju citoplazme tokom sazrevanja, a ne sa napretkom mejoze. Citoplazmati~ne aberacije se normalno manifestuju tokom preimplantacionih i perimplantacionih etapa i javljaju se kao }elijska iregularnost, spora deoba, prerani zastoj, nizak broj }elija ili kao neuspeh implantacije. Sinteza proteina nastaje u rastu}im oocitima iz transkripata kodiranih nuklearnih i mitohondrijskih genoma. U zavisnosti od njihovog porekla i regulatornih osobina mogu biti upotrebljeni za komunikaciju sa okolnim granuloznim }elijama od strane oocita i za potporu ranom razvoju embriona.
Kalcijum
Penetracija spermatozoida potpoma`e promene koje zavise od Ca2+, a koje rezultuju aktivacijom oocita. Ca2+ se osloba|a iz intracelularnih zaliha putem mehanizma signalne transdukcije koji zavisi od IP3independent pathway. Kapacitet oocita da oslobodi intracelularni Ca2+ je relativno nizak tokom raznih etapa sazrevanja, a dosti`e maksimum u mejoti~koj deobi. Osloba|anje Ca2+ je neophodno za aktivaciju oocita i formiranje pronukleusa i de{ava se u isto vreme sa oplodnjom. Defekti u sposobnosti oocita da odgovore na signale koji mobili{u Ca2+ ili na signale koji tokom sazrevanja citoplazme rezultuju neadekvatnim skladi{tenjem Ca2+ ili
39
Produkcija glutationa
Tokom sazrevanja oocita pove}ava se produkcija glutationa. Glutation je agens redukcije koji poma`e dekondenzaciju spermatozoida i ima ulogu u formiranju mu{kog pronukleusa, a mo`e pru`iti za{titu od patolo{ke oksidacije slobodnih radikala.
ciklusa, podle`e GVBD - germinal vesicle breakdown u odnosu na procenat oocita dobijenih od folikula koji su imali 3-4 mm u pre~niku tokom lutealne faze. Smatra se da folikuli sa pre~nikom < 10mm sadr`e manje razvojno kompetentnih oocita, a minimalni pre~nik folikula potreban za oocite koji }e biti sposobni za in vitro sazrevanje je 5mm.
Veli~ina oocita
Uti~e direktno na sposobnost oocita da nastavi mejozu i zavr{i sazrevanje. Utvr|eno je da pre~nik oocita mora biti ve}i od 115 m da bi napredovao od GVBD - germinal vesicle breakdown, do druge mejoti~ke deobe.
Kortikalne granule
Kod zrelih oocita zauzimaju perifernu poziciju ispod ooleme. Penetracija spermatozoida u oocit pokre}e osloba|anje kortikalnih granula putem ekscitoze i blokira polispermiju, smanjivanjem penetrabilnosti zone pellucide, da bi se spre~ila penetracija drugih spermatozoida. Egzocitoza kortikalnih granula mo`e biti podstaknuta Ca2+ jonoforama, a reagovanje oocita se pove}ava sa napretkom sazrevanja. Nedostatak egzocitoze usled nekompletnog sazrevanja citoplazme mo`e dovesti do polispermije, dok preuranjeno osloba|anje, zbog neodgovaraju}eg ili produ`enog kultivisanja, mo`e smanjiti permeabilnost zone pellucide za penetraciju spermatozoida, a time i oplodni potencijal.
Faktor rasta
Faktor rasta je protein koji se pona{a kao signalni molekul izme|u }elija, vezuju}i se za specifi~ne receptore na povr{ini ciljne }elije, potpoma`u}i diferencijaciju i sazrevanje }elije. Najpoznatiji faktori rasta su: - G-CSF - granulocyte colony stimulating factor, faktor stimulacije granulocitne kolonije; - GM-CSF - granulocyte macrophage colony stimulating factor, faktor stimulacije granulocitno makrofagne kolonije; - NGF - nerve growth factor, faktor rasta nerava; - Neurotrofin; - PDGF - platelet derived growth factor, faktor rasta dobijen od trombocita; - EPO - eritropoetin; - GDF8 - growth differentiation factor, miostatin; - GDF9 - growth differentiation factor 9, faktor diferencijacije rasta 9; - bFGF - fibroblast growth factor ili FGF2 - fibroblast growth factor, bazni faktor rasta fibroblasta.
Veli~ina folikula
Veli~ina folikula iz koga poti~e oocit uti~e na njegov razvojni kapacitet, po{to se kriti~ni aspekti razvojne kompetentnosti sti~u tokom folikularnog rasta. Endokrini milje se menja kroz menstrualni ciklus i mo`e uticati na rast folikula koji je osetljiv na gonadotropin, a mo`e uticati i na ostale aspekte folikula i razvoja oocita. Utvr|eno je da zna~ajno ve}i procenat oocita, dobijen iz folikula veli~ine 9-15 mm tokom folikularne faze menstrualnog
40
Citokini su se nekada dovodili u vezu sa hematopoeti~kim }elijama i }elijama imunog sistema (npr. limfociti i }elije iz jetre, timusa i limfnih ~vorova). U sistemu cirkulacije i ko{tane sr`i gde se }elije mogu javiti u te~nom rastvoru, a ne vezane u ~vrstom tkivu, potpuno je razumljivo da one komuniciraju sa rastvorljivim cirkuli{u}im molekulima proteina. Me|utim, u kasnijim istra`ivanjima se pokazalo da neke od signalnih proteina, koje su koristili hematopoeti~ki i imuni sistem, tako|e koriste i ostale vrste }elija i tkiva tokom rasta kao i u odraslom organizmu. Neki citokini mogu biti faktori rasta kao {to je G-CSF - granulocyte colony stimulating factor i GM-CSF - granulocyte macrophage colony stimulating factor. S druge strane neki citokini se koriste kao signali smrti kao {to je FAS - ligand koji primorava ciljne limfocite na programiranu smrt }elija ili apoptozu. Faktor rasta fibroblasta FGF - fibroblast growth factor je prona|en u ekstraktu kravljeg mozga od strane Gospadarowich-a i testiran je u biolo{kom eksperimentu izazivaju}i brzi rast fibroblasta. Kasnijim delovanjem kiselim i baznim pH, izolovana su dva neznatno razli~ita oblika koji su nazvani kiseli faktor rasta fibroblasta aFGF- fibroblast growth factor i bazni faktor rasta fibroblasta bFGF - fibroblast growth factor. Ovi proteini su imali zajedni~ki vrlo visoki stepen identi~nih sekvenci amino kiselina. Trenutno postoje 23 ~lana FGF - fibroblast growth factor familije koji su po svojoj strukturi signalni molekuli (FGF1 - fibroblast growth factor, FGF2 fibroblast growth factor, FGF3 - fibroblast growth factor, itd.) i koji se vezuju za familiju receptorskih molekula koja se sastoji od 4 ~lana; FGFR1 - fibroblast growth factor receptor, FGFR2 - fibroblast growth
factor receptor, FGFR3 - fibroblast growth factor receptor i FGFR4 - fibroblast growth factor receptor. I pored svih ovih saznanja jo{ uvek se ne zna precizno {ta radi FGF fibroblast growth factor. U najnovijim istra`ivanjima izolovan je par faktora rasta koji se vezuje za heparin i nazvani su HBGF1 - heparin binding growth factor i HBGF2 - heparin binding growth factor. U drugom istra`ivanju izolovan je drugi par faktora rasta koji izaziva brzi rast endotelijalnih }elija krvotoka ECGF1 - epithelial cell growth factor i ECGF2 - epithelial cell growth factor. Jedna od najva`nijih funkcija bFGF fibroblast growth factor, tako|e poznatog kao FGF-2 - fibroblast growth factor je da potpoma`e ubrzani rast endotelijalnih }elija, fizi~ku organizaciju endotelijalnih }elija u tubi i formiranje novih krvnih sudova. Ovaj proces je poznat kao angiogeneza, a utvr|eno je da je bFGF - fibroblast growth factor potentniji angiogeni faktor od VEGF - vascular endothelial growth factor-a, ili od PDGF - platelet derived growth factor-a. Osim stimulisanja formiranja krvnih sudova, bFGF - fibroblast growth factor ima va`nu ulogu u zarastanju rana izazivanjem ubrzanog rasta fibroblasta. Pojedina~ni proteini faktora rasta imaju tendenciju da se pojavljuju kao ~lanovi ve}ih familija strukturno i evoluciono povezanih proteina. Gornji primer govori o FGF - fibroblast growth factor-a, ali postoje na desetine familija faktora rasta kao {to su TGF-beta - transforming growth factor, BMP - bone morphogenic protein, NGF nerve growth factor, BDNF - brain-derived neurotrophic factor i NT3 - neurotrofin itd. Tokom poslednjih dvadeset godina faktori rasta se sve vi{e koriste u tretmanu hematolo{kih i onkolo{kih bolesti kao {to
41
su neutropenija, MDS - mijelodisplasti~ni sindrom, leukemija, aplasti~na anemija. S obzirom na njihovu veliku ulogu i zna~aj za uspeh in vitro oplodnje putem utvr|ivanja fiziolo{ke kompetentnosti oocita, intenzivno se nastavljaju istra`ivanja radi postavljanja analiti~kih merila za procenu. Dana{nja nemogu}nost razlikovanja kompetentnih od nekompetentnih oocita ima uticaj na stepen uspe{nosti tretmana. Ne samo {to nekompetentni oociti mogu gre{kom biti izabrani za fertilizaciju umesto kompetentnih, ve} je jo{ va`nije da pacijenti koji imaju nedostatak kompetentnih oocita ne mogu biti identifikovani tokom rane procene neplodnosti.
Otkriveno je da se apoptoza odvija kod tri razli~ita tipa ovarijalnih }elija; kod oocita, granuloznih }elija i lutealnih }elija. Apoptoza je najintenzivnija tokom razvoja embriona. Apoptoza oocita uti~e na neona-
talni ovarijalni razvoj. In vitro i in vivo eksperimenti su pokazali da agensi koji o{te}uju DNK, kao {to su cikli~ni poliaromatski ugljovodonici i citostatici, podsti~u apoptozu oocita. Na osnovu ovih rezultata je jasno da su oociti jajnika odraslih jedinki zadr`ali svoju sposobnost apoptoze pod patolo{kim uticajem. Transgenski i `ivotinjski modeli su razjasnili kako se reguli{e smrt oocita. Iz velikog broja eksperimentalnih radova na `ivotinjama dobijeni su slede}i podaci. Za gene Bc12 kod Bc 12-associated X protein nock-out mi{eva je otkriveno da imaju zna~ajno manje oocita od `ivotinja sli~nog starosnog doba. Bcl2 - B-cell non Hodgkin s lymphomas gen se, tako|e, mo`e detektovati kod E 12,5 - embryo i E 15,5 embryo oocita mi{eva. Jo{ jedan ~lan antiapoptotske Bcl2 - B-cell non Hodgkin s lymphomas familije gena, Bcl-xl - B-cell non Hodgkin s lymphomas ima ulogu u odre|ivanju sudbine }elija zametka. Iako Bcl-xl - B-cell non Hodgkin s lymphomas nock-out mi{evi umiru u veoma ranoj etapi fetalnog razvoja, postoji jasan gubitak }elija zametka kod E 11,5 - embryo u pore|enju sa ostalim kontrolnim `ivotinjama. Mi{evi koji su imali nedostatak gena Bax Bc 12-associated X protein, koji je ~lan proapoptotske Bcl2 - B-cell non Hodgkin s lymphomas familije gena, su imali normalan broj oocita pri ro|enju, ali na po~etku puberteta je pool folikula bio trostruko ve}i u pore|enju sa mi{evima sli~nog starosnog doba. Tokom folikulogeneze je apoptoza zapa`ena, uglavnom, kod granuloznih }elija jajnika. ^ini se da je ovaj proces u osnovi kontrolisan hormonima. Testosteron podsti~e, a estradiol inhibira apoptozu granuloznih }elija kod jajnika glodara. Pokazalo se da su i gonadotropini faktor pre`ivljavanja
42
za ljudske granulozne }elije u in vitro uslovima. Osim toga, ~ini se da visok odnos androgen/estrogen predodre|uje }elijsku smrt granuloznih }elija. Apoptoza granuloznih }elija je posredovana od strane gena Bcl2 - B-cell non Hodgkin s lymphomas familije faktora koji reguli{u }elijsku smrt. Apaf-1 - apoptotic peptidase activating factor gen se tako|e ekspresuje u granuloznim }elijama i aktivira osloba|anjem citohroma-C uz posredovanje Bcl2 B-cell non Hodgkin s lymphomas familije. Geni supresori tumora TP53 - thymidine phosphorylase i WT1 - Wilms tumors imaju ulogu u regulisanju apoptoze granuloznih }elija kod glodara. Sve vi{e se potvr|uje da apoptoza igra va`nu ulogu u regresiji CL - corpus luteuma kod `ivotinja i kod ljudi. Nedavna zapa`anja, tako|e, odra`avaju ekspresiju ~lanova Bcl2 - B-cell non Hodgkin s lymphomas familije koji reguli{u apoptozu u ljudskom CL - corpus luteum: Bcl 2 - Bcell non Hodgkin s lymphomas, Bcl x - Bcell non Hodgkin s lymphomas i gen Bax Bc 12-associated X protein. Eksperimenti sa uzgajanim granuloznim lutealnim }elijama nagove{tavaju da se kaspaze 3 i 9 aktiviraju kod apoptoze podstaknute staurosporinom u luteiniziranim ljudskim granuloznim }elijama.
Na slici je prikazan prelaz primordijalnog u primarni folikul sa zadebljanjem folikularnih epitelnih }elija.
Sl. 2.15 - Prelaz primordijalnog (A) u primarni folikul (B): 1. primarni oocit; 2. folikularni epitel
1. 2. FOLIKULOGENEZA
U momentu ro|enja preostali primarni oociti su okru`eni tankim slojem folikularnih epitelnih }elija i bazalnom membranom odvojeni od ovarijalne strome. To su primordijalni folikuli. U kasnijem periodu do menopauze neki od njih pod delovanjem hormona mogu da se aktiviraju.
Ukoliko primarni folikul opstane, prelazi u sekundarni folikul sa zadebljanjem folikularnog epitela koji postaje vi{eslojni i naziva se stratum granulosum. Izme|u oocita i stratum granulosum-a formira se glikoproteinski sloj - zona pellucida. Izvan bazalne membrane organizuje se stroma ovarii u theca folliculi.
43
Sl. 2.17 - Sekundarni folikul: 1. primarni oocit; 2. zona pellucida; 3. stratum granulosum granuloza; 4. theca folliculi
Sl. 2.20 - Tercijalni folikul: 1. oocit; 2. zona pellucida; 3. stratum granulosum; 4. theca interna; 5. theca externa; 6. antrum folliculi; 7. cumulus oophorus; 8.bazalna membrana
Ovarijalna stroma - theca oko folikula se deli na unutra{nji sloj theca interna, koji je dobro prokrvljen sa }elijama bogatim lipidima koje produkuju hormone i spolja{nji sloj - theca externa.
Sl. 2.18 - Sekundarni folicul i zona pellucida
U daljoj folikulogenezi formira se tercijalni folikul sa likvorom ispunjenom {upljinom - antrum folliculi.
Tercijalni folikul nastavlja da raste do veli~ine od oko 22 mm, pred samu rupturu sa folikularnom te~no{}u od oko 5 ml i naziva se De Graff -ov folicul.
44
Po~inje odvajanje cumulus oophorus sa oocitom od granuloze, pri ~emu se formira corona radiata koja slobodno pliva u folikularnoj te~nosti antruma folliculi. Primarni oocit koji je do tada sve vreme bio u profazi prve mejoti~ke deobe nastavlja deobu prelaze}i u sekundarni oocit sa haploidnim brojem hromozoma. Proces deobe se ponovno zaustavlja u metafazi druge mejoti~ke deobe do oplodnje.
morfologiji i normalnom pona{anju u in vitro uslovima razvoja tokom preimplantacionih faza. Dalji razvoj i pobolj{anje tehnika IVF - in vitro fertilisation jedino je mogu} uz dalje re{avanje i razumevanje molekularnih i }elijskih interakcija koje se de{avaju u svakom folikulu izme|u oocita i granuloznih }elija. Uklanjanje kumulusa kombinacijom enzimskih i mehani~kih metoda omogu}ava direktnu observaciju prvog polarnog tela i utvr|ivanje stadijuma mejotske maturacije. Multiparametarska procena kvaliteta oocita se mo`e posti}i pore|enjem sa ostalim merama folikularne maturacije uklju~uju}i i morfologiju kumulusa i endokrini status. Tako, mehani~ke manipulacije oocitima zauzimaju fundamentalnu ulogu u praksi klini~kog ART - assisted reproductive technology. Iako je {iroko rasprostranjeno mi{ljenje da kumulus i korona }elije nemaju dodatnu ulogu u razvoju posle ovulacije, prevremena disrupcija oocitnosomatskih }elijskih kontakata mo`e kompromitovati razvojnu kompetenciju oocita kroz mehanizme koji nisu razja{njeni. Novije studije sistema animalnih modela skre}u pa`nju na strukturnu slo`enost izme|u somatskih folikularnih }elija i oocita koja se menja kod raznih sisara na razli~itim stadijumima folikularnog razvoja. Genetska i molekularna disekcija multipliciteta sekretornih faktora receptora i signalnih putanja, direktno ukazuje na postojanje sofisticiranih bidirekcionih komunikacionih sistema unutar ovarijalnog folikula koji uti~u na upotrebljivost folikula kao i kompetenciju ovuma. Da je regulacija bidirekcione komunikacije dinami~ka i direktno modulisana endogenim gonadotropinima ili egzogeno COH - controled ovarian hyperstimulation postaje o~igledno.
45
Gap spojevi, komunikacioni spojevi, su naj~e{}i tip spajanja dve }elije i mogu se na}i u skoro svakom `ivotinjskom tkivu.
a)
b)
Sl. 2.23 a) i b) - Gap veza izme|u dve }elije: gj - gap veza; aj - adherentna veza
Svaki spoj dozvoljava malim molekulima, rastvorljivim u vodi, da se kre}u direktno izme|u citoplazmi dve }elije koje su u kontaktu, {to zna~i da obe }elije dele metabolite pa ~ak i elektri~ne osobine. Ovi tipovi spojeva su formirani od proteina koji potpuno prelaze plazma membranu jedne }elije i ostvaruju kontakt sa identi~nim proteinom koji prelazi plazma membranu susedne }elije. Mala grupa ovih proteina zajedno formira kanal - connexon
46
kroz membranu. Materijali rastvorljivi u vodi se mogu kretati kroz membranu pomo}u ovog kanala i mogu pro}i direktno u connexon u naspramnoj membrani susedne }elije. Po{to proteinski connexoni formiraju spoj, membrane }elija ostaju odvojene malim zarezom - gap od oko 3 nanometra. Ujedinjeni connexon-i formiraju grupe u membranama }elija u broju koji se kre}e od 2 do 300 kanala po grupi - cluster. Proteini u ovim connexon kanalima i grupe gap spojeva su isti i locirani u plazma membrani kao pojedina~ne podjedinice. Kada je potrebno one se udru`uju bo~nim pomeranjem u plazma membrani, formiraju}i kanal i spajaju}i jednu }eliju sa drugom.
}elijama da se odr`e na okupu kao sloj, dr`e ih jednu uz drugu i poma`u }elijama da se pona{aju kao veoma selektivna barijera. Kontinualni nizovi spojenih proteina formiraju vezu izme|u plazma membrana dve susedne epitelijalne }elije na takav na~in da prave veoma ~vrst kontakt izme|u dve plazme membrane, prelaze}i intercelularni prostor i potpuno zatvaraju}i prostore izme|u njih. Ovi nizovi proteina se prote`u skoro oko cele }elije formiraju}i potpun krug. Na ovakvim spojevima re{etka nizova spojenih proteina ujedinjuje dve membrane toliko blisko da nema intercelularnog prostora. Kada absorbuju hranljive molekule na njihovim spoljnim povr{inama molekuli se prebacuju kroz epitelijalne }elije i iz }elije prelaze u krv. Na ovaj na~in ~vrsti spojevi izme|u epitelijalnih }elija spre~avaju hranljive molekule da se difunduju i izme|u susednih }elija, spre~avaju}i transportne proteine da kre}u sa povr{ine jedne }elije na povr{inu druge i ujedinjuju epitelijalne }elije u kontinuirani sloj.
Transzonalna projekcija
Interakcija oocit - granuloza postoji u vi{e oblika unutar rastu}eg folikula. Ovo podrazumeva pored direktnog }elijskog kontakta putem gore opisanih spojeva i izmenu zna~ajnih parakrinih signala, kao {to su GDF 9 - growth differentiation factor i kit - ligand. Somatske granulozne }elije koje okru`uju oocit podle`u periodi~nim promenama u strukturi i funkciji koje sledstveno prate potrebe razvijaju}eg oocita. Sveobuhvatni odnos oocita i okolnih granuloznih }elija naziva se TZP - transzonal projections. Poznato je da na nivou primordijalnih folikula postoje gap spojevi izme|u oocita i granuloznih }elija. Jednom kada je folikulogeneza inicirana
47
postepeno deponovanje zone pelucide na povr{ini }elije stvara permanentnu, ali vrlo podlo`nu uticajima, ekstracelularnu barijeru izme|u germinativne }elije i granuloznih }elija. Posebna karakteristika granuloznih }elija je sposobnost prodiranja kroz zonu pellucidu i u~vr{}ivanje citoplazmatskih projekcija za povr{inu oocita da bi se odr`ao fizi~ki kontakt na ovoj heterocelularnoj povr{ini. Transzonalne projekcije su prisutne kod preantralnog folikula gde one duboko invaginiraju oocit, ponekad penetriraju}i vrlo blizu germinalnog vezikula. U kasnijoj fazi razvoja folikula na|eno je da se transzonalne projekcije zavr{avaju mnogo povr{nije na oocitu i da se njihov broj postepeno smanjuje sa sazrevanjem folikula.
Citoskelet
Citoarhitektura, odnosno citoskelet, podrazumeva postojanje aktinskih filamenata koji su organizovani u vidu paralelnih tvorevina.
Sl. 2.24- Citoskelet oocita: -mikrotubule (crvene); - F - actin (zeleno) -myosin 2 (plavo)
Agregati F aktina su koncentrisani u transzonalnim projekcijama. Intermedijarni filamenti, tipi~ni markeri }elija mezenhimalnog porekla, detektovani su u granu-
loznim }elijama. Epitelijalni keratini su tako|e prisutni u granuloznim }elijama, a njihovo mesto nagomilavanja je u vidu visoko diferenciranih formi }elijskih adhezija poznatih kao desmozomi. Transzonalne projekcije uklju~uju i mikrotubule kao najve}e citoskeletne formacije. Mikrotubuli su sastavljeni od heterodimeri~kih subjedinica alfa i beta. Nedavna istra`ivanja su dokazala prisustvo molekula koji su ina~e uklju~eni u neurotransmisiju na nivou oocit - granulozna }elija, {to ukazuje da transzonalne projekcije slu`e kao aksonu sli~ni provodnik za makromolekularnu izmenu. Karakteristike transzonalne penetracije se menjaju sa rastom folikula, kako u pogledu gustine, tako i u pogledu obima penetracije ooleme. Broj gap spojeva je zavistan od estrogena i FSH - follicle stimulating hormone-a. Iz svega do sada navedenog je jasno da oocit, da bi mogao da u~estvuje u promenama koje po~inju sa penetracijom sperme, prolazi kroz ~itav niz molekularnih i celularnih zbivanja koji defini{u njegov razvojni potencijal. To podrazumeva inicijaciju mitoze i kompletiranje mejoze, podr{ku monospermi~noj fertilizaciji, aktivaciju oocita i obezbe|ivanje vremenski zavisnog prelaza od oslanjanja na genski sistem oocita do embrionalnog genoma. Kako je poznato da je u in vivo uslovima mejoti~ka deoba uslovljena inhibiraju}im faktorima koje stvaraju somatske }elije unutar ovarijalnog folikula, postavlja se pitanje kada u toku procesa folikulogeneze oocit sti~e sposobnost da nastavi mejoti~ku deobu i to kroz M fazu do aresta u metafazi druge mejoti~ke deobe. Ove promene uklju~uju strukturno remodeliranje specifi~nih nukleolarnih - nucleolus i citoplazmatskih - mikrotubularnih struktura. Tako progresivna kondenzacija hromati-
48
na u toku rasta oocita kulminira SN - surrounded nucleolus konfiguracijom u vreme stvaranja antruma, {to je morfolo{ka manifestacija sveop{te transkripcione represije. Remodeliranje hromatina oocita koje se de{ava u antralnom folikulu koincidira vremenski sa stvaranjem materinskih alela, lokalizovanjem dimetiltransferaze neophodne za metilaciju embrionalnog genoma i sticanjem mejoti~ke kompetencije. Esencijalni doga|aji za kompletiranje }elijskog mejoti~kog ciklusa ispoljavaju se relativno rano u folikularnom razvoju i imaju zna~ajan uticaj na remodeliranje hromatina u kasnijem embrionalnom razvoju. Promene u }elijskom metabolizmu u toku procesa maturacije imaju uticaj na nuklearno remodeliranje nakon fertilizacije. Sa nastavkom mejoti~ke deobe de{avaju se velike promene u mikrotubularnom citoskeletu koje su u vezi sa ispoljavanjem
}elijskog polariteta uspostavljanjem animalno-vegetativne ose. Remodeliranje mikrotubularnog citoskeleta kao odgovor na signal primljen preko spojeva somatskim }elijama za oolemu, stabilizuje kortikalni citoskeleton ograni~avaju}i nakupljanje molekula, ili organela koje ispoljavaju afinitet za mikrotubule ili centrozome. Mogu}nost osloba|anja kortikalnih granula i sposobnost da se generi{e i odra`ava oscilacijama kalcijuma, mo`e tako|e da bude veoma va`an ~inilac u sazrevanju oocita. Ovu sposobnost oocit sti~e kasno u toku oogeneze. Na{a saznanja u ovoj oblasti su jo{ uvek limitirana. FSH - follicle stimulating hormoni i LH - luteinizing hormoni su samo akteri finalne maturacije oocita i ovulacije deluju}i u kratkom periodu u pore|enju sa mesecima neophodnim sa rast i sazrevanje oocita, odnosno, folikula.
Tabela 2-5: Razvojne etape pri kojima funkcioni{u interakcije oocit - granuloza
Funkcije - Podrka rastu i nutriciji oocita - Trans}elijska razmena parakrinih faktora - Stvaranje polariteta oocita - Odr`avanje transkripcione/translacione aktivnosti u oocitu - Podrka pribavljanju mejoti~ke kompetencije - Podrka transkripcionalnoj represiji - Medijacija u odr`avanju mejotskog zastoja - Potiskivanje spontane luteinizacije - Olakavanje razmene parakrinih faktora - Medijacija u~vr}enja korone za kumulus - Remodeliranje matrice zone pelucide - Olakavanje hiperaktivacije penetracije sperme - Odr`avanje polariteta oocita - Spre~avanje gubitka perivitelinskih faktora - Poja~avanje matrice hialuroni~ne kiseline - Uspostavljanje molekularne filtracije grani~nih faktora zone - Regulisanje depozicije i dispozicije faktora u oocitu
Umerena
Ovularni folikuli
Visoka
49
Nasuprot dokaza koji prikazuju ekstenzivnu sekreciju i signaliziranje kojim posreduju parakrini faktori rasta na nivou oocit - granulosa, TZP - transzonal projections obavlja vitalnu ulogu u parakrinoj komunikaciji u jajniku i daje podr{ku metaboli~kim i biosinteti~kim potrebama oocita koji raste i sazreva. Dok direktni dokaz za transfer ATP adenosine triphosphate iz kumulusa u oocite nedostaje, sekrecija somatskih }elija i endocitoti~ko hranjenje oocita, ili direktni transfer kroz gap spojeve predstavlja mogu}e mehanizme za metaboli~ku potporu somatskih }elija. Studije in vitro sazrelih oocita su pokazale da smanjeni nivoi ATP - adenosine triphosphate u oocitima ne uti~u na mejoti~ki progres, ali uti~u na razvoj embriona. Da li ovi kasniji deficiti u razvoju poti~u od ugro`enih ATP - adenosine triphosphate zaliha u oocitima, ili od somatske }elije, ostaje da se utvrdi. Sa aktiviranjem gena koji kodiraju proteine za zonu pellucidu za vreme tranzicije iz primordijalnog u primarni folikul, zona postaje perzistentna, stalna i velika barijera za kontakt oocit - granulosa. Poznato je da stvaranje zone pelucide predstavlja nusprodukt specifi~ne ekspresije gena oocita i sekrecije razli~itih zona proteina kojoj posreduju granulozne }elije kroz, za sada, nejasno definisane mehanizme. Sposobnost granuloznih }elija da razviju TZP - transzonal projections i formiraju stabilne adhezione i gap kontakte sa oolemom, oslanja se na brz preokret i ponovno modeliranje zone sa nastankom folikulogeneze. Gustina i organizacija TZP - transzonal projections se menja dramati~no za vreme folikulogeneze sa ve}om ra{ireno{}u ovih struktura zapa`enih u pre-antralnom, a ne u kasnijem stadijumu razvoja folikula. Iako
faktori koji reguli{u formiranje TZP - transzonal projections rano u razvoju folikula ostaju nepoznati, nedavno je sugerisano da bi ove strukture mogle da posreduju u signalizaciji ligandima, kit - ligand, dobijenih od raznih oocita GDF9 - growth differentiation factor, BMP 15 - bone morphogenic protein ili granuloze, za koje se zna da igraju bitne uloge u ovom stadijumu. Po{to je }elijska adhezija putem cadherina hormonski regulisana u ovarijalnim folikulama, relativna stabilnost kontakata izme|u granuloza }elija i zone, ili ooleme mora biti bolje odre|ena. Interesantno je naglasiti da je sposobnost formiranja gap spojeva ~esto sekundarna za }elije koje uspostavljaju kalcijumski zavisne cadherin adhezije. Po{to se gap spojevi, koji posreduju u metaboli~koj kooperaciji neophodnoj za rast oocita, uglavnom de{avaju za vreme preantralnih stadijuma razvoja folikula, o~ekivalo bi se da bi uslovi, koji ugro`avaju funkciju gap spoja rano u folikulogenezi, promenili rast oocita, a kasnije i razvojni potencijal. Selektivna disrupcija komunikacije gap spojeva ugro`ava razvoj i oocita kao i folikula poja~avaju}i uzajamne zavisnosti ovih procesa i njihovog oslanjanja na komunikaciju gap spojevima. Ako su transkripcija i regulacija gena za }elijske spojeve oocit - granuloza podlo`ni hormonalnoj regulaciji, ~ini se verovatnim da naru{avanje reda u komunikacionim putanjama mo`e rezultirati iz izmena folikularne hormonalne sredine preovulatornog i periovulatornog stadijuma folikulogeneze. Ako takve izmene imaju negativne posledice, mogle bi da objasne jedinstvenu i diferencijalnu kompetenciju embriona unutar kohorta ~ije se pona{anje in vitro za vreme preimplantacionih stadijuma ~ini ekvivalentnim i normalnim.
50
Centralna stvar za uspe{no implementiranje in vitro strategija za dobijanje razvojno kompetentnih oocita je identifikacija gena koji u~estvuju u posredovanju pri interakcijama oocit - granuloza i razumevanje njihove regulacije i funkcije za vreme folikulogeneze. Ovo je posebno va`no kod in vitro sazrelih oocita gde je klini~ki stepen uspeha ni`i od oocita sazrelih in vivo. Uloga interakcije oocit - granuloza za vreme ovulacije i maturacije oocita je najvi{e prou~avana. Varijacije u stepenu ekspanzije kumulusa, retencija korona }elija, veli~ina perivitelinskog prostora, granularnost oocita i morfologija kumulusa ili oocita su determinante koje odre|uju kvalitet oocita kod selekcije za IVF - in vitro fertilisation. Uklanjanje kumulusa radi utvr|ivanja statusa sazrevanja oocita koristi se u konvencionalnoj IVF - in vitro fertilisation ili ICSI - intra citoplasmatic sperm injection proceduri. Mogu}e {tete zbog toga nisu do kraja prou~ene s obzirom na nedostatak pouzdanih neinvazivnih metoda odre|ivanja kvaliteta oocita. Ranije studije su pokazale da ova manipulacija nije {tetno uticala na trudno}e. Ovo indicira da uklanjanje korone nije {tetno za oocite sazrele in vitro pod standardnim COH - controled ovarian hyperstimulation uslovima, ali ne i za kvalitet i kompentenciju oocita sazrelih in vitro upotrebom skra}enih COH - controled ovarian hyperstimulation protokola. Podaci iz skorijih studija ukazuju na fiziolo{ku ulogu kumulusa tokom periovulatornog perioda kada dolazi do reinicijacije i zavr{etka mejoze i kada kompleks kumulusa podle`e ekspanziji. Ekspanzija kumulusa je kompleksan niz signalnih pojava u koje su uklju~ene aktivne transkripcione i metaboli~ke modifikacije koje
predstavljaju funkcionalan nastavak komunikacije oocit - granuloza zapo~et za vreme folikulogeneze. Za vreme sazrevanja oocita se de{avaju metaboli~ke promene u nivoima ATP adenosine triphosphate molekula kod proteinske forforilacije, translacije nagomilane mRNK - messenger ribonucleic acid i smanjenje ekvivalenata, kao na primer glutationa GSH - glutathione.
Za ove modifikacije u metabolizmu oocita se veruje da podr`avaju progresiju embrionskih }elija, {tite embrion od oksidativnog stresa i podr`avaju pronuklearni razvoj nakon aktivacije oocita. Efikasnost sa kojom se oociti podvrgavaju unapre|enim aktivnostima ove vrste je kompromitovana odsustvom }elija kumulusa. Odr`avanje veze sa kumulusom kroz period sazrevanja je va`no za potporu metabolizma oocita i drugih biosinteti~kih aktivnosti neposredno pre i posle fertilizacije, a mo`da i za preimplantacionu fazu. Bilo kakav prekid metaboli~ke kooperacije i komunikacije izme|u oocita i granuloze mo`e ugroziti funkciju oocita, a posledice ovakvog o{te}enja se otkrivaju tek u kasnijim stadijumima razvoja embriona.
51
Postavlja se pitanje do kakvih promena dolazi na oocitima i granuloznim }elijama za vreme ekspanzije kumulusa u odnosu na }elijske konekcije i signalizacije i kakvu ulogu igra ekstracelularna matrica kumulusa u fiziolo{koj aktivaciji oocita ili kompleksa kumulusa. Najnovija istra`ivanja indiciraju da se sposobnost oocita za normalan rast i razvoj i razvojni potencijal oslanja na va`ne modifikacije u }elijskom signaliziranju i sekreciji faktora koji se de{ava za vreme periovularnog perioda kada dolazi do ekspanzije kumulusa. Na~in konekcija za vreme sazrevanja oocita in vitro je modifikovan na gonadotropin zavisni na~in. TZP - transzonal projections se pove}ava po pitanju gustine i zapremine kod in vitro sazrevanja ljudskih oocita u prisustvu FSH - follicle stimulating hormone-a. Pitanje kako se ove projekcije formiraju kao odgovor na gonadotropine ostaje bez odgovora, ali novi uvid u aktivaciju sistema signaliziranja pokazuje direktnu modifikaciju stabilnosti citoskeletnih elemenata. Mikrotubule koje sadr`e TZP - transzonal projections formiraju staze za kretanje organela kao {to su mitohondrije i endozomi. Mikrotubule formiraju jezgro citoskeletnih elemenata u TZP - transzonal projections, a subpopulacije mikrotubula su posttranslaciono modifikovane radi pobolj{anja njihove stabilnosti. Do danas nije ispitano da li citoskeletne modifikacije pobu|ene gonadotropinima u~estvuju u pobolj{anju kvaliteta oocita. Kumulus aktivno u~estvuje u adekvatnom generisanju ATP - adenosine triphosphate za vreme sazrevanja oocita. Priliv mitohondrija unutar TZP - transzonal projections predstavlja mehanizam za lokalnu produkciju i isporuku ATP - adenosine
triphosphate oocitima za vreme metaboli~kog zahtevnog procesa sazrevanja oocita. Nedavni dokazi da }elije kumulusa i oociti razmenjuju parakrine faktore za vreme periovulatornog perioda, omogu}ava pravovremeni prolaz supstanci izme|u dve }elijske komore odeljka. Da li ove konekcije i dalje slu`e za uspostavljanje asimetrija u distribuciji molekula unutar oocita, ostaje da se vidi. Nedavni radovi su jasno pokazali da su TZP - transzonal projections granuloza }elija mesta produkcije STAT3 - signal transducers and activator of transcription leptina i da generi{u asimetri~ne {ablone depozicije ovih i drugih faktora u oocitima i embrionima. Postaje jasno da slo`eni {abloni signaliziranja u oocitima i granuloza }elijama posreduju u procesu ovulacije, ekspanzije kumulusa i sazrevanju oocita. Prostaglandini i steroidi izazivaju promene u metabolizmu kumulusa potrebne za samu ovulaciju i neutrali{u oksidativne i inflamatorne reakcije pravovremeno. Da li ove promene metaboli~ke aktivacije kumulusa uklju~uju i depoziciju faktora rasta koji se koriste u kasnijim stadijumima razvoja, nije poznato, ali s obzirom na ~injenicu da disruptivne tehnike, koje se trenutno koriste u praksi, elimini{u }elije kumulusa i uni{tavaju va`nu arhitekturu baziranu na matriksu, mogu}e je da mo`e do}i do ozbiljnih poreme}aja. U ove poreme}aje su uklju~eni gubici usled difuzije faktora zone, ili faktora ograni~enih oolemom, kao rezultat pove}ane poroznosti zone. Ovo je naro~ito va`no za normalno funkcionisanje oocita, jer se proces ekspanzije kumulusa odvija u prisustvu remodelovanja matriksa zone posle povla~enja TZP - transzonal projections.
52
USLOV
CILJ
POSLEDICE Enzimska disocijacija matriksa osloba|a spojeve }elija - }elija i }elija-zona; pove}ava poroznost zone i poja~ava odliv perivitelinskih faktora; odvaja oolemu od zone Procedura skidanja probija membranu plazme, gubitak organela uzrokuje proteolizu, povla~enje TZP pove}ava poroznost zone, pove}anje gubitka i degradaciju perivitelinskih faktora; mo`e do}i do proteolize povrine oocita.
Hijaluronidaza
Matriks kumulusa
Mehani~ko skidanje
Alternative Divalentna katjonska kelatacija Hipertoni~ki ok - sukroza Adhezioni agonisti, kadherinski fragment gap spojevi Adhezioni spojevi Brzo rasparivanje eliminie komunikaciju gap spojeva i gubitak metaboli~ke podrke kumulusa ]elijska disocijacija onemogu}ava aktiviranje signaliziranja na mestima kontakta
Adhezioni spojevi
Navedene fundamentalne osobine strukturnih osnova komunikacija granuloza - oocit uti~u na sticanje razvojne kompetentnosti oocita. U daljim istra`ivanjima treba dobiti odgovor na pitanja: koja je uloga gap veza u odr`avanju mejotskog zastoja, obnavljanju periovulatorne mejoze i mejoti~ke progresije ka drugoj metafazi, zatim razja{njenje mehanizama koje kumulusu omogu}uju transport faktora somatskih
}elija ka oocitima i njihovo o~uvanje u polarisanom obliku, na povr{ini oocita ili u kortinalnim delovima. Isto tako potreban je odgovor koji su to faktori koji najpre odr`avaju homeostatsku sredinu u izolovanim oocitima, a kasnije ponovo uspostavljaju aktivnost parakrinih faktora koji mogu izmeniti metabolizam oocita i embriona i poja~ati razvojni potencijal. O~igledno da sve dok se vi{e ne nau~i o strukturnim i funkcionalnim osnovama
53
komunikacije granuloza - oocit, praznine u na{em razumevanju intraovarijalnog potpornog sistema za razvoj oocita ne}e do}i do napretka programa asistirane reproduktivne tehnologije. Od zna~aja za dalje ispitivanje je da li se fragmentacija blastomere koja uti~e na jedan deo embriona u stadijumu rane deobe u kohortima, mo`e povezati sa preuranjenim prekidom signaliziranja izme|u zametka i somatskih }elija. Rizik dana{njih tehnika uklanjanja kumulusa u programima asistirane reprodukcije nas navodi na razmi{ljanja o potencijalno manje {tetnim na~inima, kao {to je tretman sa adhezionim agonistima, malim peptidima koji se koriste za pomeranje selektivnih tipova }elijskih adhezija. Neke od kombinacija ovih pristupa bi mogle dovesti do manipulacija koje nanose manju {tetu oocitima, a koje zadr`avaju odgovaraju}e }elijske veze potrebne za optimiziranje kvaliteta oocita. Upoznavanjem vrsta interakcija oocit granuloza koje koordini{u procesima oogeneze i folikulogeneze omogu}ava se dalje unapre|enje metoda ART - assisted reproductive technology, sa ciljem neugro`avanja kompetentnosti razvoja oocita i embriona. Ovo je mogu}e zato {to se bar tri slede}a fiziolo{ka procesa, koja se vezuju za in vivo produkciju ljudskih oocita, me{aju usled na~ina manipulacija kojima je ovaj materijal podvrgnut u rutinskoj proceduri: - disrupcija TZP - transzonal projections koja je potrebna za bidirekcionu razmenu faktora sekretovanih od strane oocita, ili granuloza }elija, - pogor{anje transporta metabolita i drugih molekula od granuloze ka oocitima putem gap spojeva, i
- prekidanje mehanizma kori{}enog za utvr|ivanje asimetri~nih gradijenata organela i proteinskih faktora koji posreduju u odgovaraju}oj prostornoj alokaciji materijala unutar blastomere. Kada bude dostignuto i omogu}eno uspostavljanje i odr`avanje ovih organizacionih principa oocita zna~ajno }e se pobolj{ati ishod klini~kog IVF - in vitro fertilisation.
54
growth factor, BDNF - brain derived neurotrophic factor, neurotrophini 3 i 4, kao i VIP - vasoactive intestinal polypeptide. Dok je ta~no vreme koje je potrebno folikulu da dostigne preantralnu fazu za sada nepoznato, pretpostavka je da ovaj proces traje vi{e od 300 dana. Jedan od razloga je dugo vreme dupliranja granuloznih }elija koje traje oko 250 sati. Nakon regrutovanja, folikul po~inje da pove}ava svoju veli~inu usled proliferacije granuloznih }elija i rasta oocita. Ovaj proces je kontrolisan genom nazvanim faktor diferencijacije rasta GDF-9 - growth differentiation factor. Gen GDF-9 - growth differentiation factor je ~lan super familije transformi{u}eg faktora rasta TGF- transforming growth factor u koju su uklju~eni svi TGF - transforming growth factor, morfogeneti~ki proteini kostiju BMPs - bone morphogenetic proteins, MISS - meiotic spindle stability protein, aktivini i inhibin. Zapa`anja da se gen GDF-9 - growth differentiation factor ekspresuje na oocit tokom rane folikulogeneze, nagove{tava da neki drugi gen tako|e mo`e da igra va`nu ulogu kod promena u jajniku. Smatra se da je odgovaraju}a interakcija izme|u C-kit i kit liganda neophodna za ovaj proces. Kada folikul dostigne veli~inu pri kojoj sadr`i od 3 do 6 slojeva granuloznih }elija, okru`uju}e tkivo se uslojava i diferencira na dva dela. Spoljni deo, theca externa je u osnovi sli~na stromalnom tkivu koje ga okru`uje. U unutra{njem delu, theca interna stromalne }elije se diferenciraju u epitelialne }elije. U ovoj fazi folikul je definisan kao preantralni folikul. Zna~ajan deo rastu}ih folikula ne uspeva da pre`ivi i oni degeneri{u procesom folikularne atrezije. Apoptoza je mehanizam folikularne atrezije.
Nakon faze primarnog folikula, gonadotropini, naro~ito FSH - follicle stimulating hormoni, imaju sve ve}u ulogu u podr`avanju folikularnog rasta. Folikularni rast i razvoj su podr`ani kombinovanim delovanjem FSH - follicle stimulating hormone-a i LH - luteinizing hormone-a na folikularne }elije. FSH - follicle stimulating hormone i LH - luteinizing hormone se vezuju za svoje specifi~ne receptore na povr{ini granuloze i tekalnih intersticijalnih }elija. Aktivacija FSHR follicle stimulating hormone receptor i LHR - luteinizing hormone receptor stimuli{e mitozu i odgovor granuloze i theca interna }elija. Nakon preantralne faze folikularni fluid po~inje da se gomila u folikulu {ire}i ga relativno brzo. Dominantni folikul se odabira iz cohort-a folikula i ~itava faza folikularnog rasta, koja zavisi od hormona, }e biti zavr{ena za oko 40-50 dana. Ovaj proces je hormonski kontrolisan. Estrogeni i gonadotropini inhibiraju, a androgeni podsti~u smrt ovarijalnih }elija. Procenjeno je da je do starosti od 30 godina gubitak folikula i oocita u ovarijumu uzrokovan atrezijom folikula. Posle dostizanja kriti~nog praga u broju folikula, procenjeno na 25.000, regrutovanje rastu}ih folikula se pove}ava dvostruko. Prema teoriji dve }elije - dva gonadotropina }elije granuloze i theca interne, kao i oba gonadotropina, su neophodni za ispravnu ovarijalnu steroidogenezu. Zbog LH - luteinizing hormone-a stimulacije, theca }elije proizvode androgene de novo. Aromatizacija androgena u estrogene se odvija u susednim granuloznim }elijama pod uticajem FSH - follicle stimulating hormone-a. Tokom lutealne faze, CL - corpus luteum proizvodi progesteron i estrogene.
55
Fiziolo{ke aktivnosti estrogena su regulisane enzimom 17 HSD - hydroxysteroid dehydrogenaze. Tip 1 - 17 HSD - hydroxysteroid dehydrogenaze je odgovoran za konverziju polnog steroida niske aktivnosti estrona E1 u potentniji oblik estradiol E2, dok enzim tipa 2 katali{e suprotnu reakciju. Enzim 17 HSD - hydroxysteroid dehydrogenaze tip 1 se ekspresuje u granuloznim }elijama i u CL - corpus luteum-u, dok prisustvo enzima tipa 2 nije utvr|eno. Uloga ovih enzima u CL- corpus luteum-u tokom ~itave lutealne faze je jo{ uvek nesigurna. Nedavno otkrivene mutacije FSH - follicle stimulating hormone-a i FSHR - follicle stimulating hormone receptor-a kod ljudi, su zna~ajno pro{irile na{e znanje o ulozi FSH - follicle stimulating hormone u reprodukciji. FSH - follicle stimulating hormone je apsolutno neophodan za ispravno funkcionisanje jajnika kod `ene. @ene koje su homozigotne na inaktiviraju}u mutaciju FSHR - follicle stimulating hormone receptor gena pokazuju hipergonadotropnu ovarijalnu disgeneziju, amenoreju i neplodnost. Osim toga, uzorci biopsije ovarijuma homozigotnih `ena pokazuju veliki broj primordijalnih i primarnih folikula sa jako retkim znacima daljeg folikularnog razvoja. Me|utim, mu{karci koji su homozigotni na FSHR - follicle stimulating hormone receptor mutaciju su slabije plodni uz ni`i broj spermatozoida i manju veli~inu testisa, {to nagove{tava da FSH - follicle stimulating hormone nije apsolutno neophodan za iniciranje spermatogeneze u pubertetu.
Perifolikularna vaskularnost
Perifolikularni protok krvi je pokazatelj folikularne heterogenosti i oocitne kompetencije i prediktor implantacije.
Angiogeneza, razvoj novih krvnih sudova, je opisana kao feto-onkogeni doga|aj po{to je osobina fetalnog razvoja koja se dovodi u vezu sa razvojem tumora. Kontrolisana cikli~na angiogeneza je na jedinstven na~in iskazana u reproduktivnom traktu odrasle `enske osobe. Angiogeneza, u `enskom traktu, se iskazuje u jajniku i endometrijumu. U jajniku se perifolikularna angiogeneza iskazuje progresijom folikula ka antralnom stadijumu, nastavlja posle ovulacije razvojem CL - corpus luteum i u odsustvu trudno}e, prestaje sa regresijom corpus luteum-a. Prekid angiogenskih doga|aja na jednom mestu jajnika je pra}en inicijacijom angiogenskih doga|aja na drugom mestu i razvojem novih folikula. Angiogeneza u endometrijumu prati implantaciju embriona. To je programiran doga|aj koji vodi ka razvoju placente, ali se povla~i, regresira u slu~aju neuspeha rane trudno}e. Primordijalni i preantralni folikuli su avaskularni. Razvoj antralnog folikula iz primordijalnog je pra}en diferencijacijom skvamoznih }elija primordijalnog folikula u karakteristi~no kubi~ne granulozne }elije i diferencijacijom slojeva tekalnih }elija iz ovarijalne strome. Ovi slojevi }elija, razdvojeni laminom su bitni za funkcionisanje folikula i daju veliki doprinos intra-folikularnoj sredini intereaguju}i u hormonalnoj kontroli folikularnog razvoja. Bezbrojne studije izve{tavaju o slo`enom nizu aktivnosti granuloznih }elija; steroidogenim aktivnostima, produkciji faktora rasta citokina, enzima, regulisanju proteina koji daju doprinos promenama mikrosredine oocit - folikul. Sa napretkom folikula ka antralnom stadijumu theca interna i eksterna sti~u vaskularizaciju koja sadr`i u sebi mre`u
56
kapilara. Ova mre`a kapilara, u folikularnoj fazi je potpuno ekstrafolikularna. Nakon ovulacije, dominantni folikul rupturira i po~inje formiranje CL - corpus luteum. Glavna funkcija CL - corpus luteum je da proizvodi progesteron u cilju pripreme endometrijuma za implantaciju. Tokom normalnih menstrualnih ciklusa je ovaj proces pod kontrolom pituitarnog LH - luteinizing hormone-a. U slu~aju trudno}e trofoblasti ranog embriona po~inju da proizvode HCG - human chorionic gonadotropin za odr`avanje CL - corpus luteum dok se ne okon~a luteo-placentalno pomeranje. Ako ne do|e do oplodnje, dolazi do regresije CL - corpus luteum-a u cilju omogu}avanja folikularnog razvoja i ovulacije u slede}em ovarijalnom ciklusu.
1.4. SPERMATOGENEZA
Kao i kod oocita, dolazi do reprogramiranja aktivnosti genoma tokom razvoja spermatozoida uz pove}anje nivoa metilacije DNK. Proces metilacije obuhvata razli~ite sekvence DNK koje su bile prepisivane, vezane za geneti~ku informaciju poreklom od oca, ili za one koje nisu uop{te bile aktivne kao {to su intracistenalne A ~estice IAP - intracisternal A particle. Humani MEST - PEG1 - mesoderm specific transcript - paternally expressed gene, demetili{e se tokom fetalnog `ivota ostaju}i nemetilisan kroz sve etape razvoja spermatozoida u zrelom dobu. Neki su analizirali nivo metilacije H19 - hystocom-
patibility gena kod mu{kih }elija zametka i otkrili da se H19 - hystocompatibility gen aktivira rano u razvoju }elija zametka pre nego {to do|e do mejoze. Isti rezultat je otkriven i kod ljudi gde je H19 - hystocompatibility gen postao metilisan pre mejoze u spermatogonijskoj etapi razvoja. Uop{teno gledano, manje je informacija o regulaciji genske aktivnosti za vreme razvoja spermatozoida u pore|enju sa onim {to se zna o oocitima. Nastavak mitotske deobe mu{kih }elija zametka u pubertetu se vremenski poklapa sa pove}anjem nivoa enzima DNK metil transferaze - Dnmt1 deoxyribonucleic acid methyltransferase u spermatocitima. Tokom ranih etapa mejoze, nivo Dnmt1s - deoxyribonucleic acid methyltransferase u spermatocitima je visok, ali je smanjenje nivoa Dnmt1 enzima bilo prime}eno u pahitenskoj etapi spermatocita. DNK metil transferaza Dnmt1s se u spermatozoidu normalno mo`e na}i u nukleusu i citoplazmi. Ekspresija DNK metil transferaze Dnmt3a - deoxyribonucleic acid methyltransferase u testisu se pove}ava pre ro|enja i tokom ranog postnatalnog `ivota, {to je suprotno sa nivoom ekspresije enzima DNK metil transferaze Dnmt3b - deoxyribonucleic acid methyltransferase koji je ni`i tokom embrionalnog `ivota i raste postnatalno. Enzim Dnmt3l deoxyribonucleic acid methyltransferase je potreban da bi do{lo do normalne mejoze i smirivanja retro transpozona. Gubitak Dnmt3a - deoxyribonucleic acid methyltransferase rezultuje sli~nim fenotipom.
57
Sl. 2.26- Genitalni trakt `ene: 1. ovarium, 2. orifitium externi tubae, 3. fimbriae, 4. tuba, 5. pars ampularis tubae, 6. miometrium uteri, 7. endometrium uteri, 8. cervix uteri, 9. portio uteri, 10. vagina, 11. lig.ovarii proprium, 12. lig.suspensorium ovarii, 13. stadijumi folikula ovarijuma
58
Sl.2.27 - Koncentracije hormona u toku ciklusa: FSH - folikul stimuliraju}i hormon, E 2 estradiol, Pr progesteron, LH - luteiniziraju}i hormon
Koncentracija luteiniziraju}eg hormona oko 38 ~asova pre rupture De Graff ovog folikula naglo se pove}ava grade}i LH - luteinizing hormone peak {to ima za posledicu izazivanje ovulacije i postizanje optimalne sredine za oplodnju. Pove}ava se i koncentracija FSH - follicle stimulating hormone-a. LH - luteinizing hormone peak u oocitu aktivira zavr{etak prve mejoze i po~etak druge.
Ovulacija je osloba|anje sekundarnog oocita iz De Graff - ovog folikula nakon rupture zida.
2.1. OVULACIJA
U folikulu istovremeno dolazi do pove}anja rastresitosti granuloznih }elija i postepenog osloba|anja cumulus oophorus - a, pove}anja koncentracije progesterona u folikularnoj te~nosti i do pove}anja vaskularizacije perifolikularnog tkiva. Kao posledica ovih promena ostium tuba se plasira na ovarijalnu povr{inu, dolazi do rupture folikula i izlivanja folikularne te~nosti sa oocitom u njen kanal. Razvoj ostalih folikula se zaustavlja.
Granulozne }elije osloba|aju hijaluronsku kiselinu {to dovodi do naglog pove}anja folikularne te~nosti i uz dodatno dejstvo liti~nog enzima do rupture zida
59
Sl. 2.29 - Mehanizam prihvatanja oocita: 1. ovarium, 2. folikul pred rupturom, 3. orificijum tube, 4. fimbrije, 5. tuba, 6. lig.ovarii proprium, 7. lig.suspensorium ovarii
folikula. Pred samu rupturu prime}uje se na zidu beli~asta ta~ka, stigma koja nastaje zbog kompresije krvnih sudova zida folikula. Fimbrije tube se postavljaju oko stigme {to je omogu}eno prethodnom rotacijom tube uz pomo} lig.suspensorium ovarii i lig.ovarii proprium. Nakon rupture folikula folikularna te~nost sa oocitom ulazi u tubarni kanal ~ime je faza ovulacije zavr{ena. To je omogu}eno pripajanjem fimbrija uz ovarijum.
Sl. 2.31 - Oocit - kumulus kompleks prihva}en od tube: 1. tuba, 2. fimbrije, 3. folikularna te~nost, 4. sekundarni oocit sa corona radiata, 5. ovarium sa atreti~nim folikulima, 6. zona pellucida, 7. prvo polarno telo, 8. sekundarni oocit, 9. corona radiata, 10. deobno vreteno u arestu
U tubi je sekundarni oocit okru`en coronom radiatom i folikularnom te~no{}u sa hialuronskom kiselinom koja je zbog toga lepljiva. Frekvencija ciliarnog trakta CBF - ciliary beat frequency detektovana nakon ovulacije poma`e odvajanje oocita i transport
60
du` Falopijeve tube. Stimulus je nepoznat, mada se zna da na CBF - ciliary beat frequency imaju uticaj hormoni. Kako se za vreme ovulacije osloba|a folikularni fluid i ulazi u Falopijevu tubu pretpostavka je da je ovaj fluid stimulus pove}anja CBF - ciliary beat frequency koje se prime}uje nakon ovulacije. Ispitivanja pomo}u tehnike koja snima promene intenziteta svetlosti su pokazala da se u kontaktu tube sa folikularnim fluidom pove}ava frekvencija epitelijalnih }elija CBF - ciliary beat frequency Falopijeve tube. Tako|e je postojala i zna~ajna razlika pove}anja CBF - ciliary beat frequency epitela tube potopljenog u sekretorni u pore|enju sa peritonealnim fluidom iz proliferativne faze.
Sl. 2.32- Oocit nakon ovulacije: 1. sekundarni oocit u metafazi druge mejoze, 2. corona radiata, 3. folikularna te~nost, 4. kumulusne }elije
Oocit u tubi ~eka na oplodnju spermatozoidom lokalizovan matriksom hialuronske kiseline. Postepeno veza slabi i oocit se pomera ka uterusu cilijarnim pokretima tubarnog epitela. Do oplodnje dolazi u nekoliko narednih ~asova.
Sl. 2.33- Cervikalni kanal pre i u vreme ovulacije: 1. spermatozoidi, 2. sluz jako isprepletana, 3. kripte cervikalne `lezde, 4. rastresita sluz, 5. ulaz u cerviks
61
Sluz postaje rastresita i te~nija sa alkalnim pH vrednostima. Smatra se da pasa`a cerviksa ima selektivnu ulogu, jer zadr`ava biolo{ki manje vredne spermatozoide.
Sl. 2.34- Histolo{ki presek cervikalnog kanala u vreme ovulacije: 1. epitel koji stvara mukus, 2. cervikalni kanal, 3. nabori sluzoko`e, 4. kripte
Nabori cervikalnog epitela formiraju kripte u kojima se skuplja sluz i nazivaju se cervikalnim `lezdama. U fazi ovulacije su pro{irene i produbljene, pa se u njima ~esto zadr`avaju spermatozoidi i po nekoliko dana.
Hiperaktivnost spermatozoida ste~ena u fazi kapacitacije mu omogu}ava sve dalju penetraciju u pravcu zone pellucide.
62
Spermatozoid istovremeno osloba|a enzim hialuronidazu koja rastvara intercelularni matriks izme|u kumulusnih }elija prodiru}i sve dublje kroz kumulus.
U daljem prodiranju kroz zonu pellicidu oocita va`nu ulogu igra enzim akrozin. Ostaci spolja{nje membrane se otklanjaju hiperaktivnim pokretima spermatozoida.
Sl. 2.40- Akrozomska reakcija - otklanjanje ostataka spolja{nje membrane: 7 ostaci spolja{nje membrane
Kada spermatozoid dodirne zonu pellucidu prednjim delom glave, akrozomom, inducira se osloba|anje enzima - zona protein 3 i uspostavlja akrozomska reakcija. Pri tome se spolja{nja membrana spermatozoida razara i kroz formirane pore izlazi enzimski sadr`aj akrozomne vezikule.
U zavr{noj fazi akrozomske reakcije akrozom spermatozoida je samo pokriven unutra{njom membranom, sa aktiviranim postakrozomskim delom membrane radi spajanja sa samom jajnom }elijom.
Sl. 2.42- Spermatozoid u perivitelinskom prostoru oocita: 1. postakrozomski deo membrane, 2. oolemma, 3. perivitelinski prostor, 4. zona pellucida
63
Sl. 2.43 - Spajanje spermatozoida i ooleme: 1. postakrozomski deo membrane, 2. oolemma, 3. perivitelinski prostor, 4. zona pellucida
Sadr`aj spermatozoida prelazi kompletno u citoplazmu oocita. U daljem procesu dolazi do formiranja fertilizacione opne promenom zone pellucide i ooleme ~ime nastaje polispermi~ni blok. U oocitu se zavr{ava druga mejoti~ka deoba i po~inje aktivacija, na molekularnom nivou oocita, o~eve DNK - deoksiribonukleinske kiseline.
Sl. 2.45- Polispermi~ni blok: 1.zona pelucida, 2. perivitelinski prostor, 3. kortikalni vezikuli, 4. oolemma
Na spermatozoidu dolazi do gubitka }elijske membrane glave i srednjeg dela, a kod oocita nestaje oolemma {to omogu}ava spajanje struktura spermatozoida i oocita, {to se naziva impregnacija oocita. Membrana repa spermatozoida ostaje.
Da bi se onemogu}io prodor drugih spermatozoida u oolemi dolazi do trenutne depolarizacije sa promenom povr{ine membrane i aktiviranjem vezikula koji izbacuju svoj sadr`aj u perivitelinski prostor {to dovodi do zadebljanja zone pellucide koja postaje nepropustljiva za ostale spermatozoide ~ine}i polispermi~ni blok.
Sl. 2.46- Impregnacija oocita: 1.oolemma, 2. }elijska membrana spermatozoida, 3. kinozillium, 4. kompaktno jedro spermatozoida, 5. centrozom spermatozoida
U glavi spermatozoida se nalazi kondenzovan DNK - deoksiribonukleinska kiselina. Centrozom koji je popre~no postavljen je citoplazmati~na organela koja u kasnijim
64
fazama igra va`nu ulogu. Kinozilium ostatak repa spermatozoida nestaje u kasnijoj fazi. Smatra se da sve mitohondrije sa o~eve strane bivaju eliminisane, tako da su sve mitohondrije novog organizma u normalnim uslovima maj~ine. U trenutku impregnacije oocita sekundarni oocit je u metafazi druge mejoti~ke deobe sa aretiranom podelom deobnog vretena. Signal koji nastaje pri tome aktivira nastavak druge mejoze.
U narednih 2 sata nakon impregnacije oocita zavr{ava se podela sa formiranjem ovum-a, zrelog oocita i drugog polarnog tela koji ostaje u perivitelinskom prostoru i podele prvog polarnog tela na dva dela.
Sl. 2.48 - Formiranje ovum-a: 1. prvo polarno telo, 2. jedro spermatozoida, 3. centrosom, 4.drugo polarno telo, 5. deobno vreteno sa hromozomima
Sl. 2.47 - Sekundarni oocit u vreme procesa impregnacije: 1. deobno vreteno, 2. prvo polarno telo, 3. zona pellucida, 4. perivitelinski prostor, 5. } e l i j s k a memb ran a s p e rma to zo ida, 6. kinozillium, 7. kompaktno jedro spermatozoida, 8. centrozom spermatozoida
65
Formirani aster trasira stazu kopulacije, odnosno put pribli`avanja oba pronukleusa.
Sl. 2.49 - Stadijum pronukleusa: 1. mu{ki pronukleus, 2. `enski pronukleus, 3. centrozom, 4. polarno telo
Spajanje mu{kog i `enskog pronukleusa se de{ava u narednih 12 do 18 ~asova. Sinteza DNK - deoksiribonukleinske kiseline omogu}ava me|usobnu kombinaciju naslednih faktora roditelja - amphimixis, sa formiranjem novonastalog jedra amphinucleus - a. Pribli`avanje oba pronukleusa de{ava se uz pomo} mikrotubula koji se formiraju odmah nakon impregnacije oocita. Neposredno uz mu{ki pronukleus iz centrozoma formira se aster iz vi{e mikrotubula i zvezdasto projektuje. Proteini iz kojih se stvaraju mikrotubuli su iz citoplazme oocita.
Sl. 2.51 - Formiranje astera: 1. mu{ki pronukleus, 2. `enski pronukleus, 3. centrozom, 4. inner bodies, 5. aster
Pronukleusi se pribli`avaju i uve}avaju, jer po~inje sinteza DNK - deoksiribonukleinske kiseline u oba pronukleusa sa dupliranjem hromozoma, koja traje oko 12 ~asova. Oba pronukleusa nose diploidan broj hromozoma. Istovremeno se deli centrozom.
66
Oba pronukleusa gube svoje jedarne membrane, diploidni broj hromozoma od svakog roditelja se raspore|uje u deobno vreteno u ekvatorijalnoj ravni i po~inje formiranje zigota, prve }elije embriona sa svojim individualnim genomom. To se de{ava nakon 22 ~asa od trenutka oplodnje. (Sl. 2.54)
Nakon 23 sata od oplodnje deobno vreteno nastalo iz oba pronukleusa se nalazi u anafazi. Mitoza se nastavlja do dvo}elijskog stadijuma kada se formiraju prve dve }elije embriona. Ova faza od oplodnje do dvo}elijskog stadijuma traje u proseku izme|u 22 i 26 ~asova.
Sl. 2.54- Zigot: 1. jedarna membrana pronukleusa nestaje, 2. mikrotubuli deobnog vretena
]elijska deoba se nastavlja u ritmu od oko 12 ~asova tako da oko ~etvrtog dana od oplodnje nastaje morula koja ima oko 30 }elija blastomera. Morula je jo{ uvek okru`ena zonom pelucidom tako da ukupna veli~ina nije velika. Svaka novonastala }elija je upola manja od }elije iz koje nastaje. U daljoj fazi deobe novoformirane }elije postaju sve kompaktnije povezuju}i se tight vezama i gap vezama. U unutra-
67
{njosti se stvara {upljina ispunjena te~no{}u. Na blastocisti koja se formira jasno se raspoznaje embrioblast - unutra{nja }elijska masa i trophoblast - spolja{nja }elijska masa.
Na kraju petog dana od oplodnje pod delovanjem enzima i ekspanzionih kontrakcija rupturira zona pellucida i embrion izlazi iz nje. To je hatching.
Sl. 2.57- Blastocista: 1. embrioblast (ICM - inner cell mass), 2. zona pellucida, 3. trophoblast, 4.{upljina blastociste - blastocoel
Sl. 2.59- Spontani hatching: 1. zona pellucida, 2. trophoblast, 3. hypoblast deo unutra{nje }elijske mase, 4. {upljina blastociste - blastocoel, 5. epiblast
68
Sl. 2.60- Migracija embriona kroz tubu: 1. ovarium, 2. tuba, 3. endometrium, 4. myometrium, 5. cavum uteri, A dan 0 koncepcija oocita, B dan 1 dvo}elijski stadijum, C dan 2 ~etvoro}elijski stadijum, D dan 3 osmo}elijski stadijum, E dan 4 morula, F dan 6 blastocista nakon hatching - a
69
dinca uz gre{ke koje ponekad rezultuju neodgovaraju}om transkripcijom gena i represijom. U genomu sisara, ve}ina ostataka citozina prona|ena kao CpG dinukleotidi citozini pozicionirani pored ostataka guanina, ima dodatu metil grupu na poziciji njihovih ugljenika 5. Ovo dodavanje metil grupe, koje se naziva DNK - deoksiribonukleinske kiseline metilacija je klju~ni mehanizam regulacije imprintinga. Va`no je naglasiti da ve}ina metilisanih DNK - deoksiribonukleinske kiseline genoma nema u~e{}e u genomskom imprintingu. Metilacija DNK - deoksiribonukleinske kiseline rezultuje kondenzovanijom strukturom koja je otporna na transkripciju. Ako se nasledi metilisana kopija gena od majke i nemetilisana kopija od oca, maj~inska kopija }e represovati svoju transkripciju ostavljaju}i o~evu kopiju kao jedini aktivni gen. DNK - deoksiribonukleinska kiselina metilacija je epigenetska modifikacija koja se mo`e naslediti na stabilan na~in, ali je
tako|e mogu}a i reverzibilna, dozvoljavaju}i da se polno specifi~ni modeli iniciraju u }elijama zametka. Genomski imprinting je evoluirao. Teorija koja obja{njava razvoj genomskog imprintinga je genetski konflikt, ili teorija roditeljskog ulaganja, investmenta. Ova teorija je proizi{la iz zapa`anja da je veliki broj imprintiranih gena upleten u rast i razvoj fetusa. Isto tako imprintirani geni ispoljavaju direkcionalnost u svom delovanju, jer ve}ina o~inski ekspresovanih gena, kao {to su Igf 2 - insulin like growth factors i Peg 3 - polyethylene glycol potpoma`u rast fetusa i konzumiranje hranljivih supstanci, dok su maj~inski ekspresovani geni, kao {to su Igf 2R - insulin like growth factors i GNAS - guanine nucleotide binding protein alpha stimulating, skloni ko~enju rasta fetusa. @ene koje bi mogle ograni~iti rast fetusa i koje bi mogle proizvesti vi{e potomaka iz ograni~enih resursa bi, dugoro~no gledano, bile mnogo
70
uspe{nije. Suprotno ovome, mu`jaci bi imali dugoro~ne koristi od njihovih potomaka, koji bi bili brojniji i ve}i, pa ~ak iako su ovo ostvarili na {tetu `enke tako {to se koriste ve}e koli~ine maj~inih hranljivih suspstanci. Alternativna teorija koja uklju~uje i prisustvo imprintiranih gena u genomu je model evolutivnosti. Ova teorija polazi od toga da su vrste kod kojih postoji genomski imprinting sposobnije da evoluiraju kao odziv na pritiske okoline, po{to mogu podstaknuti brze promene putem izmene alela
koja je umirena i one koja je ekspresovana. Pojedina~ni organizam mo`e nositi alel koji potpoma`e rast i koji dok se imprintira nema fenotipne uticaje. Ako poja~ani rast postane prednost, relevantni alel je ve} prisutan u pool-u gena i brzom reverzijom imprintinga alel mo`e biti ekspresovan. Postoji i teorija koja smatra da je genomski imprinting evoluirao da za{titi `enku od oboljenja jajnika. Imprinting bi mogao ograni~iti rast i razvoj bilo kog partenogenetskog embriona unutar jajnika i na taj na~in spre~io formiranje malignog trofoblasta.
71
Modeli metilacije DNK - deoksiribonukleinske kiseline su razli~iti. DNK - deoksiribonukleinske kiseline metiltransferaze Dnmts - deoxyribonucleic acid methyltransferase obavljaju metilaciju DNK - deoksiribonukleinske kiseline. Mogu se uop{teno podeliti na familije; Dnmt 1 - deoxyribonucleic acid methyltransferase, Dnmt 2 - deoxyribonucleic acid methyltransferase i Dnmt 3 - deoxyribonucleic acid methyltransferase. Ove tri familije su povezane, ali ne blisko i veruje se da su se odvojile od zajedni~kih predaka pre separacije na `ivotinjski i biljni svet. ^lanovi familije Dnmt 1 - deoxyribonucleic acid methyltransferase i Dnmt 2 deoxyribonucleic acid methyltransferase su identifikovani kao oni koji imaju aktivno delovanje transmetilaze i njihove funkcije su delimi~no razja{njene, a familija Dnmt 3 - deoxyribonucleic acid methyltransferase je primarno uklju~ena u postavljanje novih modela metilacije. Smatra se da je familija Dnmt 1 - deoxyribonucleic acid methyltransferase uklju~ena u odr`avanje ovih modela tokom deobe }elija. Inicijalne studije kod familije Dnmt 2 - deoxyribonucleic acid methyltransferase nisu na{le nikakvu aktivnu funkciju metilacije, ali je nedavno istra`ivanje otkrilo da ovaj enzim mo`e da deluje kao metiltransferaza koja je odre|ena za veoma specifi~nu sekvencu DNK - deoksiribonukleinske kiseline {to obja{njava nizak nivo aktivnosti koju je mogu}e identifikovati. Iako je sposobna da se ve`e za metilisanu DNK - deoksiribonukleinska kiselina, definitivna specifi~nost vezivanja Dnmt 2 - deoxyribonucleic acid methyltransferase tek treba da bude utvr|ena. Postavljanje modela metilacije je bilo posebno ispitivano. Da bi dozvolio reprogramiranje }elije
zametka, genom se mora podvrgnuti demetilaciji. Kada se uklone inicijalni otisci, novi odgovaraju}i modeli moraju biti uspostavljani da bi se osiguralo postavljanje o~inskih i maj~inskih specifi~nih otisaka u spermatozoide i oocite. Enzimi koji su sposobni za postavljajne novih metil grupa na prethodno nemetilisanu DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu su iz familije Dnmt 3 - deoxyribonucleic acid methyltransferase. ^lanovi ove familije koji imaju aktivno transmetilazno delovanje su Dnmt 3a - deoxyribonucleic acid methyltransferase i Dnmt 3b - deoxyribonucleic acid methyltransferase. Oba enzima imaju visok stepen homologije sekvenci, ali razli~ite modele ekspresije i vremena pojavljivanja tokom razvoja. Tre}i ~lan ove familije, Dnmt 3l - deoxyribonucleic acid methyltransferase, ima istu homologiju sekvenci kao i ostali enzimi, ali nema kataliti~ki domen koji je potreban za dodavanje metil grupa na DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu. Smatra se da ima ulogu u uspostavljanju maj~inskih otisaka u oocitu. Odr`avanje metilacije je dodavanje metil grupe na ve} nemetilisanu DNK deoksiribonukleinsku kiselinu tokom replikacije }elija, {to je neophodno da bi }elije }erke odr`avale model metilacije u }eliji koja se podvrgla mitozi. Dnmt 1 - deoxyribonucleic acid methyltransferase je primarno odgovorna za odr`avanje metilacionog statusa DNK deoksiribonukleinske kiseline. Uobi~ajeni oblik ove metiltransferaze je onaj koji se nalazi kod svih somatskih }elija i to je Dnmt 1 - deoxyribonucleic acid methyltransferase. Postoje dve spojne varijante koje su identifikovane i koje su specifi~ne za }elije zametka i rani embrion. Dnmt 1p deoxyribonucleic acid methyltransferase je
72
prona|en kod spermatozoida, dok je Dnmt 10 - deoxyribonucleic acid methyltransferase mogu}e identifikovati samo kod oocita i preimplantacionog embriona. Tek nakon sedmog dana, E7, embrion je sposoban da proizvede protein Dnmt 1s deoxyribonucleic acid methyltransferase u punoj du`ini. Zanimljivo je da, iako je Dnmt 1 - deoxyribonucleic acid methyltransferase identifokovan kao glavna metilaza za odr`avanje in vivo u in vitro uslovima, studije su pokazale da ovaj enzim ima vi{u metilaznu aktivnost od Dnmt 3 - deoxyribonucleic acid methyltransferase i Dnmt 3b - deoxyribonucleic acid methyltransferase. Metilacija vodi ka represivnoj transkripciji gena. Postoje dva glavna mehanizma putem kojih metilacije DNK - deoksiribonukleinske kiseline mogu spre~iti transkripciju gena. Kod prvog mehanizma metil grupa izaziva direktne smetnje i spre~ava odre|ene faktore transkripcije da se ve`u za metilisanu DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu. Drugi mehanizam rezultuje iz vezivanja metilvezivnih domenskih proteina MBD methyl cytosine guanine binding domain za metilisanu DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu. Od svih MBD - methyl cytosine guanine binding domain proteina do danas su identifikovani MBD 1 - methyl cytosine guanine binding domain, MBD 2 - methyl cytosine guanine binding domain, MBD 3 methyl cytosine guanine binding domain i MeCP 2 - methyl cytosine guanine binding protein. Oni u~estvuju u represiji transkripcije, dok se za MBD 4 - methyl cytosine guanine binding domain protein misli da ima ulogu proteina za popravku pogre{nog uparivanja. MBD 1 - methyl cytosine guanine binding domain i MeCP 2 - methyl
cytosine guanine binding protein sadr`e transkripcione represione domene koji deluju preko HDAC - histone deacetylase. HDAC - histone deacetylase izaziva lokalnu deacetilaciju histonske pratnje {to rezultuje remodeliranjem hromatina u ne{to kondenzovaniju strukturu koja je otporna na transkripciju. MBD 1 - methyl cytosine guanine binding domain posreduje u transkripcionoj represiji putem regrutovanja histonmetilaze sposobne da se ve`e za HDAC - histone deacetylase, dok MeCP 2 - methyl cytosine guanine binding protein deluje na vezivanje korepresorskog kompleksa koji sadr`i HDAC - histone deacetylase, mada se pokazalo da MeCP 2 - methyl cytosine guanine binding protein izaziva represiju transkripcije u odsustvu aktivnosti HDAC - histone deacetylase. MBD 2 - methyl cytosine guanine binding domain i MBD 3 - methyl cytosine guanine binding domain su komponente velikog proteinskog kompleksa MeCP 1 methyl cytosine guanine binding proteina koji vezuje DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu na nesekvenciono specifi~ni na~in. Vezivanje MECP 1 - methyl cytosine guanine binding proteina za metilisanu DNK deoksiribonukleinsku kiselinu je omogu}eno prisustvom MBD 2 - methyl cytosine guanine binding domain u kompleksu. Zanimljivo je da se MBD 3 - methyl cytosine guanine binding domain ne vezuje direktno za metilisanu DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu. MeCP 1 - methyl cytosine guanine binding protein kompleks vezuje metilisanu DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu manje ~vrsto nego MeCP 2 - methyl cytosine guanine binding protein {to nagove{tava da dugoro~na transkripciona represija mo`e biti odr`avana stalnim vezivanjem MeCP 2 - methyl cytosine gua-
73
nine binding proteina uz jo{ kratkotrajnije transkripciono smirivanje koje je odre|eno vezivanjem MeCP 1 - methyl cytosine guanine binding protein kompleksa. Osim MBD - methyl cytosine guanine binding domain familije postoji jo{ jedan vezuju}i protein nazvan Kaiso ~ija represija transkripcije gena zavisi od metilacije. Iako ovaj protein ne sadr`i MBD methyl cytosine guanine binding domain sposoban je da se ve`e za metilisanu DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu pomo}u cinka koji sadr`i. Transgenske studije pokazuju da kod nedostatka MBD 1 - methyl cytosine guanine binding domain dolazi do poreme}aja u nervnom sistemu na molekularnom nivou. Bez MBD 2 - methyl cytosine guanine binding domain mogu} je rast i razvoj. Mutacije bez MBD 3 - methyl cytosine guanine binding domain su smrtonosne po embrion. Abnormalni fenotip bez MeCP 2 methyl cytosine guanine binding proteina po~inje da se razvija pri starosti od nekoliko nedelja i postaje smrtonosan do 8. nedelje. Nedostatak MBD 1 - methyl cytosine guanine binding domain, MBD 2 - methyl cytosine guanine binding domaini MBD 3-methyl cytosine guanine binding domain nagove{tava postojanje odre|enog stepena suvi{nosti u sistemu MBD - methyl cytosine guanine binding domain posredovane transkripcione kontrole. Iako je nedostatak MBD 2 - methyl cytosine guanine binding domain i MeCP 2 - methyl cytosine guanine binding protein pokazao da oba ova proteina funkcioni{u odvojenim putanjama, ovo ne odbacuje kooperaciju izme|u ostalih ~lanova MBD - methyl cytosine guanine binding domain familije. Genomski imprinting kod primordijalnih germinativnih }elija zametka je detaljno ispitan. Kada se primordijalne
}elije zametka PGC - primordial germ cells, prvi put vide kod embriona sedmog dana od oplodnje, one kao i okru`uju}e somatske }elije, nose nasle|ene modele otisaka majke i oca. Ovaj DNK - deoksiribonukleinske kiseline metilacioni model se odr`ava u PGC - primordial germ cells dok migriraju u gonade koje su u razvitku. PGC - primordial germ cells podle`u globalnoj demetilaciji od E 11, 5 dana, da bi se uklonili nasle|eni imprinting modeli. Tokom ovog perioda odr`ava se DNK deoksiribonukleinske kiseline metilacija somatskih }elija. O~igledno je da je demetilacija }elija zametka od vitalnog zna~aja za kasnije postavljanje ta~ne polno specifi~ne epigenetske informacije tokom sazrevanja oocita i spermatozoida. Demetilacija je kompletirana do E 13 - 14 dana, {to odgovara periodu kada mu{ke i `enske PGC primordial germ cells po~inju da ulaze u mitotski i mejotski zastoj. Smatra se da mitotski i mejotski zastoj mo`e slediti demetilaciju, jer replikacija nemetilisane DNK - deoksiribonukleinske kiseline ima povi{en rizik od kretanja nerepresovanih retrotranspozona i izazivanja mutacija. ^ini se da je vreme u kojem se odvija ova demetilacija, kao i koli~ina izgubljene metilacije, identi~na bez obzira na pol embriona. Da li se gubitak metilacije odvija pasivnim ili aktivnim mehanizmom ili kombinacijom oba, jo{ uvek nije poznato, mada bi brzina kojom se ovo odvija nagovestila u~estvovanje aktivnog mehanizma. Materinski i o~inski imprinti se postavljaju tokom razvoja }elija zametka tako da je, do trenutka kada su oociti i spermatozoidi potpuno sazreli, ta~an {ablon DNK - deoksiribonukleinske kiseline metilacije prisutan na genomu kao {to je prikazano na slici br.2.64.
74
Nakon oplodnje se oba roditeljska genoma podvrgavaju globalnoj demetilaciji sekvenci koje nisu imprintovane. Imprintovani geni su za{ti}eni od ovog procesa. Tokom ranog razvoja embriona imprintovani geni somatskih }elija i PGC - primordial germ cells zadr`avaju roditeljske imprinte. Od E 11 dana se primordijalne }elije zametka podvrgavaju demetilaciji radi brisanja nasle|enih roditeljskih imprinta, ali somatske }elije embriona zadr`avaju roditeljske imprinte tokom razvoja embriona sve do odraslog doba. Proces demetilacije PGC - primordial germ cells je kompletiran do E 13 dana. Reprogramiranje }elija zametka, koje }e uslediti, po~inje da se odvija kada se jo{ jednom postave polno specifi~ni modeli imprintinga. Gre{ke u genomskom imprintingu se mogu desiti prirodnim putem, ili tokom
ljudske intervencije, jer je genomski imprinting osnovni mehanizam koji je od vitalnog zna~aja za mnoge aspekte razvoja. Tokom poslednjih nekoliko godina porasla su genomska istra`ivanja kod dece ro|ene uz pomo} neke od tehnika asistirane reprodukcije. Otkriveno je nekoliko slu~aja dece ro|ene sa AS - Angelman - ovim sindromom kao i BWS - Beckwith Wiedemann syndrome. Kod dece koja su imala BWS - Beckwith Wiedemann syndrome je bio uspostavljen metilacioni status na genima H 19 i LIT 1 latroinsectotoxins, dok je samo jedno dete pokazivalo normalne metilacione modele na oba ova gena. Uzrok veze izme|u ART -assisted reproductive technology i poreme}aja imprintinga trenutno nije poznat. Mogu}e je da je uzrok u nekom aspektu tehnike asistirane reprodukcije koja je u
75
odre|enom slu~aju primenjena. Odgovor treba tra`iti u izlo`enosti jedne, ili obe grupe }elija zametka izmenjenom hormonalnom re`imu in vivo, vremenskom periodu uzgajanja, i mehani~koj manipulaciji. Bilo kakve izmene normalnog okru`enja oocita, ili spermatozoida mogu rezultovati izmenama nekog aspekta njihovih mehanizama imprintinga. Me|utim, uzrok mo`e biti i gre{ka u samim }elijama zametka koje su kori{}ene, s obzirom da parovi koji su u programima ART - assisted reproductive technology imaju smanjenu prirodnu plodnost. Potencijalni problemi se ne zavr{avaju sa }elijama zametka. Kod preimplantacionog embriona u periodu boravka u kulturi mo`e se izmeniti epigenetsko reprogramiranje koje se odvija u ovim ranim etapama. Ako spermatozoidi kori{}eni za in vitro oplodnju imaju ni`e globalne nivoe metilacije, nema izmena ni u broju oplodnji ni u kvalitetu ranog embriona. Ali kako postoji smanjenje broja trudno}a to ukazuje na zna~aj normalne metilacije DNK - deoksiribonukleinske kiseline gameta za razvoj embriona i kona~an ishod ART - assisted reproductive technology. Pokazalo se da spermatozoidi dobijeni od mu{karaca sa malim brojem spermatozoida usled abnormalne spermatogeneze, imaju neispravan genomski imprinting, mada se takvi spermatozoidi mogu upotrebiti u ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. Neki istra`iva~i su otkrili da je, iako su maj~inski imprintinzi obrisani iz svih spermatozoida, o~inski metilisani gen H 19 bio nedovoljno metilisan kod nekih spermatozoida dobijenih od oligozoospermi~nih mu{karaca. Svaki embrion dobijen od hipometilisanih spermatozoida bi mogao imati neodgovaraju}u ekspresiju imprintovanih gena H 19 i IGF 2 - insulin like growth factor.
U nekim slu~ajevima se mogu pojaviti gre{ke imprintinga koje nisu smrtonosne po embrion, ali izazivaju abnormalne fiziolo{ke procese i bolesti. Takve bolesti se mogu pojaviti kada imprintovani gen ostane hipermetilisan ili hipometilisan. Dejstvo nije uvek ograni~eno na gubitak funkcije jednog gena i neki imprintovani geni uti~u na ekspresiju drugih gena, kao {to su H 19 i IGF 2 - insulin like growth factor. PWS - Prader-Willi syndrome i AS Angelman syndrome su primeri poreme}aja koji se mogu pojaviti kada do|e do gubitka pravilnog imprintinga. Gubitak jednog, trenutno neidentifikovanog, imprintovanog gena rezultuje Prader-Willijevim sindromom kada je brisanje o~inski nasle|eno, dok iste gre{ke izazivaju Angelmanov sindrom prilikom maj~inskog prenosa. Ostali primeri oboljenja, koja su rezultat nepravilnog otiskivanja, uklju~uju BWS - Beckwith Wiedemann syndrome, Silver-Russel-ov sindrom i prolazni neonatalni dijabetes mellitus. Bolesti, tako|e, mogu biti rezultat defekata mehanizama koji reguli{u imprinting. Jedna od klju~nih grupa enzima sa ulogom u genomskom imprintingu su Dnmt deoxyribonucleic acid methyltransferase enzimi koji su odgovorni za dodavanje metil grupa na DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu. Kada se pojave problemi u ovom aspektu mehanizma imprintovanja, to mo`e dovesti do bolesti. Jedna od mogu}nosti je nestabilnost centromerske regije i sindrom facijalnih anomalija koji je rezultat mutacije na Dnmt 3b - deoxyribonucleic acid methyltransferase. Jo{ jedna va`na komponenta mehanizma imprintinga je familija metil-vezuju}ih domenskih proteina. MeCP 2 - methyl cytosine guanine binding protein je protein
76
koji sadr`i metil-vezuju}i domen. On ima ulogu u kontrolisanju transkripcije imprintovanih gena putem njegove sposobnosti da se ve`e za metilisanu DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu. Zna~aj ovog proteina za normalan razvoj i fiziolo{ku funkciju je postojanje Rett-ovog sindroma kada MeCP 2 - methyl cytosine guanine binding protein pro|e kroz mutiranje. Postoje neke bolesti sa vi{estrukim uzrocima kod kojih su samo u nekim slu~ajevima upletene gre{ke mehanizma imprintinga, ili izmene imprintovanih gena. Kancer je jedna takva bolest i neki slu~ajevi su identifikovani sa uzrokom koji je povezan sa genomskim imprintingom, dok su brojne ostale karakteristike ove bolesti zbog drugih problema. Otkriveno je da su }elije tumora preterano ekspresovale jedan, ili vi{e Dnmt 1s deoxyribonucleic acid methyltransferase 1s, 3a i 3b. Najvi{e ekspresovan je bio Dnmt 3b - deoxyribonucleic acid methyltransferase. Ovi rezultati podupiru prethodna zapa`anja
o abnormalnim nivoima metilacije koji se mogu videti kod }elija tumora. Kancer koji pokazuje vi{e nivoe Dnmt - deoxyribonucleic acid methyltransferase je akutna milejoidna leukemija. Mogu}e je da je ova preterana ekspresija Dnmt - deoxyribonucleic acid methyltransferase enzima va`na za hiper metilaciju i smirivanje gena supresora tumora. Genomski imprinting je mehanizam kontrole transkripcije gena i od vitalnog je zna~aja za normalno i zdravo potomstvo. Iako je poslednjih nekoliko godina preduzet ogroman rad na rasvetljavanju mehanizama koji se kriju iza genomskog imprintinga, jo{ uvek ima puno pitanja na koja ne postoje odgovori. Pored toga, znanje o genomskom imprintingu mo`e pomo}i u razumevanju nekih bolesti kod ljudi i mo`e ponuditi potencijalne terapije. Tehnike asistirane reprodukcije}e ,tako|e, imati koristi od boljeg razumevanja genomskog imprintinga {to }e rezultirati ve}im stepenom uspeha i najva`nije, bezbednijim ishodom.
77
3. IMPLANTACIJA
Osnovna uloga uterusa je prihvatanje embriona i kasnije odr`avanje fetusa u toku trudno}e. Uterus se sastoji od troslojnog zida, spolja{njeg - tunica seroza ili perimetrium, srednjeg - tunica muscularis ili miometrium i unutra{njeg epitelnog-endometrium. Endometrium je mesto implantacije. U njemu se odigravaju cikli~ne morfolo{ke i funkcionalne promene koje su direktno zavisne od seksualnih hormona.
Sl. 2.65- Uterus: 1. corpus uteri, 2. cavitas uteri, 3. cervix uteri, 4. canalis cervicis, 5. isthmus uteri, 6. pars interstitialis, 7. tuba uterina, A- epithel endometri, B - epithel cervicis, E - endometrium, M -myometrium
78
Endometrium sadr`i mnogobrojne `lezde, glandulae uterinae. Epitel je jednoslojan, prizmati~an i ~ine ga tri razli~ita tipa }elija: sekretorne }elije, cilijarne }elije i bazalne }elije. Ispod se nalazi stroma sa
krvnim sudovima. Endometrium se za vreme fertilne faze `ivota `ene cikli~no menja pod direktnim delovanjem hormona hipotalamusa, hipofize i ovariuma.
Sl. 2.67- Endometrium: 1. prizmati~ni jednoslojni epithel, 2.basalna membrana, 3. glandulae uterinae, 4. stroma, 5. krvni sudovi, A - funkcionalna zona, B - bazalni sloj, C - myometrium
79
Menstruaciona faza traje u proseku 1 do 4 dana. Kada izostane implantacija dolazi do regresije corpus luteum-a i opadanja koncentracija estrogena i progesterona u krvi sa odbacivanjem funkcionalne zone endometriuma.
bilitet na cikli~ne hormonske promene. Radialne i bazalne arteriole ne reaguju na hormonske promene ve} samo spiralne arteriole.
Folikularna ili proliferativna faza traje od 4 do 14 dana ciklusa. Poja~ana sekrecija estrogena iz folikula koji raste izaziva proliferaciju endometriuma sa intenzivnim mitozama glandularnog epitela. U epitelu se raspoznaju cilijarne }elije. @lezde se izdu`uju kao i spiralne arteriole strome. Kraj proliferativne faze ozna~ava porast LH - luteinizing hormona nakon ~ega u periodu od 35 do 44 ~asova dolazi do ovulacije.
a)
Sl. 2.68 - Endometrium u menstruacionoj fazi: A funkcionalni sloj, B - bazalni sloj, C - myometrium, 1. cavum uteri sa epitelnim }elijama, krvlju i ostacima sluzoko`e, 2. glandulae uterinae, 3. intaktni bazalni sloj, 4. bazalna membrana, 5. stroma, 6. krvna zrnca, 7. slobodne }elije strome
Vaskularni mehanizmi su osnova za nastajanje menstruacije kao reakcija na pad koncentracija estradiola i progesterona. Kontrakcije tunice medie spiralnih arterija izazivaju ishemiju funkcionalne zone endometriuma i njenu nekrozu. Krvni sudovi uterusa pokazuju selektivni senzi-
b)
Sl. 2. 69 - a) Endometrium u po~etnoj i b) Glandulae uterinae u proliferativnoj fazi: 1. `lezdani epitel, 2. endometrium, 3. glandulae uterinae, 4. myometrium, 5. stroma endometriuma, 6. epitelne }elije glandule
80
Sl. 2.70 - Kasnija proliferativna faza i glandulae uterinae: 1. `lezdani epitel, 2. zadebljao endometrium, 3. glandulae uterinae, 4. myometrium, 5. stroma endometriuma, 6. epitelialne }elije gl.uterinae sa mitozama
U kasnoj folikularnoj fazi zadebljava endometrium sa razvojem zone spongioze, {irenjem `lezda i mitozom.
Lutealna ili sekretorna faza traje od 14 do 28. dana menstruacionog ciklusa. Pod delovanjem corpus luteum - a progesteron izaziva fazu pune zrelosti endometriuma. @lezde sluzoko`e i arteriole se izvijaju. Jedra epitelnih }elija su okrugla i polo`ena bli`e lumenu zbog produkcije i
lagerovanja glikogena na bazalnom polu. Endometrium dosti`e u sredini sekretorne faze potpunu zrelost. Glikogen se preme{ta sa bazalnog na apikalni pol, a }elijska jedra prelaze na bazalni pol. Sekret bogat glokogenom skuplja se u lumenima `lezda. Faza endometriuma izme|u 20. i 23. dana ciklusa je optimalna za implantaciju embriona i naziva se implantacioni prozor. Po nekim drugim autorima taj period nastaje ranije, izme|u 17. i 19. dana.
Sl. 2.71 - Endometrium u po~etnoj sekretornoj fazi i glandulae uterinae: 1. `lezdani epitel, 2. zadebljao endometrium, 3. glandulae uterinae, 4. myometrium, 5. stroma, 6. epitelijalne }elije gl.uterinae sa glikogenom u bazalnom polu
81
Sl. 2.72- Endometrium u sredini sekretorne faze i gl.uterinae: 1. `lezdani epitel, 2a. stratum compactum, 2b. stratum spongiosum, 2c. stratum basale, 3. glandulae uterinae, 4. myometrium, 5. stroma, 6. epitelne }elije gl.uterinae sa glikogenom na apikalnom polu
Sl. 2.73- Implantacione zone: 1. cavum uteri, 2. isthimus tube, 3. tuba uterina, 4. cervix uteri
Implantacione zone
Nakon sinhronizovanih promena endometriuma i blastociste i odgovaraju}e interakcije, izme|u dolazi do implantacije embriona na superiornom, ili posteriornom delu corpus-a uteri.
Implantacione etape
[ematski se mogu razlikovati tri implantacione etape: - Adplantacija ili apozicija blastociste na endometrijum - Adhezija ili prihvatanje blastociste na endometrijum - Invazija ili usa|ivanje trofoblasta
82
uzvi{enja se sastoji u absorpciji uterinskog fluida {to dovodi blastocistu bli`e endometrijumu i mobili{e je u isto vreme. Uo~ena je pojava membranoznih projekcija poznatih kao pinopodi koje su progesteron zavisne }elijske organele i javljaju se kao apikalne celularne protruzije i postaju vidljive izme|u 20. i 21. dana prirodnog menstrualnog ciklusa. Mehanizam delovanja pinopoda nije sasvim jasan, ali se pretpostavlja da spre~avaju }elije da uni{te blastocistu i poma`u povla~enje uterinih fluida, olak{avaju}i adheziju blastociste za molekule pinopoda, ili uterodoma kako ih nazivaju drugi autori. Formacija i regulacija pinopoda je uslovljena koncentracijom progesterona i smanjenom koncentracijom receptora B i njihove ekspresije. Poslednji
rezultati su pokazali da je trajanje pinopoda ograni~eno na manje od 48 sati. U toku ovog perioda endometrijum i embrion, tako|e, proizvode molekule koji dovode do prihvatanja embriona za uterusnu mukozu i koji su poznati kao adhezioni molekuli. Najpoznatiji su mucini i integrini. Mucini ~ine }elijsku povr{inu otpornom na enzimska delovanja i mogu da oslabe inter}elijsku i }elija-ekstracelularni-matrix adheziju. MUC-1 deluje kao barijera implantaciji i zato mora da bude uklonjen da bi se omogu}ila interakcija blastociste sa endometrijumom. Me|utim, imaju}i u vidu da koncentracija MUC-1 raste jo{ 7 dana nakon LH - luteinizing hormone pika i traje do 13 dana, njegova prava uloga tek treba da se utvrdi.
Sl. 2.74- Implantacioni prozor: 1. menstruacija, 2. proliferaciona faza, 3. sekreciona faza, 4.implantacioni prozor
83
U ovoj etapi blastocista jo{ uvek mo`e biti eliminisana. Tako|e postoji mi{ljenje da su progesteron i estrogen odgovorni za edem koji ve} ispunjava poravnatu uterinsku {upljinu.
Sl. 2.75 - Hatching: 1. zona pellucida, 2. trophoblast, 3. hypoblast, 4. {upljina blastociste blastocoel, 5. epiblast
Pored mnogih aspekata sinhronizacionog procesa, uloga steroidnih hormona je najbolje poznata. Za implantaciju je potrebno preovulatorno pove}anje sekrecije 17 beta estradiola koji istovremeno stimuli{e proliferaciju i diferencijaciju uterusnih epitelijalnih }elija.
Produkcija progesterona od strane corpus-a luteum-a stimuli{e duboke celularne i molekularne promene u endometrijumu. Uspostavljanje normalne endometrijalne receptivnosti povezano je sa down regulacijom progesteronskih receptora koja koincidira sa vremenom implantacije embriona. Delovanje progesterona na endometrijalni epitel je posredovano putem endometrijalne strome koja ostaje progesteron-receptor pozitivna u toku trudno}e. Ove specifi~ne hormonske promene indukuju i promene u endometrijalnoj biosinteti~koj aktivnosti i osloba|anju ~itavog miljea lokalno produkovanih proteina u mikrosredini reproduktivnog trakta. Tokom celog perioda od ovulacije do implantacije, oocit je okru`en zonom pelucidom ~ija se uloga menja. Prvobitno je u kontaktu sa }elijama corone radiate tokom transporta oocita u Falopijevoj tubi. U trenutku oplodnje ona olak{ava akrozomnu reakciju }elija sperme. Kona~no, po{to je kortikalna reakcija zavr{ena, podle`e fizi~kim i hemijskim promenama. Zona pellucida ne poseduje HLA - human leukocyte antigen, pa deluje kao imunolo{ka barijera. Njena uloga je i prevencija prerane implantacije embriona u regiji tube.
84
U ovoj etapi blastocista vi{e ne mo`e biti eliminisana prostim ispiranjem. Adhezija blastociste sa endometrijumom podsti~u glukoproteini na povr{ini }elije specifi~nih mehanizmima.
Citotrofoblast, unutra{nji deo trofoblasta se sastoji od nepravilnog sloja jajastih }elija sa jednim nukleusom. Ovo je mesto gde se odvija intenzivna mitoti~ka aktivnost. Sinciciotrofoblast, spolja{nji deo trofoblasta, formira sincitium vi{ejedarni sloj bez }elijskih granica koji poti~e od fuzije }elija citotrofoblasta. Sinciciotrofoblast stvara liti~ke enzime i lu~i faktore koji izazivaju apoptozu endometrijalnih epitelijalnih }elija. Sinciciotrofoblast prolazi kroz bazalnu membranu penetriraju}i u stromu i erodiraju}i kapilarni zid. Sa implantacijom blastociste u endometrijum sinciciotrophoblast se brzo razvija i kompletno }e okru`iti embrion ~im se ovaj potpuno usadi u endometrijum.
Epitel zida uterusa reaguje na implantaciju decidualnom reakcijom. ]elije sinciciotrofoblasta fagocituju apoptotske decidualne }elije endometrijuma i resorbuju proteine, {e}ere i lipide koji su tamo formirani. Tako|e, erodiraju kanale endometrijalnih `lezda i kapilare strome.
85
Nakon erozije kapilara, njihova krv ispunjava lakune koje se kasnije razvijaju u intervilozne prostore. Invanzivni rast sinciciotrophoblasta ST - syncytiotrophoblast se zaustavlja u zoni compakta endometrijuma. Oko 13-og dana se pojavljuje primitivni utero-placentarni krvni sistem.
Sl. 2.80- a)Implantacija 6 - 7 dan b) Implantacija 7 8 dan: 1. epitel sluzoko`e uterusa: 2.hypoblast ektoderm, 3. syncytiotrophoblast, 4. citotrophoblast, 5. epiblast - endoderm, 6. {upljina blastociste blastocoel
Sl. 2.82- a) Implantacija 8 dan b) Implantacija 9 dan: 1. ST -syncytiotrophoblast, 2. epiblast - ektoderm, 3. hypoblast - endoderm, 4. {upljina blastociste, 5. maj~ini kapilari, 6. amnionska {upljina, 7. amnioblasti, 8. fibrin, 9. trophoblast lakuna
Sredinom druge nedelje se ekstracitoplazmati~ne vakuole pojavljuju u ST - syncytiotrophoblast-u. Udru`uju se formiraju}i lakune. Prvobitno su ove lakune ispunjene fluidima tkiva i uterinim sekretom.
Na kraju druge nedelje, kada je implantacija zavr{ena, imamo dve hemisferne {upljine koje le`e jedna na drugoj: amnionska {upljina, dorzalna i umbilikalna, ventralna. Podlogu amnionske {upljine formira epiblast, a gornji deo umbilikalne formira hipoblast. Ova dva sloja, koji le`e jedan na drugom formiraju embrion.
86
ECM - extra-cellular matrix-a, adhezione molekule, intergrin, kadherin i hormone. Decidualne }elije i endometrijalne `lezde lu~e faktore rasta i razne druge faktore neophodne za implantaciju embriona. Blastocista lu~i svoj sopstveni faktor rasta i ekspresuje brojne receptore koji omogu}avaju interakcije tkiva sa uterinim epitelom. Posmatrano {ematski, molekularne interakcije izme|u blastociste i maj~inog organizma se odvijaju na tri nivoa: 1. razmena signala tokom preimplantacije; 2. interakcije izme|u blastociste i epitela uterusa, adplantacija; 3. interakcije izme|u blastociste i endometrijuma, invazija trofoblasta.
Sl. 2.83- a) Implantacija 9 - 10 dan; b) Implantacija 10 - 11 dan: 1. hypoblast, 2. erodirani kapilari majke, 3. extraembrionalni retikul, 4. membrana, 5. amnionska {upljina, 6. citotrophoblast, 7. syncytiotrophoblast, 8. lakune ispunjene krvlju
87
Tokom faze preimplantacije gustina povr{inskih proteina - glikokaliks, kao i elektrostati~ka repulzija izme|u balstociste i endometrijuma se smanjuje {to olak{ava implantaciju.
LIF - leukocytes inhibition factor glikoprotein iz grupe citokina, sintetizuju uterine epitelijalne }elije od 18-og dana menstrualnog ciklusa. Ima ulogu u diferencijaciji CT - citotrophoblast ka ST - syncytiotrophoblast i poma`e lu~enje HCG human chorionic gonadotropina. Isto tako se smatra da LIF - leukocytes inhibition factor mo`e da posreduje u interakciji izme|u endometrijalnih leukocita i trofoblasta i da kontroli{e angiogenezu u placentarnim resicama. Ekspresija LIF leukocytes inhibition factor receptora je va`na i u formaciji pinopoda. EGF - epidermal growth factor receptori se mogu vezati za brojne ligande. EGF-R epidermal growth factor receptor se osloba|a od ~etvrtog dana od strane }elija iz unutra{nje }elijske mase i od trofoblasta. Izme|u ~etvrtog i sedmog dana je njegovo osloba|anje ograni~eno na unutra{nju }elijsku masu i embrionalni pol trofoblasta. Ovo mo`e biti obja{njenje za orijentisanje blastociste koja se usa|uje u endometrijum embrionalnim polom. HB - EGF - heparin binding epidermal growth factor direktno uti~e na implantaciju embriona, na sam proces prihvatanja i invaziju trofoblasta preko parakrino autokrinih signala u toku }elijske penetracije strome. HB-EGF - heparin binding epidermal growth factor inhibira apoptozu i u humanom endometrijumu indukuje invazivni trofoblastni fenotip. Dokazano je da je HB-EGF - heparin binding epidermal growth factor ekstremno nizak kod eklampsije. Pad nivoa HB-EGF - heparin binding epidermal growth factora mo`e da dovede do poreme}aja u celularnom sistemu koji {titi od oksidativnog stresa kao i do endotelijalne disfunkcije. CSF-1 - colony stimulating factor ima va`nu ulogu u procesu ovulacije u prvom trimestru trudno}e.
88
IGFB 1 - insulin like growth factor binding protein reguli{e delovanje EGF epidermal growth factora na endometrijalne }elije, imaju}i va`nu ulogu u }elijskoj proliferaciji i diferencijaciji neophodne za proces decidualizacije. KGF - keratinocyte growth factor stimuli{e rast spiralnih arterija i inhibira glandularnu apoptozu. Postoji sigurno jo{ ~itav niz potencijalnih faktora ~ija uloga tek treba da se utvrdi me|u kojima treba pomenuti calcitonin i HOX - homeobox gene, kao i vitamin D.
aloproteinaza iniciraju kompleksnu interaktivnu kaskadu u toku implantacije i ranog embrionalnog razvoja. Trofoblastna invazija je aktivan enzimski proces. Humane citotrofoblastne }elije sekretuju MMP matrix-a metalloproteinase endopeptide koji su sposobni da degradiraju komponente ECM - extra-cellular matrix-a. Citokini i faktori rasta tako|e uti~u na produkciju MMP - matrix metalloproteinase. MMP 2 matrix metalloproteinase i MMP 9 - matrix metalloproteinase u stanju su da dovedu do digestije glavnih konstituenata ECM - extracellular matrix-a. Danas je poznato da je uterusni imuni sistem veoma va`an za kontrolu normalne blastocitne invazije, rasta trofoblasta i njegove diferencijacije. Vi{e od 40% decidualnih }elija su imune }elije. Vi{e od 70% decidualnih limfocita su CD 56 - cyclodextrin bright i CD 16 - cyclodextrin naturaliler, dok T - }elije ~ine samo 10% decidue. Infiltracija uterinih NK - natural killer }elija je deo cikli~nih promena endometrijuma i pod uticajem je steroida, posebno progesterona. Nedavno je potvr|eno da su endometrijalni IL 15 - interleucini prolaktin uklju~eni u proliferaciju i diferencijaciju ovih }elija. Pretpostavlja se da ove }elije, ~ija se morfologija i koncentracija menja u toku trudno}e, u~estvuju u regulaciji maternalne mukozne funkcije i kontrole obima trofoblastne invazije. Neki MHC - major histocompatibility complex klase molekuli: HLAg - human leukocyte antigen, HLAc human leukocyte antigen, HLAe - human leukocyte antigen, koji su detektovani u trofoblastu, mogu da deluju kao NK - natural killer }elija ligandsi, obezbe|uju}i potentni molekularni mehanizam za prepoznavanje trofoblasta od strane majke. Implantacija embriona je jedan od primera da je neophodan veoma slo`en mehanizam da bi se obezbedilo produ`enje vrste.
89
4. EMBRIONALNI RAZVOJ
Gonade nastaju iz dva razli~ita tipa }elija PGC - primordial germ cells i somatskih }elija. PGC - primordial germ cells u~estvuju u gra|i spermatozoida i oocita i poti~u iz ektoderma. Iz embrionalnog dela plica genitalis po}inju da se pomeraju u pravcu vesicula umbilicalis ameboidnim pokretima i delovanjem hemotakti~nih faktora, formiraju}i na kraju sa }elijama mezenhima chordae gonadales. Embrionalne }elije ekspresuju receptor tirozin kinaze - C-kit na svojoj povr{ini. Njen ligand, faktor stem }elija ili kit ligand, tako|e se ekspresuje du` cele migratorne putanje. ^ini se da je interakcija izme|u Ckit i njegovog liganda - kit liganda od fundamentalnog zna~aja za migraciju }elija zametka. Poznato je da su i drugi genetski faktori od velikog zna~aja za razvoj gonada. Vilmsov gen tumora WT1 - Wilms tumor je od velikog zna~aja za razvoj jajnika. Bez delovanja WT1 - Wilms tumor }elije zametka normalno migriraju, ali urogenitalni greben ne uspeva da se razvije {to vodi ka ageneziji gonada i bubrega. Poznato je da se po~etak mu{ke diferencijacije aktivira putem seks determini{u}eg faktora enkodiranog u Y hromozomu SRY - sex determining region. Nedavna istra`ivanja pokazuju da `enski razvojni put zahteva aktivno u~e{}e Wnt-4 - wingless-int signalne putanje. Ovarium se morfolo{ki diferencira tokom 11. ili 12. nedelje razvoja. Pre toga po~inje umno`avanje broja embrionalnih }elija mitoti~kom deobom. Jedan deo embrionalnih }elija putem atrezije nestaje. Proces se nastavlja sve do menopauze. Ova degeneracija u fetalnim gonadama se odvija putem apoptoze.
Sl. 2.84- PGC - primordial germ cells u 4 - 6.nedelji: 1.darm, 2. ductus omphalomesentericus, 3. allantois, 4. prabubreg leiste (crveno), 5. gonadalna leiste (zeleno), 6. PGC - primordial germ cells, 7. polo`aj srca
90
Nakon 10. nedelje dolazi do formiranja prve folikularne strukture koje okru`uju nekoliko oogonija. Ova labava mre`a po~inje da o~vr{}uje i granulosa }elije okru`uju ve}inu oocita do 24. nedelje, a ostale oocite do ro|enja. Broj oogonija se stalno pove}ava sve do po~etka mitoze. Po~etak mitoze ozna~ava transformaciju oogonije u oocit. Ovaj proces po~inje oko 15. nedelje, a broj oocita dosti`e svoj maksimum oko 20. nedelje. Mejoza oocita zastaje u profazi prve mejoti~ke deobe. Ulaskom u mejozu, oociti gube sposobnost uve}anja svog broja putem mitoze. Ovo prebacuje ravnote`u u korist atrezije embri-
onalnih }elija i od tog trenutka broj oocita po~inje da opada. Za razliku od spermatogeneze kod mu{karaca gde se spermatogonije pona{aju kao stem }elije i konstantno se dele da bi proizvele gamete, ovarijum ima kona~nu zalihu oocita koja se odre|uje na ro|enju. U indiferentnom stadijumu polnih organa postoje dva para polnih kanala, ductus mesonephriticus - Wolff - ov i ductus paramesonephriticus - Mullerov kanal. Wolff-ovi kanali se razvijaju samo kada se iz indiferentnog stadijuma diferencira mu{ka polna `lezda, a Muller-ovi kod `enskog pola.
Sl. 2.85- Genitalni organi u indiferentnom stadijumu u 6. nedelji: 1. gornja genitalna traka, 2. mesonephros, 3. ductus paramesonephricus - Muller, 4. ductus mesonephricus - Wolff, 5. tuberculum sinuale, 6. indiferentna gonada, 7. donja genitalna traka, 8. sinus urogenitale, 9. insercio genitalne trake
III DEO
STERILITET
STERILITET
Nemogu}nost da se imaju sopstvena deca je problem, koji {irom sveta poga|a oko 80 miliona parova. Smatra se da je oko 15 procenata op{te populacije pogo|eno ovim problemom. Medicinski se razlikuju dve vrste steriliteta: - O primarnom sterilitetu se govori onda, kada `ena, uprkos seksualnim odnosima bez za{tite, nikada nije bila trudna. O sterilitetu mu{karca se govori, kada nikada nije oplodio `enu i tako doveo do trudno}e. - Sekundarni sterilitet postoji onda, kada je `ena ve} bila trudna, ali uprkos `elji da ima dete, ne mo`e da do|e do druge trudno}e. Statisti~ka istra`ivanja su pokazala, da je mu{karac gotovo isto tako ~esto pogo|en sterilitetom. Kod parova bez dece se pokazuje slede}a podela steriliteta po polovima: - 45 procenata `ena - 40 procenata mu{karac - 15 procenata nepoznati uzrok. ^esto se kod oba partnera sre}e smanjena plodnost, u oko 35 procenata. Bra~ni par se posmatra kao celina od samog po~etka, zna~i od faze ispitivanja do kasnije faze le~enja. Problem neplodnosti dobija sve vi{e u zna~aju zbog stalnoga porasta broja parova koji ne mogu da imaju dece. Prihva}eno mi{ljenje da odgovor treba tra`iti u na~inu i sve lo{ijim uslovima `ivota i `ivotne sredine, tek treba da pro|e kroz ozbiljno istra`ivanje. Problem }e sve vi{e dobijati u zna~aju u narednom periodu koji nam predstoji, {to zahteva dodatni anga`man i napor organizatora i realizatora zdravstvene slu`be. U poslednjih dvadeset godina dijagnostika i terapija u ovoj medicinskoj oblasti su izuzetno napredovale i u pore|enju sa drugim medicinskim oblastima svakako su pri samom vrhu. Tendencija je dalji nastavak razvoja, a dokaz za to su svakodnevne novine i nove metodologije rada. Biomedicina, nova nauka XXI veka, neke od svojih korena dobija iz osnova tehnike in vitro fertilizacije. Humana mati~na }elija, baza budu}ih saznanja i odgovora, po~inje da se prati i strukturalno analizira prvi put u dinami~kom procesu u in vitro uslovima. Nova saznanja iz ove oblasti re{ava}e probleme neplodnosti, ali istovremeno davati odgovore i na mnoga druga nau~na pitanja.
94
95
muralnim i intramukoznim miomima, ~ak i kada ne postoji deformitet kavuma. Procenat trudno}a do kojih dolazi nakon miomektomije, kre}e se u literaturi i do 60%. Stav u svim ve}im centrima koji se bave problemom steriliteta je obavezno otklanjanje mioma pre ulaska u program asistirane reprodukcije. Kod pacijenta se uz veli~inu i lokalizaciju mioma, pri odlu~ivanju uzimaju i ostali faktori u obzir, kao godine starosti, predvi|ena metoda le~enja, etiologija, prethodni poku{aji.
Metode tretiranja mioma su: - abdominalna miomektomija - kod `ena sa multiplim miomima i ve}im intramuralnim miomima, - laparoskopska miomektomija - u slu~ajevima prisustva manje od tri mioma, i prisustva mioma manjeg od 6 cm. Laparoskopska procedura obezbe|uje manji postoperativni bol, kra}i boravak u bolnici, brzi oporavak, i smanjeno stvaranje postoperativnih adhezija za oko 40%. Intraoperativni ve}i gubitak krvi smanjuje procenat operativnog uspeha za vi{e od 20%. Opisani rizik od rupture uterusa u toku trudno}e nakon laparoskopske miomektomije usled uterusnog defekta ili lo{eg o`iljavanja iznosi 1%,
96
- histeroskopska miomektomija - je standardna procedura za submukozne miome manje od 5 cm u pre~niku. Eventualne komplikacije ove metode su stvaranje postoperativnih adhezija u oko 10% slu~ajeva. Kod `ena sa submukoznim miomima ve}im od 3 cm u pre~niku preporu~uje se upotreba gonadotropin releasing hormon analoga pre operacije,
- vaginalna miomektomija - se mo`e primeniti i kod ve}ih, ili intramuralnih mioma, - UFE - uterusna fibroidna embolizacija, uterine fibroid embolization, predstavlja noviju metodu u le~enju mioma. Primena ove metode je rutinirana u slu~ajevima potrebe smanjenja veli~ine mioma kao i zaustavljanja ekscesivnog krvarenja.
97
U slu~ajevima poreme}ene fertilnosti `ene, mi{ljenja o primeni ove metode su podeljena. Kako je u odre|enom procentu tretiranih `ena usled embolizacije utero-ovarijalne kolateralne cirkulacije, opisana pojava ovulacione disfunkcije sa hipergonadotropnom amenorejom do prematurne menopauze, zatim infekcije uterusa sa endometritisom, piometre, pa i slu~ajevi anaerobne pelvi~ne sepse, ova metoda se ne savetuje `enama u reproduktivnoj fazi. - laparoskopska bipolarna koagulacija uterusne arterije kao alternativa UFE - uterine fibroid embolization. Grupa lekara sa Tajvana opisala je smanjenje mioma za 76% nakon primene laparoskopske bipolarne koagulacije krvnih sudova uterusa, - laparoskopska mioliza - vr{i se koagulacijom centralnog dela mioma sa dugom bipolarnom iglom ili laserom. Koagulaciona nekroza mioma rezultira vaskularnim o{te}enjem i promenama u kolagenu, {to dovodi do smanjena mioma. Opisano smanjenje mioma iznosi oko 40 %. Glavni nedostaci ove metode su stvaranje adhezija koje mogu da dovedu do infertiliteta.
Sl. 3.6- Endometriozna `ari{ta: 1. Ovarium, 2. Tube, 3. Ligamentum teres uteri, 4. Peritoneum, 5. Uterus, 6. Vesica urinaris, 7. Fornix vaginae, 8. Klitoris, 9. Vagina, 10. Vestibulum vagninae, 11. Labium majus, 12. Douglas ov prostor, 13. Rectum
Endometriozna `ari{ta su razli~ito lokalizovana. - Endometriosis genitalis externa: kada su `ari{ta u oblasti organa male karlice, ovarijuma, na vezivnom aparatu uterusa, peritoneumu, na zidu be{ike, rekto vaginalna.
98
- Endometriosis genitalis interna: endometrioza koja nastaje urastanjem bazalnog sloja endometrijuma u intersticijalni deo mi{i}nog sloja zida materice ili u zid jajovoda, endometriosis isthmica nodosa. - Endometriosis extragenitalis: kada se `ari{ta endometrioze nalaze u okolini male karlice, ili u delovima tela i u organima, koji su udaljeni od polnih organa. Uprkos intenzivnom istra`ivanju o na~inu nastanka bolesti jo{ od njenog otkri}a 1860.god. od strane Von Rokitansky, danas jo{ uvek nijedna od teorija ne pokriva sve forme endometrioze koje postoje.
Teorija o prenosu - ili teorija transplantacije pretpostavlja preno{enje tkiva endometrijuma iz uterusa retrogradnom menstruacijom limfnim i krvnim sudovima. Menstrualna krv mo`e preko jajovoda da donese deli}e endometrijuma. Imunolo{ki sistem bi u normalnim okolnostima prepoznao ove strane }elije i uni{tio ih. Ali, ako je imunolo{ki sistem oslabljen, ili poreme}en, onda mo`e da do|e i do njihovog rasta. ]elije endometrijuma mogu preko krvnih puteva ili limfnih sudova da dospeju na bilo koje mesto u organizmu. Na ovaj na~in bi moglo da se objasni prisustvo endometrioze u udaljenim organima. Pri operacijama na materici, mogu neopa`eno da se prenesu sitni deli}i }elija endometrijuma. Teorija metaplazije - ili preobra`aja }elija koja obja{njava razvoj bolesti kao proces kontinuirane diferencijacije tkiva celomske opne putem metaplazije. Pri formiranju polnih organa `enskog embriona mo`e da do|e do odvajanja nespecifi~nog tkiva. Ove nespecijalizovane }elije se naj~e{}e nastanjuju u dubokom prostoru abdomena. Putem metaplazije ove }elije se transformi{u u endometrijalno tkivo.
Najnovija istra`ivanja baziraju se na ~injenici da se fiziolo{ki efekti progesterona ostvaruju putem dve izoforme PR progesteronskih receptora A i B. Progestini se dugo koriste u le~enju endometrioze, ali na `alost efekti su kratkotrajni. Uz to, oko 9% `ena sa endometriozom ne reaguju na progesteronsku terapiju. Prime}ena je tendencija rezistencije unutar eutopi~nog i ektopi~nog endometrijuma kod `ena sa endometriozom kao i smanjenje PR-B progesteronskog receptora B, ali ne i PR-A - progesteronskog receptora A. Na|eno je da je promoter region PR-B - progesteronski receptor, ali ne i PR-A - progesteronski receptor A hipermetilisan kod endometrioze u pore|enju sa kontrolom. Uz to je ekspresija PR-B- progesteronskog receptora B zna~ajno redukovana u ektopi~nom endometrijumu. Ovo sugeri{e da je rezistencija na progesteron kao i smanjenje PRB - progesteronskog receptora B, ali ne i PRA - progesteronskog receptora A, rezultat promoter hipermetilacije PR-B - progesteronskog receptora B, ali ne i PR-A - progesteronskog receptora A. Povezano sa metilacijom HOXA10 homeoboxA10 gena u eutopi~nom endometrijumu `ena sa endometriozom, ukazuje da je endometrioza epigenetsko oboljenje, {to otvara novo vi|enje patogeneze endometrioze i nove vidove le~enja.
99
Meno-metroragije Dyspareunia, glavobolja, vrtoglavica, problemi sa `elucem Sterilitet ^este infekcije Subfebrilne temperature
U~estala je pojava nespecifi~nih hroni~nih tegoba: - psihi~ke promene, koje su prouzrokovane `ivotom sa hroni~nim bolovima, - promene raspolo`enja, - nekarakteristi~ne tegobe u stomaku, - ose}aj nadutosti, - op{ta nelagodnost, - gubitak libida. Ove tegobe ~esto dovode do pogre{nih dijagnoza i primene neefikasne terapije. Neretko se tegobe pogre{no ocenjuju kao psihosomatske. Suverena dijagnosti~ka metoda kod endometrioze je laparoskopija kojom se ta~no defini{e stadijum i samim tim na~in le~enja. Klasifikacija stepena bolesti je revidirana klasifikacija Ameri~ke asocijacije za fertilitet kojom se deli na ~etiri stadijuma, bazirano na bodovnom sistemu u zavisnosti od veli~ine `ari{ta, prodiranja u dubinu tkiva, broja i postojanja adhezija.
100
Polaze}i od incidence bolesti i podataka da je oko 40 % `ena sa endometriozom sterilno, jasan je medicinski i socijalni zna~aj ove bolesti. Mehanizmi delovanja endometrioze na fertilitet se jo{ uvek istra`uju. Do sada su utvr|eni slede}i mehanizmi: - ovarijalna disfunkcija, anovulacija, poreme}aj funkcije `utog tela, poreme}aj LH - luteinizing hormone pika, LUFSluteinizing unruptured follicle sindrom, nerupturiranje luteiniziranog folikula, - hiperprolaktinemija zbog stvaranja prolaktina u endometrioznim `ari{tima, - pove}anje peritonealne te~nosti sa povi{enim koncentracijama prostaglandina i pove}anim motilitetom tuba i uterusa kao i luteoliti~kim efektom. Peritonealna te~nost ima i toksi~ni efekt sa pove}anjem broja makrofaga, - autoimuni odgovor na endometriozna `ari{ta sa alteracijom humoralnog imuniteta sa padom T }elijskog i porastom B }elijskog reaktiviteta, sa prisustvom IgA i IgG autoantitela u odnosu na endometrijum i antigene ovarijuma, - kod te`ih formi endometrioze prisustvo adhezija, razaranje tubarnog i ovarijalnog tkiva. Metode le~enja su: - hirur{ka terapija - medikamentozna, hormonska terapija - terapija bola - alternativne metode le~enja
}ava otkrivanje i uklanjanje i najmanjih endometrioznih promena. U slu~aju velikih endometrioznih promena metoda izbora je laparotomija. Uklanjanje kompletnih organa je potrebno samo u izuzetnim slu~ajevima.
Medikamentozna terapija
Kod medikamentozne terapije primenjuju se gestageni, danazol, GnRH - gonadotropin releasing hormon analozi i GnRH - gonadotropin releasing hormon antagonisti, po poznatim protokolima u vremenu od 6 do 12 meseci.
Hirur{ka terapija
Laparoskopska operativna tehnika se uvek primenjuje kada je to mogu}e zbog minimalne invazivnosti. Odskora se koristi laparoskopska operativa sa prethodnim ubrizgavanjem odre|ene aktivne supstance koja se vezuje za endometriozne }elije i pri osvetljavanju plavim svetlom `ari{ta svetle {to omogu-
101
Brojne studije pokazuju {tetan uticaj patogenih bakterija koje su kultivisane sa vrha katetera nakon ET embrio transfera kao sto su: E.coli, streptokoke, posebno Streptococcus viridans, kao i anaerobi. Nasuprot tome, dijagnostika hidrogen peroksid produkuju}ih laktobacila sa vrha katetera pokazuje pozitivnu korelaciju sa pove}anjem procenta uspeha IVF - in vitro fertilisation. H2O2 laktobacili poma`u odr`anju zdrave vaginalne flore. Bakterijska vaginoza predstavlja nalaz vaginalne flore koji karakteri{e gubitak H2O2 produkuju}ih laktobacila, {to je pra}eno pove}anjem koncentracije anaeroba i Gardnerella vaginalis.
IVF - in vitro fertilisation pacijenti u 30 - 40% slu~ajeva imaju dijagnostikovanu patogenu vaginalnu floru. Nedavno je dokazano da je bakterijska vaginoza u ranoj trudno}i povezana sa ranim poba~ajem kod spontanih trudno}a kao i kod trudno}a nakon IVF - in vitro fertilisation procedure. Smanjenje uspeha IVF - in vitro fertilisation u slu~ajevima dokazane bakterijske vaginoze mo`e biti uzrokovano, bilo smanjenom koncepcijom, bilo ranim gubitkom trudno}e. Mo`e se pretpostaviti da infekcija uti~e na uspeh IVF - in vitro fertilisation na najmanje dva na~ina.
Prvi mehanizam koji uti~e na procenat uspeha je da subakutni endometritis koji je postojao i pre IVF - in vitro fertilisation umanjuje direktno procenat implantacije. Uzroci preegzistiraju}eg subakutnog endometritisa mogu da budu i prethodne intrauterine procedure koje dovode do uvo|enja patogenih bakterija u uterus. @ene u programu IVF - in vitro fertilisation su ~esto prethodno bile podvrgnute brojnim dijagnosti~kim i terapijskim intrauterinim procedurama. Drugi razlog smanjenja uspeha kod ART assisted reproductive technology zbog intrauterine inflamacije je pove}anje procenta ranih poba~aja. Intrauterini inflamatorni proces mo`e da bude odgovor na unos patogenih bakterija u endometrijalnu {upljinu putem katetera za embrio transfer. Ova imflamacija, nedovoljna da uti~e na koncepciju, mo`e da dovede do pove}anog procenta ranih poba~aja. Poznato je da su citokini va`ni u procesu implantacije. Patogene bakterije une{ene kateterom za embrio transfer uzrokuju disbalans citokina, {to se negativno odra`ava na proces implantacije. Bolje razumevanje efekata cervikovaginalne flore i kontaminacije kateterom u IVF - in vitro fertilisation proceduri dove{}e do optimizacije svih procedura u toku procesa IVF - in vitro fertilisation. Isto tako, mora se biti obazriv i pri upotrebi antibiotika {irokog spektra koji uti~u na vaginalnu floru i smanjuju broj H2O2 produkuju}ih laktobacila, {to na duge staze paradoksalno smanjuje procenat uspeha IVF - in vitro fertilisation.
Gardnerella vaginalis
Dijagnoza infekcije Gardnerella vaginalis se smatra sigurnom kada postoji naj-
102
manje tri od slede}ih nalaza: vaginalna pH > 4,5; miris na amin posle alkalizacije sa 10% kalijumovim baznim rastvorom i prisustvo clue cells u faznom kontrasnom mikroskopu, ili u preparatu obojenom metilenskim plavim.
Streptokoke
Pojava streptokoka grupe B se sre}e kod 10% do 15% svih pacijentkinja. Stoga se kao profilaksa eventualne sepse kod novoro|en~adi predla`e screening u trudno}i i kao konsekvenca preporu~uje intrapartalna hemoprofilaksa.
Prekonceptualan screening se naprotiv smatra nepotrebnim, po{to smanjenje klica po svim pravilima ne uspeva.
Chlamydia trachomatis
Chlamydia trachomatis je naj~e{}i seksualno prenosivi bakterijski uzro~nik u zapadnim zemljama sa prevalencom do 5% me|u `enskom populacijom u dobi od 15 do 29 godina.
Ona ima manji uticaj na procenat uspeha posle ART - assisted reproductive technology, ali pove}ava rizik od prevremenih poba~aja. U trudno}i postoji pove}an rizik od prevremenog pucanja vodenjaka, horioamnionitisa i prevremenog poro|aja. Bakterijska vaginoza treba prekonceptualno da se sanira.
103
Infekcija ~esto proti~e sa slabim simptomima sa slikom zapaljenja grli}a materice, cervicitisom. U procesima intrauterinih manipulacija kao {to je inseminacija, ili transfer embiona, postoji opasnost da se prenesu klice i razvije adneksitis sa njegovim posledi~nim pojavama. Pregled svih pacijentkinja pre po~etka procedure ART assisted reproductive technology, nije va`an samo zbog mogu}nosti preno{enja ascedentnih infekcija, ve} i ro|enja zdravog deteta. Infekcija hlamidijom pove}ava rizik od preranog poro|aja. Kod novoro|en~adi inficiranih majki u 20% do 50% razvija se konjuktivitis koji retko mo`e da dovede ~ak i do slepila. U 10% do 20% nastaje neonatalna pneumonija. Dokazivanje klica pomo}u genskih amplifikacionih tehnika mogu}e je iz prvog jutarnjeg urina ili iz brisa grli}a materice. U slu~aju postojanja infekcije Chlamydia trachomatis le~e se oba partnera, da bi se spre~ila reinfekcija.
Gonokoke
Gonoreja je jedna od naj~e{}ih polnih bolesti. [irom sveta se godi{nje inficira izme|u 25 i 60 miliona ljudi. Bolest izazivaju bakterije Neisseria gonorhoeae i postoji obaveza prijavljivanja bolesti.
Iz tog razloga se skoro sve infekcije prenose polnim odnosom. Razlikuje se genitalna gonoreja i vangenitalna gonoreja. Kod genitalne gonoreje nekoliko dana posle infekcije dolazi do upale sluzoko`e koja se ispoljava kao upala mokra}nog kanala. Stvara se gnojni `u}kasto-zeleni iscedak. Infekcija u polovini slu~ajeva proti~e bez posebnih propratnih pojava. Na iscedak se ne obra}a pa`nja, jer se ~esto smatra normalnim sekretom. Nele~ena gonoreja mo`e da dovede do steriliteta zbog {irenja na unutra{nje genitalne organe. Kod vangenitalne gonoreje se upala {iri izvan genitalnih organa kao posledica seksualnog pona{anja. Mogu}a su zapaljenja na sluzoko`i usta i anusa. Poseban slu~aj predstavlja infekcija kod novoro|en~adi kada je majka obolela u vreme poro|aja. Gonoreja se prenosi na ve`nja~u deteta, sa po~etkom simptoma nekoliko dana posle ro|enja. Zato je propisana, takozvana Credesche profilaksa. Retko dolazi do pro{irenja bolesti na celo telo preko krvi sa povi{enjem telesne temperature, bolovima u zglobovima i stvaranja gnojnih mehuri}a na rukama i nogama. Da bi se postavila sigurna dijagnoza iscedak se bakteriolo{ki pregleda. Terapija gonoreje se sastoji u davanju antibiotika. Bra~ni par mora da se le~i istovremeno i tek po proverenom izle~enju je mogu} po~etak procedure IVF in vitro fertilisation.
Treponema pallidum
Sl. 3.17- Neisseria gonorrhoeae
Po{to su bakterije osetljive na isu{ivanje i niske temperature preno{enje gonoreje je mogu}e samo u vla`noj i toploj sredini.
Sifilis je bolest koja je poznata vekovima. Godine 1495. opisana je prva epidemija ove bolesti. Bolest koja se po pravilu prenosi polnim odnosom izaziva bakterija
104
Treponema pallidum. Sifilis se razvija u stadijumima. Mo`e da napadne sve organe i ako se ne le~i mo`e dovesti do smrti pacijenta.
III Stadijum: Ako posle 2 5 godina do|e do tre}eg stadijuma, bolest zahvata unutra{nje organe, srce, krvne sudove i nervni sistem. Guke, zapaljenske izrasline koje izgledaju kao ~ir izlaze po celom telu, na ko`i, u organima, u kostima, u krvnim sudovima i u centralnom nervnom sistemu. Na tim mestima dolazi do razaranja tkiva koje, zavisno od polo`aja guka, izaziva odgovaraju}e tegobe. IV Stadijum: Nele~en lues, ili neurosifilis dovodi do demencije i smrti. Poslednji stadijum sifilisa nastupa naj~e{}e posle 10 do 20 godina kada su pogo|ene mo`dane opne, nervni ~vorovi i nervne ganglije. Napad bolesti se ispoljava op{tim i progresivnim oduzetostima, napadima bolova, smetnjama u ose}anjima i ispadima refleksa. Na kraju, ovaj poslednji stadijum dovodi do demencije i smrti. Dijagnoza sifilisa se postavlja specifi~nim testovima na antitela bakterija. Terapija je antibiotska. Bolest mora da se prijavi. Infekcija u svakom periodu trudno}e mo`e da se prenese na dete, posebno u drugom stadijumu i da izazove poba~aj. Smrtnost kongenitalno inficirane dece je visoka. Pacijenti u aktivnoj fazi bolesti se isklju~uju iz programa asistirane reprodukcije do izle~enja. Testovi nisu rutinski, ve} samo kod suspektnih slu~ajeva.
Ako je majka obolela od sifilisa, u toku trudno}e se preko placente inficira i dete. To je mogu}e tek posle 4. meseca trudno}e. Ako je majka pre ili u toku prva tri meseca trudno}e uspe{no le~ena, dete ne}e biti o{te}eno. Zavisno od stepena te`ine maj~ine infekcije, mogu}e je da u 7. ili 8. mesecu trudno}e do|e do ro|enja mrtvog novoro|en~eta. Ako je infekcija majke trajala du`e unazad, inficirano dete mo`e da pokazuje simptome drugog stadijuma. Mogu}e je i da se prvi simptomi razviju tek godinama ili decenijama kasnije.
I Stadijum: Posle dve do tri nedelje nastaje bezbolan ~vori} ili ~ir na ulaznom mestu bakterija - ulcus durum, sa regionalnim oticanjem limfnih ~vorova, koji se povu~e posle nekoliko dana do nekoliko nedelja. II Stadijum: Druga faza po~inje otprilike 9 nedelja posle infekcije sa povi{enjem telesne temperature, bolovima u zglobovima, osipom po telu syphilid, uve}anim limfnim ~vori}ima. Tegobe se povla~e, a zatim sledi period bez tegoba vi{e godina, decenija ili do kraja `ivota.
Candida albicans
Pribli`no 75% `ena u toku `ivota bar jednom }e imati vulvovaginitis izazvan candidom, a 5% `ena ima}e rekurentne infekcije. Incidenca vulvovaginalne kandidijaze je najve}a u reproduktivnoj dobi izme|u 20. i 40. godine `ivota, a retka u prepubertalnoj, odnosno, postmenopauzalnoj dobi.
105
ciju podrazumeva dupliranje standardnog tretmana. Efekti infekcije C. albicans na ishod le~enja infertiliteta, kao i na parametre sperme, jo{ uvek nisu dovoljno jasni. Ono {to je za sada inidikativno, pokazuje da, iako C.albicans ne uti~e direktno na parametre sperme, infekcija ovom gljivicom mo`e da prouzrokuje porast hromatinskog o{te}enja sperme i apoptozu, {to mo`e da dovede do poreme}aja fertilizacije nakon ART- assisted reproductive technology.
Pretpostavlja se da visok nivo estrogena pogoduje razvoju ove infekcije. Estrogen pove}ava nivo sadr`aja glikogena u vagini {to ima direktan uticaj na rast kandide i pove}anje njene adherentnosti za vaginalni epitel. Vulvovaginalna kandidijaza je naj~e{}e izazvana candidom albicans, a zatim se sre}e candida glabrata.
Trichomonas vaginalis
Vaginalna infekcija izazvana Trichomonas vaginalis - om igra zna~ajnu ulogu u slu~ajevima infertiliteta. Infekcija cervikalnog kanala spre~ava transport sperme toksi~nim metaboli~kim produktima ovih organizama, a intrauterina infekcija ima za posledicu neadekvatan razvoj endometrijuma, koji ugro`ava uspeh neke od ART assisted reproductive technology postupaka.
Nekomplikovana vulvovaginalna kandidijaza je definisana kao sporadi~ni vaginitis, izazvan naj~e{}e C.albicans i osetljiv na antifugalnu terapiju. Terapija podrazumeva poliene, azole, gde spadaju imidazol i triazol, te druga sredstva kao {to su intravaginalne kapsule borne kiseline, te flukotisin. Kod `ena sa rekurentnom vulvovaginalnom kandidijazom adekvatni tretman za inicijalnu infek-
Na infekciju Trichomonas vaginalis om nailazimo kod 20% infertilne populacije. Treba imati u vidu da je vi{e od 50% ovih infekcija kod `ena, kao i ve}ina infekcija kod mu{karaca, asimptomatska. Uz uobi~ajene dijagnosti~ke postupke kod
106
simptomatske infekcije trichomonasom koje su pozitivne u 85% slu~ajeva, posebnu pa`nju treba obratiti kod asimptomatskih slu~ajeva, gde je jedino pogodno vreme za utvr|ivanje prisustva trichomonasa u uzetom uzorku vreme ovulacije, kada poja~ana sekrecija cervikalnog mukusa omogu}ava spiranje ove protozoe iz dubokih delova cervikalnih `lezda. Iste `ene ~esto imaju pozitivan nalaz u endometrijalnom uzorku. Metoda izbora u le~enju infekcije je upotreba Metronodazola, bilo oralno, {to je naj~e{}e, bilo u kombinaciji sa lokalnom upotrebom kod rezistentnih oblika.
antitela mogu da perzistiraju do 3 godine. Diferencijalna dijagnoza zahteva dodatne preglede, ili tokove titra, radi potvr|ivanja akutne faze bolesti. Prekoncepcijskom dijagnostikom ne mogu da se spre~e slu~ajevi toksoplazmoze u trudno}i {to ostavlja otvoreno pitanje, da li bi screening na toksoplazmozu pre ART assisted reproductive technology trebao da se preporu~i samo radi isklju~enja kasnijih te{ko}a u interpretaciji rezultata pregleda.
Virusne infekcije
Hepatitis B
Imunitet na hepatitis B mo`e da se proveri odre|ivanjem anti - HBs, da bi se u nedostatku antitela ponudila za{titna vakcinacija. Kontrola uspeha vakcinacije se vr{i 4 do 8 nedelja posle tre}e vakcinacije odre|ivanjem anti - HBs.
Toxoplasma gondii
Ukoliko do infekcije toxoplazmom do|e u trudno}i, oboleva fetus. Profilaksa vakcinacijom jo{ uvek nije na raspolaganju. Na osnovu podataka iz literature 50 do 80% svih pacijentkinja su seronegativne. Kod 20 do 50% `ena pregledom je dokazano postojanje imuniteta, odnosno inaktivne infekcije.
Kod `ena kod kojih je titar antitela toksoplazme pozitivan, utvr|uje se prisustvo IgG i IgM antitela. Ako pored IgG mo`e da se doka`e i prisustvo IgM, to ne dokazuje jo{ uvek akutnu infekciju po{to IgM
U praksi pacijentkinje koje su u programu za sprovo|enje ART - assisted reproductive technology retko se odlu~uju da sa~ekaju kompletiranje vakcinisanja nakon jedne godine. Posebno je va`no pitanje hroni~nog oblika hepatitisa B.
107
Odre|ivanje HBs - antigena slu`i za isklju~ivanje hroni~ne infekcije hepatitisom B. Ako je `ena HBs Ag - pozitivna, seronegativan partner bi trebalo da bude za{ti}en vakcinisanjem. Trudno}a i hroni~ni virus hepatitisa nemaju me|usobni uticaj. Verovatno}a vertikalne transmisije virusa sa majke na fetus korelira sa dokazom Hbs Ag, odn. HBV DNK - deoksiribonukleinske kiseline u krvi. Po{to neposredno post partum sprovedena simultana HBV-imunoprofilaksa i HBV vakcinacija {titi skoro 95% svih novoro|en~adi, Hbs Ag - screening je obavezni deo pripreme za program. Po{to su mnoge HBs Ag pozitivne `ene inficirane konatalno i ne opa`aju nikakvo ograni~enje kvaliteta `ivota, te{ko pristaju na odlaganje programa ART assisted reproductive technology. Adekvatnim razja{njenjem se uklanjaju i nedoumice pravne odgovornosti. Kod hroni~no agresivnih tokova i visokog optere}enja virusom trebalo bi da se razmisli o terapiji interferonom.
Hroni~ni hepatitis C i trudno}a ne uti~u jedno na drugo. Materno-fetalna transmisija je zavisna od maj~inog optere}enja virusom i u proseku iznosi 3% do 5%. Kod HCV DNK - deoksiribonukleinske kiseline koji mogu da se doka`u, ra~una se sa oko 1%, kod >106 kopija genoma/ml. Pri koinfekciji sa HIV-om dolazi do 25% fetalnih infekcija. Pre po~etka programa sprovode se hepatolo{ke opcije terapije radi smanjenja optere}enja virusom. To uspeva kod oko 50% svih le~enih pacijentkinja kroz kombinovano le~enje sa alfa-interferonom i ribavirinom. Program ART assisted reproductive technology se odla`e za 12 do 18 meseci. Inficirana novoro|en~ad su dugo vremena bez simptoma, nisu retka spontana izle~enja i virus perzistira u 50% do 60% slu~ajeva do odraslog doba. Hroni~na infekcija naj~e{}e dovodi samo do minimalnog o{te}enja jetre sa sporom postupno{}u.
Hepatitis C
Efikasnost vakcinacije stalno se smanjuje kod HVC zbog izra`enih pojava mutacija pojedina~nih genotipova i subtipova.
108
Trudno}a ne uti~e na tok HIV - human imunodeficijentni virus infekcije, koja nije uznapredovala, ali infekcija pove}ava verovatno}u komplikacija u trudno}i. Individualni materno-fetalni rizik transmisije ne mo`e da se ta~no utvrdi, ali su prognosti~ki povoljniji slu~ajevi sa niskim optere}enjem virusom, stabilnim tokom infekcije i nedostatkom aku{erskih faktora rizika. Po{to se virus prenosi prete`no u toku poro|aja, fetalni rizik od infekcije se smanjuje putem antiretroviralne terapije u trudno}i, odlu~ivanjem za poro|aj carskim rezom bez po~etka trudova, neonatalnom antiretroviralnom profilaksom i odustajanjem od dojenja. Time se posti`e smanjenje procenta obolevanja novoro|en~eta sa oko 20% na ispod 2%. Nejasne su mogu}e kasne posledice intrauterinske ekspozicije antiretroviralnim lekovima, posebno kod kombinovanih terapija, jer o najve}em broju supstanci postoje pojedina~na iskustva sa malim brojem dece pra}enih du`e od 5 godina od ro|enja. Postoji mogu}nost samo-inseminacije u ku}nim uslovima bez opasnosti od infekcije za zdravog partnera. Primena asistirane reprodukcije eksplicitno u prvi plan postavlja dobrobit deteta i zato, pre po~etka terapije mora bri`ljivo da se proceni rizik svakog pojedina~nog slu~aja uz uklju~enje nadle`ne eti~ke komisije.
Herpes kao seksualno prenosivo oboljenje uzrokovano je infekcijom herpes simplex virusom. ^e{}e se javlja kod `ena, jer je preno{enje sa mu{karca na `enu ~es}e nego sa `enskog na mu{kog partnera. Herpes virus se prenosi direktnim kontaktom, bilo da je re~ o seksualnom kontaktu, poljupcu ili kontaktu putem ko`e. Simptomi mogu da budu vrlo blagi i u nekim slu~ajevima infekcija mo`e da bude asimptomatska, umerena ili izra`ena. Nakon primarne infekcije, rekurentne epizode su naj~e{}e prve godine. Dijagnoza se postavlja uz pomo}: - testova krvi - mikroskopskog pregleda tkiva nakon skarifikacije - virusne kulture }elija - imunih testova - drugih testova kao {to su antigen test i Papa test. Dijagnoza genitalnog HSV- herpes simplex virus tip 1 infekcije je te{ka zbog toga {to se ova vrsta infekcije retko javlja, mnogo re|e nego infekcija HSV herpes simplex virus tip 2. Zato se ~esto HSV herpes simplex virus tip 2 ozna~ava kao herpes genitalis virus.
Herpes simplex virus tip 1 HSV 1 Herpes simplex virus tip 2 HSV 2
Postoji preko 80 poznatih tipova herpes virus-a od kojih osam izazivaju oboljenja kod ljudi. Me|u njima su naj~e{}i Herpes simplex tip 1 i 2. HSV 1 i HSV - 2 izgledaju skoro identi}no pod mikroskopom i oba tipa mogu da izazovu infekcije usta ili genitalija.
109
Porodica herpes virusa je velika. Ona obuhvata: - Epstain - Barrov virus - HSV - herpes simplex virus tip 1 i HSV - herpes simplex virus tip 2 - humani citomegalo virus - varicella zoster virus
Sl. 3.27- Herpes simplex virus tip 2 HSV 2 Herpes genitalis virus
HSV - herpes simplex virus u 1% do 5% mo`e da dovede do infekcije novoro|en~eta sub partum. Po{to stopa recidiva u poodmakloj trudno}i mo`e znatno da se smanji antivirusnom profilaksom indikovan je carski rez. Dokazivanje HS - herpes simplex virusa nema relevantnost za reproduktivnu medicinu.
Tabela 3-2: Infektolo{ka osnovna dijagnostika oba partnera pre ART assisted reproductive technology
Sl. 3.28- EBV - Epstein Barr virus
@ena bris vaginalni, vaginalna-pH hlamidije-do amplifikacije gena razmaz iz grli}a materice rubeola-HAH, po potr. Rubeola-IgG Vari~ela-antitela HBs-Ag, po potr. anti-HBsscreening anti-HVC anti-HIV
anti-HVC anti-HIV
110
tivnu medicinu, jer oni pri infekcijama u trudno}i dovode do fetalnih oboljenja i za njih ne postoji profilaksa vakcinacijom.
Za{titne vakcinacije su najdelotvorniji i najsigurniji instrument za smanjenje materno-fetalnih opasnosti od infekcije odre|enim virusima. U pripremi postupka asistirane reprodukcije u posebnoj meri se obra}a pa`nja na kompletiranje za{tite vakcinacijom prema starosnom dobu. U okviru prekoncepcijskog savetovanja treba da bude proveren status vakcinacije protiv vari~ela. U datim okolnostima se razja{njava polo`aj imuniteta kroz kontrolu antitela, a seronegativne `ene se vakcini{u protiv vari~ela.
Rubeolla
Sve pacijentkinje u programu ART assisted reproductive technology bi trebalo da budu vakcinisane protiv rubeole i da pokazuju dovoljan titar na antitela od 1:32 u testu HAH - hemoaglutinacije. Kod grani~nih titara ovog testa od 1:8 do 1:16 stanje imuniteta se razja{njava odre|ivanjem IgG rubeole pomo}u HIG hemolysis in gel testa ili ELISA - enzyme linked immunosorbent assay testa. Kod titara antitela ispod 1:8 sprovodi se MMR measles, mumps, rubella vakcinacija sa kontrolom uspeha vakcinisanja posle 4 do 6 nedelja.
111
Radi spre~avanja embrionalnih infekcija vakcinom trebalo bi da pro|e najmanje tri meseca izme|u davanja `ive vakcine i po~etka le~enja nekom od metoda asistirane reprodukcije. Prilikom davanja mrtvih inokulisanih materija nije potreban period ~ekanja izme|u davanja vakcine i po~etka le~enja.
Infekcije mogu da se jave u klini~koj, subklini~koj ili latentnoj formi. Klini~ka forma infekcije HPV - human papilloma virus-om su genitalne bradavice. Subklini~ka infekcija nije vidljiva golim okom, ali mo`e da bude prepoznata kolposkopskim pregledom cerviksa, vagine, vulve ili penisa. Tako|e, mo`e da se dijagnostikuje citolo{ki Papa testom, ili histolo{ki biopsijom. Latentna forma infekcije mo`e da se dijagnostikuje kori{}enjem molekularnih tehnika.
Faktori koji odre|uju u kojoj formi }e se infekcija javiti, jo{ uvek nisu jasni, ali je imuni mehanizam sigurno od velikog zna~aja. Vidljive anogenitalne bradavice izazvane HPV - human papilloma virus-om su tipa 6 i 11 i mogu se na}i na vulvi, cerviksu, vagini skrotumu ili anusu. Tipovi HPV - human papilloma virus 6 i 11 imaju nizak onkogeni potencijal i retko su povezani sa skvamoznim invazivnim karcinomom genitalnog trakta. Drugi anogenitalni tipovi HPV - human papilloma virus 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41-45 povezani su sa intraepitelnim neoplazijama i karcinomom skvamoznih }elija. Pretpostavlja se da je najmanje 80% odraslih seksualno aktivnih osoba u toku `ivota bilo inficirano sa jednim, ili vi{e tipova HPV - human papilloma virus. Oko 1% ima vidljivu infekciju, a oko 15% odraslih ima subklini~ku ili latentnu infekciju. Najve}i procenat HPV - human papilloma virus infekcija dijagnostikuje se kod odraslih `ivotne dobi izme|u 18 -28 godina. Posebno treba ista}i da HPV - human papilloma virus infekcije ~esto bivaju eliminisane spontano reakcijom imunog sistema i da jednom savladana HPV - human papilloma virus infekcija ostavlja imunitet na isti tip HPV- human papilloma virusa, ali ne i na eventualne budu}e infekcije drugim tipovima HPV - human papilloma virus. Infekcija se prenosi direktnim kontaktom, ali ne i putem krvi, ili telesnih te~nosti, kao {to je semena te~nost. Vertikalno preno{enje, auto ili heteroinokulacija se javljaju retko. Mesto infekcije su, pre svega, mukozne membrane i okolna ko`a genitalija. Latentni period varira. Obi~no se simptomi jave nakon tri do {est meseci od infekcije, ali je opisan i latentni period od vi{e meseci.
112
Treba posebno ista}i da }e se samo kod jednog broja `ena koje su bile izlo`ene infekciji nekog od tipova HPV - human papilloma virus-a razviti neoplazija na epitelu genitalnog trakta. HPV - human papilloma virus infekcija je samo jedan od multiplih faktora koji vode pojavi kancera i malo je verovatno da je izolovano ova infekcija dovoljna za izazivanje maligne transformacije epitela anogenitalnog trakta. Udru`eni sa jo{ uvek nedovoljno poznatim faktorima infekcija HPV - human papilloma virus tipovima 16,18,31 i 45 su izra`eno povezani sa anogenitalnim intraepitelijalnim displazijama i karcinomom skvamoznih }elija. HPV - human papilloma virus 16 je povezan sa dijagnostikovanjem cervikalnog i vulvarnog kancera, dok je tip 18 povezan sa dijagnostikovanjem adenokarcinoma cerviksa. Najve}i broj kancera skvamoznih }elija cerviksa prolazi prethodno kroz seriju takozvanih preinvazivnih mikroskopskih abnormalnosti. Savremena dijagnostika je pokazala prisustvo HPV - human papilloma virus-a DNK - deoksiribonukleinske kiseline u 100% biopsijskog materijala u slu~ajevima kancera. HPV - human papilloma virus je tako|e dokazan u 50 - 90% slu~ajeva vaginalnih kancera ili kancera penisa kao i kancera vulve kod mla|ih `ena. Posebno treba ista}i porast incidence VIN - vulvarnih intraepitelnih neoplazija. Zna~aj ranog dijagnostikovanja ovih promena je od izuzetne va`nosti s obzirom da je vreme od dijagnostikovanja VIN - vulvarnih intraepitelnih neoplazija III do pojave invazivne neoplazije manje od 8 godina. Iz ovih podataka jasno je da u slu~ajevima pozitivnog nalaza human papilloma
virus- a pre po~etka primene neke od metoda ATR assisted reproductive technology, treba sanirati infekciju i tek nakon ponovljene negativne kontrole u}i u program.
Mehanizmi koji kontroli{u energetski metabolizam i masu telesnog masnog tkiva su nerazdvojno povezani sa onima koji upravljaju plodno{}u i koji imaju korene u evolucionom nagonu za pre`ivljavanjem u trenucima sa ograni~enim izvorima hrane. Pove}ana pojava gojaznosti i metaboli~kih poreme}aja koji su povezani sa gojazno{}u, zna~e gubitak kontrole u ovom homeostatskom sistemu koji direktno uti~e na reprodukciju.
113
Poreme}aj metabolizma, kao {to je razvoj insulinske rezistentnosti, rezultuju iz sve ~e{}e pojave gojaznosti i imaju ozbiljan uticaj na porast zdravstvenih problema kao {to su dijabetes tip 2, kardiovaskularna oboljenja, dislipidemija i hipertenzija. Zna~ajan deo neplodne i subfertilne populacije je gojazno, ili ima vi{ak telesne te`ine uz obilje reproduktivnih komplikacija, uklju~uju}i menstrualnu disfunkciju, anovulaciju i spontani poba~aj. Razvoj gojaznosti i insulinske rezistencije ~esto idu zajedno sa razvojem problema infertiliteta. Adipozno tkivo funkcioni{e kao visoko specijalizovan endokrini i parakrini organ koji proizvodi niz adipokina i izaziva }elijski posredovane efekte preko proinflamatornih i antiinflamatornih }elija. Takvi faktori imaju lokalno i sistemsko biolo{ko dejstvo i uti~u na insulinsku osetljivost i razvoj bolesti kao {to je ateroskleroza. Adipokini i `enska plodnost su u slo`enoj interakciji sa energetskim metabolizmom na nivou hipotalamusa, pituitarne `lezde i perifernih tkiva, uklju~uju}i gonade, skeletne mi{i}e i adipozno tkivo. Mehanizmi koji doprinose pogor{anom fiziolo{kom uticaju insulina, koji obi~no idu uz gojaznost, mogu se manifestovati periferno u mi{i}ima, u adipoznom tkivu, ili u jetri. Metaboli~ke posledice sa razvojem insulinske rezistencije, uklju~uju pove}anje cirkulacije slobodnih masnih kiselina putem povi{ene lipoze i triglicerida u adipoznom tkivu i lipoproteina bogatih trigliceridima u ostalim tkivima. Isto tako, dolazi do smanjene potro{nje glukoze u mi{i}ima i adipoznom tkivu, zatim prevelikoj proizvodnji glukoze u jetri i insulina u b }elijama pankreasa. Stanje gojaznosti se karakteri{e osobinama hroni~ne inflamacije, naro~ito povi{enim nivoima citokina i inflamatornih
markera kao {to je C-reaktivni protein. Razni inflamatorni citokini, kao {to je interleukin 6 IL6 - interleukin i faktor-a nekroze tumora, TNFa - tumor necrosis factor a i nuklearni receptori, uklju~uju}i PPARg - peroksizom proliferatorno aktivirani receptor g, u~estvuju u etiologiji insulinske rezistencije koja se dovodi u vezu sa gojazno{}u. Veliku ulogu igraju i adipokini, leptin, rezistin i adiponektin u gojaznosti i insulinskoj rezistenciji. Postoje dokazi koji podupiru vezu izme|u insulina i plodnosti. Rezistin i adiponektin moduli{u homeostazu glukoze i masti, uti~u}i na delovanje insulina. Pove}ana produkcija i lu~enje leptina je u korelaciji sa koli~inom masnog tkiva. Leptin smanjuje uzimanje hrane i odr`ava energetsku homeostazu, ali kod gojaznosti razvoj rezistentnosti na leptin rezultuje disfunkcionalnim energetskim stanjem. Gojazne osobe imaju povi{ene nivoe rezistina u serumu, ali su adipozni nivoi mRNK - messenger ribonucleic acid rezistina generalno ni`i, ili nepromenjeni kod ovih modela, {to se mo`e objasniti izmenjenim translacionim ili posttranslacionim modifikacijama proteina rezistina, ili izmenjenim metaboli~kim uklanjanjem rezistina. Gojazni ljudi i oni sa ve}im indeksom telesne mase BMI - body mass index, imaju ve}e serumske i adipozne nivoe ekspresije rezistina. Na{e razumevanje biolo{kog zna~aja i funkcija leptina i rezistina je jo{ uvek u za~etku. Potencijalne interakcije izme|u adipokina i energetske homeostaze se obja{njavaju time da pro{ireno adipozno tkivo kod gojaznosti uti~e na pove}anje produkcije leptina i rezistina i na smanjenje produkcije adiponektina. Interakcije izme|u ovih adipokina i adipoznog tkiva, skeletnih mi{i}a, jetre i pankreasa mogu
114
Leptin
Leptin se uglavnom proizvodi u adipoznom tkivu kao signal zasi}enosti u regulisanju uzimanja hrane i tro{enja energije. Leptin, hormon zasi}enja, se vezuje za duga~ki oblik leptinskog receptora Ob-Rb u hipotalamusu u cilju smanjenja NPY - neuropeptida Y i pove}anja POMC pro opiomelanokortina i neuronske aktivnosti kokainsko-amfetaminskog proteina, CARP - cocaine amphetamine related proteine, efektivno smanjuju}i apetit i uzimanje hrane. Smatra se da nedostaci u signaliziranju leptinom i funkcionisanja u hipotalamusu doprinose razvoju gojaznosti.
Signalizacija leptinskih receptora u perifernim tkivima uklju~uje razne transkripcione faktore, kao {to je aktivacija transdjusera signala i aktivatora transkripcije 1 STAT signal transducers and activator of transcription 1 i STAT - signal transducers and activator of transcription 3 u adipoznom tkivu i STAT 3 - signal transducers and activator of transcription i AKT protein kinase B (PKB) u skeletnim mi{i}ima. Pove}anje oksidacije masnih kiselina, putem leptina, u skeletnim mi{i}ima je pripisano aktivaciji }elijske signalne putanje proteinske kinaze osetljive na hranljive sastojke i aktivirane sa AMP - adenosine monophosphate-om.
Adiponectin
Adiponektin, prvobitno nazvan ACRP 30 adiponektin-adipocyte complement related protein of 30kDa, AMP - adenosine monophosphate 1 i gbp 28 je prvi put opisan kod kultivisanih murinskih adipocita 3T3L1 pre desetak godina. Proizvodi se u velikim koli~inama u adipoznom tkivu. Adiponektinski gen se nalazi na hromozomu 3q27 u regiji koja je nedavno mapirana kao locus suscebtibilnosti za tip 2 dijabetesa i adipoznosti. Smatra se da povezuje gojaznost sa insulinskom rezistencijom. Receptori adiponektina, adipo R1 i adipo R2, su nedavno otkriveni kod mi{eva, dok je identifikovan i tre}i receptor, T cadherin. Adiponektin funkcioni{e kao agens, osetljiv na insulin, putem smanjivanja produkcije glukoze i pobolj{avanjem delovanja insulina u jetri. Osim toga, adiponektin smanjuje aktivnost glukoneogenih enzima fosfoenolpiruvat karboksikinaze PEPCK phosphenolpyruvate carboxykinase, gluko ze-6 fosfataze i smanjuje oksidaciju masnih kiselina u jetri. Direktno dejstvo na produk-
Veza izme|u insulinske rezistencije i plodnosti je opisana kod mi{eva sa nedostatkom leptina. Oni ispoljavaju ozbiljnu insulinsku rezistenciju i umanjenu plodnost. Leptin ima ulogu u metabolizmu masti u perifernim tkivima uz ograni~eni direktan uticaj na metabolizam glukoze. On deluje nasuprot insulinu i smanjuje njegovu produkciju u b }elijama pankreasa indirektno uti~u}i na metabolizam glukoze, na transport glukoze do skeletnih mi{i}a preko hipotalamusa i centralnog nervnog sistema. Leptin pove}ava lipolizu u adipoznom tkivu i }elijama i u skeletnim mi{i}ima.
115
ciju insulina tek treba utvrditi. Adiponektin pove}ava oksidaciju masnih kiselina u jetri, putem smanjenja ekspresije CD36 cyclodextrin i smanjuje dotok masnih kiselina i triglicerida jetre. Smanjenje akumuliranja triglicerida u skeletnim mi{i}ima uklju~uje pove}ano izbacivanje proteina koji transportuju lipide CD36 - cyclodextrin, pove}anu oksidaciju acyl-CoA oksidaze i pove}anje energije rasparuju}i protein 2, UCP2 uncoupling protein. Iako nije potpuno definisana, postreceptorska signalizacija, u koju su uklju~eni AMPK activated protein kinase i acetil-CoA karboksilaza ACC aminocyclopropane 1 carboxylic acid, p38 mitogenaktiviraju}a proteinska kinaza AMPK activated protein kinase i PPAR - peroksizom proliferatorno aktivirani receptor je opisana kod skeletnih mi{i}a, jetre i adipocita i smatra se da reguli{e metabolizam glukoze i lipida. Transgenski mi{ji model kod koga se generi{e dvostruko ili trostruko vi{e cirkuli{u}eg adiponektina je pobolj{ao hepatsku osetljivost na insulin, mada studije koje koriste adiponetske nok-out modele tek treba da poka`u jasnu vezu sa homeostazom glukoze kod raznih kontrolnih i dijetskih tretmana.
Rezistin
Otkri}e rezistina poznatog kao FIZ3 found inflammatory zone 3 i kao adipocitnog specifi~nog sekretornog faktora ADSF adipocyte specific secretory factor je bilo zajedni~ko kod tri odvojene grupe. S obzirom na po~etna o~ekivanja da }e rezistin biti veza izme|u gojaznosti i dijabetesa, otkri}e niske me|uvrsne sekventne homologije tj. razli~itih hromozomnih lokacija gena kod razli~itih vrsta i razli~itih mesta sinteze je rezultovalo konfuzijom o ulozi rezistina u razvoju gojaznosti i insulinske rezistencije.
Ekspresija rezistinske mRNK - messenger ribonucleic acid je kod humanih adipocita niska. Iako proliferacija uzgajanih ljudskih adipocita, koja je izmenjena rezistinom, nije uticala na tro{enje glukoze, ili na fosforilaciju AKT - protein kinase B (PKB), pove}ava se verovatno}a da kod ljudi rezistin ne u~estvuje direktno u homeostazi glukoze u adipocitima. Rezistin se izbacuje kod makrofaga i monocita {to nagove{tava da mo`e da uti~e na insulinsku rezistenciju putem dejstva na inflamaciju. Prema tome, direktna uloga rezistina kod gojaznosti i u kori{}enju glukoze nije sasvim potvr|ena, jer se kod ~oveka mo`e povezati sa funkcionisanjem adipoznog tkiva, a ne sa insulinskom rezistencijom.
Adipokini i plodnost
Dokazi koji podupiru vezu izme|u adipokina, izlu~enih iz adipoznog tkiva, i `enske plodnosti se mogu razmatrati na ~etiri nivoa; - centralno dejstvo na hipotalamus i pituitarnu `lezdu; - periferni uticaj na jajnike i reproduktivni trakt; - direktno dejstvo na oocite i embrion; - uticaj tokom trudno}e.
116
Pro{ireno adipozno tkivo izaziva pove}anje produkcije leptina i rezistina i smanjenje produkcije adiponektina. Potencijalne interakcije izme|u ovih adiponektina i hipotalamusa, pituitarne `lezde, jajnika, oocita, embriona i `enskog reproduktivnog trakta, mogu imati direktne i indirektne uticaje na `ensku reprodukciju.
za pove}anje, zajedni~ki za oba pola. Prema tome, postoji delovanje adipokina na centralnom nivou hipotalamusa i pituitarne `lezde u regulisanju pubertetskog razvoja i cikli~ne `enske plodnosti. Centralna uloga leptina u plodnosti je da uti~e na lu~enje GnRH - gonadotropin releasing hormon-a iz hipotalamusa i na lu~enja LH - luteinizing hormone-a i FSH follicle stimulating hormone-a iz pituitarne `lezde. Dostupnost hranljivih supstanci uti~e na ovo centralno dejstvo, dok uzdr`avanje od hrane izaziva smanjenje nivoa leptina i LH - luteinizing hormona. Eksperimenti sprovedeni in vitro kada se koristilo tkivo od dobro hranjenih glodara i svinja pokazali su da je leptin stimulisao osloba|anje GnRH - gonadotropin releasing hormona iz }elija hipotalamusa, kao i osloba|anje LH - luteinizing hormona i FSH - follicle stimulating hormona iz adenohipofizalnih }elija, {to nagove{tava da su hipotalamus i pituitarna `lezda centralna mesta delovanja leptina.
117
Centralna uloga leptina i interakcije me|u vrstama i nutricioni status tek treba da budu dalje ispitani, ali nagove{tavaju mogu} razvoj centralne leptinske rezistencije kada je energetski balans pozitivan, ili neutralan. Bilo kakva predikcija centralne uloge adiponektina, ili rezistina u interakciji sa GnRH - gonadotropin releasing hormonom i produkcijom gonadotropina kao i u regulisanju energetskog metabolizma je za sada preuranjena. Eksperimentalne studije koje su koristile uzgajane neurone hipotalamusa nisu pokazale stimulativni uticaj adiponektina na produkciju raznih neuro-transmitera koji u~estvuju u centralnom energetskom metabolizmu. Ekspresija rezistinske mRNK messenger ribonucleic acid je bila lokalizovana na pituitarnu `lezdu i hipotalamus, ali nije bilo ekspresije adiponektina iz ovih tkiva. Nivoi ekspresije rezistina su bili niski kod pituitarnih `lezda mi{eva pri ro|enju i pove}avali su se do najve}e vrednosti u pubertetu {to je suprotno od dosledne ekspresije iz }elija hipotalamusa tokom ~itavog razvoja. Promene u ekspresiji pituitarne `lezde, u vreme puberteta, zahteva signale iz hipotalamusa {to je bilo demonstrirano odsustvom ekspresije rezistina kod prepubertalnih mi{eva sa uklonjenim }elijama hipotalamusa. Osim toga, smanjenje pituitarnih nivoa rezistina kod gojaznih mi{eva, u pore|enju sa kontrolnim mi{evima, daju te`inu vezi izme|u rezistina i centralne kontrole hranjenja i gojaznosti. Iako izve{taj o mu{kim glodarima nagove{tava da je ekspresija rezistina u testisu regulisana pituitarnim hormonima LH - luteinizing hormone-a i FSH - follicle stimulating hormone-a, sli~ne studije `enskog reproduktivnog tkiva tek treba da budu dokumentovane. Dalje istra`ivanje uloge rezistina u centralnom
energetskom metabolizmu i produkciji gonadotropina }e nesumnjivo pru`iti uvid u njegovu funkciju u dostizanju puberteta i u regulaciji `enske plodnosti. Centralna ekspresija adiponektina i njegovih receptora u hipotalamusu i pituitarnoj `lezdi tek treba da bude ispitana. Kao {to je re~eno, adiponektin funkcioni{e u perifernim tkivima preko AMPK activated protein kinase. Leptin, tako|e, funkcioni{e preko ovog puta i u hipotalamusu inhibira AMPK - activated protein kinase aktivaciju izazivaju}i smanjenje uzimanja hrane. Nasuprot ovom centralnom delovanju, leptin stimuli{e AMPK - activated protein kinase aktivaciju u skeletnim mi{i}ima, a ovu stimulaciju odra`ava i adiponektin u raznim perifernim tkivima. Po{to oba adiponektina funkcioni{u u cilju stimulisanja AMPK - activated protein kinase u perifernim tkivima, razumljivo je da adiponektin uti~e centralno na kori{}enje energije preko istog AMPK activated protein kinase mehanizma kao i leptin u hipotalamusu. Uzrok neplodnosti kod gojaznosti je u vezi sa smanjenom ekspresijom leptinskog receptora i povi{enim nivoima neuropeptida-Y u hipotalamusu, odnosno smanjene centralne leptinske osetljivosti i smanjene GnRH - gonadotropin releasing hormon pulsativnosti.
118
leptina na ovulaciju koja je nezavisna od GnRH - gonadotropin releasing hormona i LH - luteinizing hormona i od lokalne funkcije u jajniku kao {to je indukcija ADAMTS 1- a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 1, mada se ne mogu isklju~iti i neke druge putanje delovanja hipotalamusa. Podaci koji se ti~u serumskih i lokalnih nivoa adiponektina u ovarijumu, u odnosu na anovulatorni poreme}aj kod sindroma policisti~nih jajnika, nisu ba{ uvek jasni. Ovo ostaje zna~ajno polje za budu}e istra`ivanje. Steroidni hormoni rastvorljivi u mastima se proizvode steroidogenezom }elija jajnika, a adipokini koji poti~u od adipocita mogu imati lokalizovanu funkciju u ovom procesu. Ekspresija leptinske mRNK - messenger ribonucleic acid i proteina u granuloznim i teka }elijama, podupire ovu mogu}nost. Leptin uti~e na steroidogenezu u izolovanim }elijama ovarijuma modulisanjem metaboli~kog delovanja insulina i IGF-1 - insulin like growth factor i stimulatornog delovanja gonadotropina kod ljudi. Nivoi leptina u krvi su u bliskoj korelaciji sa nivoima progesterona tokom ~itavog menstrualnog ciklusa kao i sa estradiolom i HCG - human chorionic gonadotropin-a tokom trudno}e. Uloga adiponektina u ovarijalnoj steroidogenezi je verovatna s obzirom na negativne uticaje testosterona na cirkulaciju adiponektina. Takvu interakciju je pokazao rezistin koji ima stimulativni uticaj na produkciju testosterona od strane uzgajanih theca }elija koje deluju zajedno sa insulinom. Rezistin je, u zavisnosti od doze, pove}ao produkciju testosterona u uzgajanom testisu mi{a a adrenalni androgen dehidroepiandrosteron DHEA - dehydroepiandrosterone je smanjio mRNK -
messenger ribonucleic acid ekspresiju rezistina u adipoznom tkivu uzetom od mi{a. Leptin i njegovi receptori mRNK - messenger ribonucleic acid i protein se ekspresuju u jajovodu i endometrijumu {to nagove{tava mogu}e u~estvovanje u receptivnosti endometrijuma za embrion koji se razvija.
119
je va`an aspekt plodnosti koji je preispitivan, uglavnom, zbog uloge leptina. Placenta koja se razvija ekspresuje leptin i njegov receptor, a potvr|ena je i produkcija rezistina. Nivoi serumskog i placentarnog razistina se pove}avaju sa napretkom trudno}e {to je u suprotnosti sa nivoima leptina. Ovi nivoi su u uzajamnoj vezi sa stanjem smanjene insulinske osetljivosti koja se ~esto pojavljuje u kasnijim etapama trudno}e, doprinose}i uspe{nom razvoju fetusa. Adiponektin i njegovi receptori R1 i R2 su tako|e lokalizovani na placenti. Placentarna ekspresija adiponektinske mRNK messenger ribonucleic acid pove}ana je tokom trudno}e i smanjuje se kao reakcija na ograni~enja u ishrani, dok je ekspresija adipo R2 receptora smanjena tokom trudno}e, ali ostaje nepromenjena u slu~aju slabije ishrane, {to jasno govori o ulozi adipokina u odr`avanju normalne trudno}e. Adipokini, leptin, adiponektin i rezistin koje proizvodi adipozno tkivo i menja se sa gojazno{}u, uti~u na energetsku homeostazu i na `ensku plodnost. Leptin menja produkciju GnRH - gonadotropin releasing hormon-a i gonadotropina i ima slo`enu ulogu u funkcionisanju jajnika i endometrijuma kao i u razvoju embriona. Uticaj leptina na `ensku plodnost ima potencijalne implikacije i na ostale adipokine koji i sami sli~no funkcioni{u u regulisanju energetskog metabolizma. Rezistin u~estvuje u funkcionisanju placente i jajnika, a njegova lokalizacija u mozgu negove{tava mogu} periferni i centralni uticaj u kontroli energetskog metabolizma i plodnosti. Dana{nji dokazi ne potvr|uju sasvim centralnu ulogu adiponektina, ali nedavno utvr|ena ekspresija njegovih receptora u jajniku i signalizacija putem AMPK - acti-
vated protein kinase putanje za detektovanje hranljivih supstanci u drugim perifernim tkivima, pokazuje budu}e na~ine za ispitivanje adiponektina.
Sl. 3.37- Ultrazvu~ni izgled ovarijuma kod PCOS - polycystic ovarian syndrome
b) Neklasi~ni PCO - polycystic ovarian ili PCO - polycystic ovarian varijante Ovo stanje se mnogo ~e{}e javlja nego klasi~na forma obolenja. Pacijenti imaju samo neku od opisanih manifestacija, ali ne sve.
120
Pacijenti sa PCO - polycystic ovarian imaju poreme}aj nekoliko hormonskih sistema koji vode do abnormalne ovulacije, hirzutizma i insulin resistencije.
Dijagnosti~ki kriterijumi
Osnove dijagnosti~kih kriterijuma su prvi put postavljene 1990. godine i nekoliko puta dopunjene.
Tabela 3-3: Dijagnosti~ki kriterijumi sindroma policisti~nih jajnika
Kriterijumi iz 1990. godine (1 i 2) 1. 2. Hroni~na anovulacija Klini~ki i/ili biohemijski znaci hiperandrogenizma i isklju~enje ostalih etiologija Revidirani kriterijumi iz 2003. godine (2 od 3) Oligo ili anovulacija Klini~ki i/ili biohemijski znaci hiperandrogenizma Policisti~ni jajnici i isklju~enje ostalih etiologija, kongenitalna adrenalna hiperplazija, tumori koji lu~e androgen, Kuingov sindrom
1. 2.
jajnicima izlo`ene su zna~ajno ve}em riziku od insulinske rezistencije od onih sa hiperandrogenizmom i redovnim ciklusima. U skladu sa tim, veoma je va`no da studije metaboli~kih osobina sindroma policisti~nih jajnika defini{u `ene u skladu sa ovulatornom funkcijom, na primer, hroni~na oligo/amenorea naspram redovnih ciklusa. Genetske studije su va`ne za razumevanje spektra fenotipa i za identifikovanje susceptibilnih gena sa sindromom policisti~nih jajnika. U studijama se mogu koristiti u`i dijagnosti~ki kriterijumi radi identifikacije pogo|enih pojedinaca, kao {to je samo prisustvo policisti~nih jajnika, ili hiperandrogenizam per se. Kruta definicija sindroma policisti~nih jajnika zasnovana na dana{njim ili nekada{njim dijagnosti~kim kriterijumima mo`e sputavati na{e razumevanje ovog heterogenog poreme}aja.
3.
Gore navedeni dijagnosti~ki kriterijumi nisu pogodni za ispitivanja koja se fokusiraju samo na klini~ke ishode kod `ena sa sindromom policisti~nih jajnika. Ispitivanja koja se fokusiraju na trudno}u kao ishod, mogu vi{e da naglase anovulaciju kao simptom identifikacije umesto prisustva policisti~nih jajnika, ili klini~kog hiperandrogenizma. Sli~no tome, ispitivanja u slu~ajevima hirsutizma mogu manje da naglase osnovnu ovulatornu funkciju. @ene sa hroni~nom anovulacijom i hiperandrogenizmom i/ili policisti~nim
121
kod pacijenata nije ~e{}e od pojavljivanja kod normalnih `ena u reproduktivnom dobu. Pregled `ena koje ispoljavaju oligo ili anovulaciju uklju~uje i procenu FSH - follicle stimulating hormone seruma i nivoe E2 - estradiola da bi se isklju~io hipogonadotropni hipogonadizam, tj. centralno poreklo ovarijske disfunkcije, ili prerana insuficijencija ovarijuma koja se karakteri{e niskim E2 - estradiolom i visokim FSH - follicle stimulating hormone koncentracijama, u skladu sa klasifikacijom. Sindrom policisti~nih jajnika je deo spektra normogonadotropno normoestrogenske anovulacije. Treba naglasiti da su koncentracije LH - luteinizing hormona ~esto povi{ene kod ovih pacijenata, o ~emu }e kasnije biti re~i. Rutinsko merenje PRL - prolaktina u procenjivanju hiperandrogenih pacijenata se obavlja zbog isklju~enja hiperprolaktinemije uz napomenu da kod mnogih hiperandrogenih pacijenata nivoi PRL prolaktina mogu biti na gornjoj granici normale ili neznatno iznad nje. Treba isklju~iti insulinsku rezistenciju koja se javlja i kod sindroma hiperandrogenske insulinsko rezistentne acanthosis nigricans, Ku{ingov-og sindroma i androgenske sekretne neoplazme.
Potrebno je naglasiti da jo{ uvek nedostaju normativni podaci velikih populacija, da je procena hirsutizma relativno subjektivna, da mali broj lekara u klini~koj praksi koristi standardizovane metode procenjivanja i da se hirsutizam ~esto le~i mnogo pre nego {to se pacijent endokrinolo{ki ispita. Hirsutizam mo`e biti zna~ajno manje ra{iren kod hiperandrogenih `ena koje poti~u iz isto~ne Azije, kao i kod adolescenata. Za samo prisustvo akni se smatralo da je potencijalni marker hiperandrogenizma, mada su rezultati studija po pitanju ta~ne ra{irenosti vi{ka androgena kod ovih pacijenata razli~iti. Samo prisustvo androgene alopecije kao indikatora hiperandrogenizma je daleko manje prou~avano. Izgleda da je ona relativno lo{ pokazatelj vi{ka androgena osim, ako je prisutna kod oligoovulatornog pacijenta. Ukupno posmatrano, klini~ki dokazi hiperandrogenizma su va`na osobina pacijenata sa sindromom policisti~nih jajnika i pored gore pomenutih ograni~enja.
Biohemijski hiperandrogenizam
Ve}ina pacijenata sa sindromom policisti~nih jajnika ima dokaze o hiperandrogenemiji i najnovija zapa`anja pokazuju da cirkulatorni nivoi androgena, tako|e, mogu da predstavljaju nasle|eni faktor vi{ka androgena. Deo pacijenata sa sindromom policisti~nih jajnika ne mora da prikazuje abnormalnost cirkulatornih androgena. Definisanje vi{ka androgena merenjem serumskog androgena su ~esto neprecizna zbog promenljivosti laboratorijskih metoda merenja, jer postoji vi{e androgena koji se ne mogu uzimati u obzir. Tako|e, postoji
Hiperandrogenizmi
Klini~ko odre|ivanje fenotipa sindroma policisti~nih jajnika uklju~uje utvr|ivanje prisustva klini~kog i/ili biohemijskog vi{ka androgena, hiperandrogenizma uz istovremeno isklju~ivanje poreme}aja koji se sa njima povezuju.
Klini~ki hiperandrogenizam
Primarni klini~ki indikator vi{ka androgena je prisustvo hirsutizma.
122
{iroka varijabilnost u populaciji, normativni kriterijumi nisu precizno utvr|eni, nisu uzimani u obzir starost i indeks telesne mase i postoji malo normativnih podataka o adolescentima, kao i o starijim `enama. Koncentracija androgena se smanjuje br`e hormonalnom supresijom i mo`e ostati suprimirana ~ak i nakon prestanka hormonskog tretmana. I pored ovih ograni~enja, smatra se da su merenja slobodnog testosterona, ili indeksa slobodnog T, slobodni androgen, osetljivije metode procene hiperandrogenemije. Preporu~ene metode za procenu slobodnog androgena uklju~uju ravnote`nu dijalizu, prora~un slobodnog T-testosterona iz merenja polno vezuju}eg globulina i ukupnog T - testosterona, ili talo`enje amonijum sulfata. Utisak uniformnosti trenutno dostupnih direktnih testova slobodnog T-testosterona ima ograni~enu vrednost, naro~ito u proceni hiperandrogene `ene. Napomenuto je da samo merenje ukupnog T - testosterona ne mo`e biti osetljiv marker vi{ka androgena. Mali deo pacijenata sa sindromom policisti~nih jajnika mogu imati izolovano povi{enje nivoa DHEAS - dehydroepiandrosterone sulfate. Neki su smatrali da je merenje ukupnog T - testosterona i DHEAS- dehydroepiandrosterone sulfate imalo neku vrednost u detekciji pacijenta sa tumorom koji lu~i androgen, mada noviji podaci pokazuju da je najbolji prediktor ovih neoplazmi klini~ka prezentacija. Kona~no, na raspolaganju je malo podataka o vrednosti rutinskog merenja androstenediona kod hiperandrogenih pacijenata, mada je napomenuto da on mo`e biti malo povi{en kod pacijenata sa 21hidroksilazno deficijentnom neklasi~nom adrenalnom hiperplazijom u odnosu na pacijente sa sindromom policisti~nih jajnika. Bez obzira na to, malobrojnost normativnih
Policisti~ni jajnici
Na osnovu dosada{njih istra`ivanja stav je da policisti~ni jajnici treba da se smatraju kao jedan od mogu}ih kriterijuma sindroma policisti~nih jajnika. Prema dostupnoj literaturi, kriterijumi koji imaju dovoljnu specifi~nost i osetljivost da defini{u policisti~ne jajnike su slede}i: - prisustvo 12 ili vi{e folikula pre~nika 2 - 9 mm u svakom jajniku i/ili pove}ana zapremina jajnika, preko 10 ml. Subjektivni izgled policisti~nih jajnika ne treba biti zamenjen ovom definicijom. Raspodela folikula treba biti izostavljena kao i pove}anje stromalne ehogeni~nosti i zapremine. Iako pove}ana stromalna zapremina predstavlja osobinu policisti~nih jajnika, pokazalo se da je merenje zapremine jajnika dobar surogat kvantifikaciji stromalne zapremine u klini~koj praksi. Ova definicija ne va`i za `ene koje oralno uzimaju kontraceptivne pilule po{to njihova upotreba modifikuje morfologiju jajnika kod normalnih `ena i `ena sa policisti~nim jajnicima. Samo jedan jajnik koji odgovara ovoj definiciji je dovoljan da defini{e policisti~ne jajnike. Ako postoje dokazi o dominantnom folikulu, preko 10 mm, ili corpus luteum, skeniranje treba ponoviti tokom slede}eg ciklusa. Prisustvo abnormalne ciste ili asimetrije jajnika, {to mo`e da nagovesti homogenu cistu, zahteva dalje ispitivanje. @ene sa regularnom menstruacijom treba da se pregledaju u ranoj folikularnoj fazi, 3 5. dana ciklusa. Prora~un zapremine jajnika se obavlja pomo}u pojednostavljene formule produ`enog elipsoida, 0.5 x du`ina x {irina x debljina.
123
Vrednost praga od 10 cm3 za OV - ovarijalni volumen odre|ena je na internacionalnom Kongresu o sindromu policisti~nih jajnika odr`anom u Roterdamu 2003.godine. Bazirana je na odgovaraju}im studijama analize krive ROC - reciever operator characteristic. Pored srednjeg ovarijalnog volumena, odre|uju se i ovarijalna povr{ina OA - ovarian area i broj folikula FN - follicle number. Ultrazvu~ni pregled jajnika daje karakteristi~an nalaz koji se u svim diferencijalno dijagnosti~ko sumnjivim slu~ajevima proverava laparoskopskim pregledom.
Broj folikula treba da se proceni u uzdu`nom i antero-posteriornom popre~nom preseku jajnika. Veli~ina folikula do 10 mm treba da bude izra`ena kao srednja vrednost pre~nika merenih na dve sekcije.
laciji 10 - 25 % po obavljenim dinami~kim studijama delovanja insulina. Kriterijumi definisanja grani~ne ta~ke abnormalnosti se razlikuju. Insulinska rezistencija kod `ena sa sindromom policisti~nih jajnika se javlja i do 50 %, kako kod gojaznih tako i kod negojaznih `ena. Izve{taji o preovla|ivanju insulinske rezistencije kod `ena sa sindromom policisti~nih jajnika variraju u zavisnosti od osetljivosti i specifi~nosti primenjenih testova i heterogenosti sindroma. Trenutno ne postoji punova`ni klini~ki test za detekciju insulinske rezistencije u op{toj populaciji. Dinami~ki invazivni testovi, kao {to je euglikemijska veza i test tolerancije glukoze su naj}e{}e dijagnosti~ke procedure. Postoji nekoliko ograni~enja za njihovu {iru klini~ku upotrebu zbog mogu}e promene funkcije beta }elija sa razvojem dijabetesa {to menja osetljivost testova, kao i normalno fiziolo{ko kolebanje nivoa insulina i nedostatak standardizovanog univerzalnog testa insulina. Isto tako, razvijeni su kriterijumi za definisanje metaboli~kog sindroma koji uklju~uju komponente koje se dovode u vezu sa sindromom insulinske rezistencije, uklju~uju}i centripetalnu gojaznost, hipertenziju, hiperglikemiju i dislipidemiju.
Tabela 3-4: Kriterijumi metaboli~kog sindroma kod `ena sa sindromom policisti~nih jajnika
Insulinska rezistencija
Insulinska rezistencija se dovodi u vezu sa reproduktivnim abnormalnostima kod `ena sa sindromom policisti~nih jajnika. Pobolj{anje insulinske osetljivosti kroz na~in `ivota i farmakolo{ku intervenciju mo`e popraviti ove abnormalnosti. Insulinska rezistencija, definisana kao smanjeno kori{}enje glukoze posredovano insulinom, se ~esto pronalazi u ve}oj popu-
Faktor rizika Abdominalna 1 gojaznost (obim struka) 2 Trigliceridi 3 HDL-C 4 Krvni pritisak tolerancije 5 Test glukoze
Grani~na vrednost >88 cm >150 mg/dL <50 mg/dL >130/ >85 110-126 mg/dL i/ili 2-h glukoza 140-199 mg/dL
124
Neki autori su preporu~ili dodavanje ovim testovima i test tolerancije glukoze radi procene nivoa glukoze po kriterijumima Svetske zdravstvene organizacije. IGT - impaired glucose tolerance test je dugo bio priznat kao metoda odre|ivanja faktora rizika za dijabetes. Pored toga, IGT - impaired glucose tolerance test identifikuje i pojedince koji su izlo`eni riziku visokog mortaliteta, naro~ito kod `ena. Me|u gojaznim `enama sa sindromom policisti~nih jajnika, preporu~uje se testiranje ovom metodom. Trenutno ima malo podataka koji bi potvrdili da markeri insulinske rezistencije mogu da predvide uspeh terapije. Prema tome, uloga ovih markera u dijagnostikovanju sindroma policisti~nih jajnika, kao i u izboru specifi~nih tretmana, nije do kraja definisana. Potrebne su dodatne studije za identifikovanje prediktivnih faktora, ili faktora pokazatelja uspeha le~enja sindroma policisti~nih jajnika.
Luteiniziraju}i hormon
Apsolutni nivo cirkuli{u}eg LH luteinizing hormone-a, kao i njegova veza sa nivoima FSH - follicle stimulating hormone-a, su zna~ajno povi{eni kod `ena sa sindromom policisti~nih jajnika u pore|enju sa kontrolnim `enama usled pove}ane amplitude i frekvencije osloba|anja LH - luteinizing hormona. Povi{ene koncentracije LH - luteinizing hormone-a iznad 95% od normalnog se mogu primetiti kod pribli`no 60% `ena sa sindromom policisti~nih jajnika. Odnos LH - luteinizing hormona /FSH - follicle stimulating hormona mo`e biti povi{en kod 95% pacijenata. Na nivoe LH - luteinizing hormona mo`e uticati vremenska veza sa ovulacijom koja prolazno normalizuje LH - luteinizing hormone.
Potencijalno negativno dejstvo LH luteinizing hormona na ljudsku reprodukciju je veoma kontraverzno. Neki istra`iva~i su tvrdili da visoki nivoi LH - luteinizing hormone-a mogu imati {tetan uticaj na zrelost oocita i oplodnju, a mogu rezultovati i manjim brojem trudno}a i ve}im brojem poba~aja. Me|utim, druge studije nisu pokazale nepovoljne uticaje LH - luteinizing hormone-a na kvalitet oocita i embriona, oplodnju, implantaciju i broj trudno}a. Smanjenje nivoa endogenog LH - luteinizing hormone-a sa GnRH - gonadotropin releasing hormon agonistima je, tako|e, dalo opre~ne rezultate, po{to su neke studije nagovestile da bi se tako mogao da smanji broj poba~aja, dok su druge dovodile u pitanje ovaj terapeutski uticaj. Na osnovu gore pomenutih podataka, smatra se da merenje nivoa seruma LH luteinizing hormona nije neophodno za klini~ku dijagnozu sindroma policisti~nih jajnika. Nivoi LH - luteinizing hormone-a mogu biti korisni kao sekundarni parametar, naro~ito kod mr{avih `ena sa amenorejom, ili u istra`ivanju. Potrebno je dodatno istra`ivanje radi daljeg razja{njenja klini~kog zna~aja LH luteinizing hormona kod sindroma policisti~nih jajnika kao i potencijalnog uticaja supresije LH - luteinizing hormona sa GnRH - gonadotropin releasing hormon analozima.
125
dijabetesa tipa 2 i kardiovaskularnih bolesti. Stanja insulinske rezistencije uti~u na pove}anje incidence koronarne bolesti srca, a kod `ena sa sindromom policisti~nih jajnika ima dokaza o dislipidemiji i prisustvu markera abnormalne vaskularne funkcije. U drugim studijama nisu potvr|eni direktni dokazi za pove}anje pojave koronarne sr~ane bolesti, mada je pojava mo`danog udara neznatno pove}ana. Za `ene sa sindromom policisti~nih jajnika se, tako|e, misli da su pod pove}anim rizikom za dobijanje endometrijalnog karcinoma. Epidemiolo{ki dokazi koji bi potkrepili ovu pretpostavku su ograni~eni. Potrebna su dodatna istra`ivanja radi procene nivoa rizika, omogu}avanja identifikacije pacijenata koji su izlo`eni riziku, pru`anja longitudinalnog naknadnog pra}enja `ena sa sindromom policisti~nih jajnika u njihovim kasnijim godinama i odre|ivanja mesta, vremena i efikasnosti intervencionih mera.
tretira regulisanjem telesne te`ine i upotrebom antidijabetika. Usmeravaju}i le~enje na ove metaboli~ke abnormalnosti pospe{uje se uspeh indukovanja ovulacije i le~ena infertiliteta kod ovih `ena. Stoga se do{lo na ideju uvo|enja lekova koji se koriste u terapiji dijabetesa u kombinaciji sa klomifenom. Primenjuje se terapija oralnim antidijabetikom Metformin-om koji deluje na redukciju hepati~ne glukoneogeneze stimuli{u}i enzim AMP-activated protein kinase. Podaci iz literature o rezultatima le~enja su jo{ uvek kontraverzni. Opse`na multicentri~na studija Legro-a iz 2007. godine, nije podr`ala hipotezu upotrebe insulin ,,senztizer-a, bilo samostalno, ili u kombinaciji sa klomifen citratom, niti dokazala pove}anje procenta uspeha u le~enju. Sli~ne rezultate objavio je i Moll u svojoj studiji, za razliku od studije objavljene od strane Palomba i saradnika. Ova grupa tvrdi da kod pacijenata koji primaju metfromin dolazi do pove}anja osetljivosti na insulin, uklju~uju}i efekte na BMI, proinsulin i insulin nivoe, kao i insulin rezistenciju, u pore|enju sa klomifen grupom. Me|utim, ovi efekti se ne odnose na pove}anje broja `ivoro|ene dece. Dosada{nja istra`ivanja su do sada potvrdila da je prva faza u le~enju infertiliteta kod `ena sa PCO sindromom, primena clomiphene citrate. Nije potvr|ena signifikantno zna~ajna prednost kombinovane terapije sa upotrebom metformina u odnosu na klomifen u smislu pove}anja broja `ivoro|ene dece. Hirzutizam se tretira upotrebom oralnih kontraceptiva spironolaktona i kozmeti~kim tretmanima. U rezistentnim slu~ajevima neophodna je laparoskopska hirurgija uz upotrebu YAG neodymium doped yttrium aluminium
126
garnet lasera, ili CO2 carbon dioxide lasera, radi redukovanja produkcije testosterona. @ene sa sindromom policisti~nih jajnika ispoljavaju mikrovaskularnu endotelijalnu disfunkciju koja se indicira inhibiranim vazodilatornim odzivom na Ach - acetil holin. Mikrovaskularna funkcija se procenjuje merenjem laser dopler ure|ajima mikrovaskularnog protoka eritrocita na ko`i podlaktice, kumulativnih jontoforetskih doza 1% W/V Ach - acetylcholine i 1% W/V natrijum nitroprusida SNP- sodium nitroprusside.
LPD - luteal phase dysfunction, ili luteal phase deficiency, ili luteal phase defect. Neadekvatna sekretorna transformacija endometrijuma, koja rezultuje iz nedovoljne proizvodnje progesterona je jedan od faktora neplodnosti i rekurentnog gubitka trudno}e. Deficijencija lutealne faze je dijagnozirana kod 3 - 20% pacijenata koji su neplodni i 5 - 60% pacijenata koji su do`iveli rekurentan gubitak trudno}e. Kod 6 - 10% `ena koje su fertilne postoji neadekvatna lutealna faza usled normalnih varijacija menstrualnog ciklusa. Slede}i patofiziolo{ki mehanizmi mogu izazvati neadekvatan odziv endometrijuma na hormonalnu stimulaciju tokom lutealne faze:
Abnormalna luteinizacija
Neadekvatno osloba|anje LH - luteinizing hormona mo`e izazvati smanjenje androstenediona teka }elija. Manji supstrat rezultuje smanjenjem estradiola i ni`im nivoima progesterona. Pored toga, suboptimalna
127
koncentracija LH - luteinizing hormona pri ovulaciji izaziva nedostatak progesterona zbog neadekvatne luteinizacije granuloznih }elija.
Materi~ne abnormalnosti
Materi~ne abnormalnosti izazivaju promene vaskularizacije endometrijuma uprkos normalnim nivoima progesterona. Miomi, septumi uterusa i endometritis su odgovorni za neadekvatne sekretorne promene u endometrijumu.
Hipoholesterinemija
Hipoholesterinemija organizma inicira steroidnu deficijenciju koja rezultuje niskom produkcijom progesterona i defekt lutealne faze.
Ultrazvu~no merenje endometrijalne debljine se nije pokazalo efikasnim u predvi|anju disfunkcije lutealne faze.
Biopsija endometrijuma
Nojs, Hertig i Rok su 1950. godine utvrdili da je dijagnoza deficijencije lutealne faze mogu}a histolo{kim pregledom endometrijuma. Vreme kada se radi biopsija mo`e u velikoj meri da uti~e na nalaze endometrijalne biopsije. Biopsija na sredini lutealne faze je najbolja za precizno dijagnostikovanje deficijencije lutealne faze. Biopsije iz fundusa uterusa daju bolje histolo{ke uzorke u pore|enju sa onima koji su uzeti iz ni`eg segmenta materice. Histolo{ki posmatrano, kod defekta lutealne faze razvoj endometrijuma zaostaje za 3 ili vi{e dana od normalno razvijenog endometrijuma. Hiperprolaktinemija i hipotiroidnost izazivaju deficijenciju lutealne faze kroz hipotalamusno-pituitarne disfunkcije.
Kod `ena bez hiperprolaktinemije i hipotiroidnosti se preporu~uje vaginalni progesteron kao dopuna endogene produkcije progesterona. Dopunski progesteron podi`e ni`e nivoe u lutealnoj fazi. Vaginalni supozitorijum ili gel su bolja opcija u odnosu na oralne i intramuskularne oblike zbog postizanja boljih koncentracija endometrijalnog progesterona. U terapiji se koriste klomifen citrat (klomifen citrat pobolj{ava folikularni razvoj i na taj na~in podi`e nivoe progesterona lutealne faze), gonadotropini i HCG - human chorionic gonadotropin. Defekt mo`e biti i na molekularnom nivou, pa je potrebno utvrditi specifi~ne markere. Istra`ivanje o molekularnim defektima je utvrdilo abnormalnosti endometrijuma `ena sa endometriozom, sindromom policisti~nih jajnika i hidrosalpinksom. Tejlor je pokazao oslabljenu HOXA10 homeo box region A ekspresiju gena kod ovih `ena. Endometrijalna receptivnost mo`e zavisiti od ekspresije gena koja mo`e biti regulisana estrogenom i progesteronom. Dok istra`iva~i ne re{e ova pitanja, primenjuje se gore opisana terapija.
128
`enama bez tiroidne auto-imunosti, nakon {to je klini~ka trudno}a uspostavljena ART -assisted reproductive technology procedurom.
Povezivanje prisustva anti-TPO-Abs thyroid peroxidase antibodies-a i poba~aja je hipoteti~ki obja{njeno ~injenicom da organsko specifi~ne autoimune bolesti mogu biti sekundarne nekim osnovnim }elijskim abnormalnostima koje direktno uti~u na ishod trudno}e. Alternativno, `ene sa tiroidnim autoimunitetom mogu pro}i kroz ve}e promene nivoa slobodnog tiroksina tokom ART - assisted reproductive technology-e, a kasnija trudno}a mo`e uticati na fiziologiju genitalnog trakta i razvoj fetusa. Utvr|ivanje prisustva tiroidnih antitela pre ART - assisted reproductive technology-e procedure je zbog toga korisno za identifikaciju `ena koje su izlo`ene riziku od kasnijeg klini~kog poba~aja. Prema tome, treba uraditi pregled TSH, slobodnog T4 i TPO-Ab - thyroid peroxidase antibodies-a kod svih infertilnih `ena. Kod `ena je hipotireoza naj~e{}e posledica autoimunog procesa. Ha{imotova bolest je stanje kada dolazi do postepenog o{te}enja tkiva koje proizvodi tiroidni hormon.
Simptomi su slede}i: povi{eni nivoi krvnog TSH i niski nivoi slobodnog T3/T4, opipljivo uve}ana tiroidna `lezda, pove}anje te`ine, slabost, netolerantnost prema hladnom vremenu, letargija, depresija, hiperholesterolemija, arterioskleroza, koronarna vaskularna bolest srca, suvo}a ko`e, gubitak kose, smetnje vida, neregularni i mu~ni menstrualni periodi, rekurentan gubitak trudno}e i neplodnost. Autoimune krvne promene su skoro uvek prisutne u obliku antitiroidnih antitela ATA, kao {to su antitiroglobulinska i antimikrozomalna antitela. Va`nost ATA antitiroidnih antitela, bez obzira na to da li se hipotiroidnost biohemijski ili klini~ki manifestuje, le`i u ~injenici da }e kod 50% `ena sa ATA - antitiroidnim antitelima da postoji imunolo{ki problem implantacije koji se manifestuje kao neplodnost, ili rekurentan gubitak trudno}e RPL - recurrent pregnancy loss. Veruje se da je ovo izazvano pove}anjem broja T - }elija ili aktivacijom prirodnih }elija ubica.
129
Upotreba nekih lekova, sredstava za smirenje, antihipersenzitiva za blokiranje ganglija, antidepresiva, tiazida i narkotika, mo`e da povisi nivo prolaktina u krvi. Umereno povi{eni nivoi prolaktina ~esto predstavljaju jedan od najranijih znakova predstoje}eg, ili postoje}eg hipotiroidnog stanja. Prema tome, povi{eni nivo prolaktina u krvi, bez obzira na stepen, zahteva ispitivanje. Na `alost, isuvi{e ~esto se te `ene empirijski tretiraju bromokriptinom radi sni`avanja prolaktina u krvi bez razmi{ljanja o {irim implikacijama. Pituitarni adenomi koji izazivaju pove}anje nivoa prolaktina u krvi se obi~no efikasno tretiraju produ`enom medikamentoznom terapijom, ~ak i tokom trudno}e. Ve}i makroadenomi mogu zahtevati transsfenoidalnu hirur{ku resekciju, ablaciju. Ostale intrakranijalne lezije koje izazivaju hiperprolaktinemiju se obi~no tretiraju hirur{ki. U situacijama hipotiroidnosti, hiperprolaktinemija obi~no ima dobar odziv na odgovaraju}u zamensku terapiju tiroidnim hormonom koja ima za cilj da odr`i serumske koncentracije TSH - thyroid stimulating hormona u normalnom opsegu.
slovima. Govori se o GAMDE -podeli, ~ime se misli na slede}e grupe: - Imunglobulin G ili IgG - Imunglobulin A ili IgA - Imunglobulin M ili IgM - Imunglobulin D ili IgD - Imunglobulin E ili IgE
Imunglobulin G
IgG se formira posle 3 nedelje od pojave antigena. Od svih antitela 75 procenata je imunglobulin G IgG.
Kod reinfekcije IgG antitela se stvaraju veoma brzo i u velikoj koli~ini, da bi spre~ila ponovno izbijanje bolesti.
130
Posebnost IgG je da oni u toku trudno}e mogu da prodru kroz placentu. Dete je tako za{ti}eno pre i posle ro|enja od infekcije. Ova za{tita traje samo oko tri meseca.
Imunglobulin A
Imunglobulin A IgA je specijalizovan za odbranu od antigena na povr{inama sluzoko`a npr. u nosu, grlu, crevu. Njegov udeo u celokupnoj koli~ini antitela iznosi otprilike 17 procenata.
ovog mehanizma je mogu}a specijalna laboratorijska dijagnostika: - Ako postoji sumnja na infekciju, koju je prouzrokovao odre|eni uzro~nik, onda pri elektroforezi mora da se doka`u IgM antitela; - Ako je infekcija prva, onda proizvodnja IgM raste brzo; - Ako je infekcija ponovljena, onda IgM koncentracija ostaje mala; - Ako je prevazi|ena akutna faza infekcije, koncentracija IgM antitela opet opada.
Uzro~nici bolesti i alergeni bivaju spre~eni i neutralizovani ve} sa IgA antitelima. IgA dospeva u mleko majke koja doji, koja tako svom dojen~etu mo`e da prenese odbrambene materije.
Imunglobulin D
IgD aktivira B-limfocite. Imunglobulin D IgD u serumu mo`e da se doka`e samo u veoma malim koli~inama. O njegovoj ta~noj funkciji mnogo toga nije poznato. Ima ulogu pri aktiviranju B-limfocita, jer se nalazi na povr{ini B-limfocita i sa njima kru`i u krvotoku.
Imunoglobulin M
IgM je brzistarterme|u imunoglobulinima. Kada neki strani uzro~nik bolesti dospe u organizam, telo kao prvo reaguje sa imunglobulinom M (IgM). Po{to je IgM tako brzo na raspolaganju, on se ozna~ava kao rano antitelo. IgM i IgG funkcioni{u zajedno. Proizvodnja IgM se smanjuje nekoliko nedelja od po~etka infekcije. Onda se radi za{tite organizma poja~ano formiraju IgG antitela, koja pru`aju za{titu. Upravo zbog
Imunglobulin E
Imunglobulin E IgE je jako specijalizovan i ima ulogu kod alergija. Poti~e iz limfnog tkiva, koje se nalazi u blizini disajnih puteva i digestivnog trakta. Odatle dospeva u krv. IgE mo`e da se doka`e u veoma malim koli~inama, samo 0,001 procenat svih imunoglobulina su IgE.
131
Uprkos tome ima va`nu ulogu kod preko 90 procenata svih alergijskih procesa. IgE je otkriven mnogo kasnije nego drugi imunglobulini. Ve} se ranije znalo, da telo reaguje odre|enom materijom na prisustvo alergena, naro~ito kod alergijskih reakcija. Ova materija je nazvana reagin. IgE dovodi do izbacivanja mediatora, koji izazivaju reakciju zapalenja. Nalazi se u ko`i i u sluzoko`ama, koje u~estvuju pri alergijskim reakcijama na alergene. Ako alergeni do|u u dodir sa IgM na ko`i i na sluzoko`ama dolazi do promena u funkciji razli~itih }elija {to dovodi do izbacivanja materija iz }elija - medijatora, koje izazivaju reakciju upale. Najpoznatiji mediator je histamin. Sperm IgA i sperm mar IgG se koriste kao testovi za detekciju ASA - anti spermatozoidnih antitela u spermi i serumu. ASA - antispermatozoidna antitela se produkuju kada je prekinuta krv - testis barijera, obstrukcijom, infekcijom ili traumom. Krv testis barijera izoluje u fiziolo{kim uslovima tkivo testisa od imunokompetentnih }elija. Imunglobulini IgG klase su obi~no prisutni i u serumu i u spermi. IgG antitela su vezana za spermatozoide. ASA - anti spermatozoidna antitela
IgA klase se sekretuju od strane akcesornih seksualnih `lezda i nalaze se samo u spermi. Mogu da budu detektovana u semenoj plazmi, ali tu obi~no nema slobodnog IgA. Antispermatozoidna antitela IgA gotovo nikad se ne javljaju bez IgG antitela. Ako vi{e od 40% mobilnih spermatozoida pokazuju prisustvo ASA - anti spermatozoidna antitela IgG klase, savetuje se kompetitivni test za IgA antitela. Imunolo{ki faktor smanjuje verovatno}u spontanog za~e}a, posebno ako su prisutna ASA- anti spermatozoidna antitela IgAklase. Prisustvo antitela kompromituje usmereno kretanje spermatozoida kroz `enski genitalni trakt, vezivanje spermatozoida za zonu pelucidu i interakciju spermatozoida i oocita onemogu}avaju}i oplodnju. Metoda izbora le~enja je ICSI - intra citoplasmatic sperm injection.
132
testa SCMPT - standardized determinations of the sperm-cervical mucus penetration testa omogu}ava se razgrani~enje patolo{kog faktora grli}a materice i faktora sperme. Poreme}ena interakcija sperma - sluz grli}a materice mo`e da se zasniva na prisustvu antitela spermatozoida u genitalnom sekretu. Radi dokazivanja lokalnih ASA anti spermatozoidnih antitela dolaze u obzir direktan MAR - mixed antiglobulin reaction test i IMB - immunobead test kao i indirektan test-indirektan MAR - mixed antiglobulin reaction test u cervikalnom sekretu. Uz pomo} markiranih ~estica indikatora mo`e da se postigne razgrani~avanje antitela IgG i IgA. Lokalna ASA - antispermatozoidna antitela se ~e{}e sre}u u ejakulatu i na povr{ini spermatozoida u oko 10%, nego u sluzi cerviksa < 2 %. Antitela sperme lgG i IgA pokazuju jasno pozitivnu korelaciju, ali i sama mogu da se na|u u razli~itom obimu. Ona nisu ni u kakvoj direktnoj vezi sa ASA - anti spermatozoidnim antitelima u serumu. Redak uzrok steriliteta predstavljaju lokalna IgA antitela sperme koja pokazuju izrazito negativan uticaj na stepen plodnosti. Posebno se razmatra delovanje imunog odgovora sa formiranjem antitela sperme kod genitalne infekcije kod mu{karca zbog ukr{tene reaktivnosti izme|u mikroorganizama i spermatozoida. Povezanost lokalnih ASA - anti spermatozoidnih antitela IgG i IgA u spermi sa mikrobnim naseljavanjem ejakulata kao i masa leukocita u spermi nije dosada mogla da se doka`e kod klini~ki asimptomatskih pacijenata. To va`i i za lokalna ASA - anti spermatozoidna antitela i druge parametre kod subklini~kih genitalnih infekcija.
Odre|ivanje cirkuli{u}ih antitela u serumu `ene ili mu{karca ASA - anti spermatozoidnih antitela ne daje klini~ki relevantnu informaciju o stanju plodnosti bra~nog para. Pozitivno dokazivanje cirkuli{u}ih ASA - anti spermatozoidna antitela pomo}u TAT - tray agglutination testa, RIA - radioimmunoassay ili ELISA enzyme linked immunosorbent assay, nije u korelaciji sa PCT - postkoitalnim testom, ili sa SCMPT standardized determinations of the spermcervical mucus penetration testom i procentom trudno}a. ASA - anti spermatozoidna antitela u serumu mu{karca ili `ene, koja su dokazana ovom metodom, ne pokazuju nikakav negativan uticaj na prognozu plodnosti. Ona ne opravdavaju primenu sistemske terapije kortikosteroidima. Odre|ivanje ASA - anti spermatozoidnih antitela u serumskim probama, naro~ito putem ~esto kori{}enog, komercijalno dostupnog ELISA - enzyme linked immunosorbent assay testa ne mo`e da se preporu~i u okviru dijagnostike plodnosti.
Alarmna reakcija
Alarmna reakcija je posledica poreme}aja unutra{nje ravnote`e, kojoj se organizam suprotstavlja aktiviranjem simpatikusa. Kao posledica dolazi do aktiviranja
133
kore nadbubre`ne `lezde sa poja~anim lu~enjem hormona adrenalina, noradrenalina, kao i hormona stresa kortizola i kortikosterona. To ubrzava frekvenciju rada srca, pove}ava vrednost {e}era u krvi, ubrzava disanje i pove}ava krvni pritisak. Postoji porast slobodnih masnih kiselina i koncentracije `eluda~ne kiseline. Posledice ovih promena su pobolj{ana prokrvljenost mi{i}a, bolja ventilacija plu}a, porast oksigenacije mozga, ali i su`enje krvnih sudova, usporavanje rada `eluca, creva i mokra}ne be{ike, manje lu~enje pljuva~ke i skupljanje krvnih sudova ko`e. Ako ovo stanje du`e potraje, to negativno uti~e na razmenu ugljenih hidrata i masnih materija i pove}anje nivoa {e}era u krvi i acidoza krvi. Sveukupno se pobolj{ava prokrvljenost srca, mozga i mi{i}a, pove}ava se transport kiseonika i nastupa promena u aktivnosti mo`danih talasa.
vanja je izgubljena, funkcije imunolo{kog sistema i polnih `lezda su optere}ene, apetit je poreme}en i reproduktivni organi i proces rasta, vi{e ne funkcioni{u normalno. Dugotrajne posledice su delom te{ka oboljenja kao: - hipertonija, - sr~ana oboljenja, oboljenja krvnih sudova i bubrega, - alergije i zapaljenske bolesti.
Faza otpora
Telo posle nekog vremena reaguje suprotnom reakcijom radi smanjenja potro{nje energije. U stanju stresa, koji traje du`e aktivira se parasimpatikus {to dovodi do skupljanja bronhija, pove}anog lu~enja pljuva~ke kao i pove}anje aktivnosti `eluca, creva i be{ike. Adrenalin, noradrenalin i kortizol ostaju visoki {to slabi funkciju {titaste `lezde. Za problem neplodnosti je interesantno da reproduktivni organi u ovoj fazi pokazuju smanjenje otpornosti prema zapaljenskim procesima.
Faza iscrpljenosti
Postaju vidljivi znaci jake iscrpljenosti. Zbog velikog lu~enja energetski relevantnih materija, dolazi do problema sa stvaranjem energije. Mogu}nost prilago|a-
134
Va`no je suo~avanje sa motivima `elje za decom. Tek u detaljnom razgovoru mogu da se sagledaju motivi. Tu spada motivacija: - da mo`e ne{to da voli - samoostvarenje preko deteta - `elja da se do`ivi trudno}a - da se manifestuje identitet kao `ene i majke - `ivot bez deteta nije mogu} - u~vr{}uje se ili se upotpunjava odnos sa partnerom - ne{to moje `ivi dalje - daje smisao `ivotu. @elja za decom mo`e da ima i egoisti~ne razloge. Psihi~ka optere}enja tokom terapije pove}avaju se sa vremenom ~ekanja. ^esto se psihi~ko optere}enje ne povezuje sa neophodnim pregledima i zahvatima. Optere}enje se pokazuje naro~ito kod neophodnog vremena ~ekanja izme|u pojedina~nih medicinskih postupaka. To mo`e da dovede do vi{estrukih konflikata u
partnerskom odnosu, koji mogu negativno da se odraze. Za mnoge parove je le~enje steriliteta psihi~ki veoma optere}uju}e. Zbog toga je razumno psihi~ko zbrinjavanje i savetovanje za vreme ovog perioda. Psiholo{ko stanje je mereno PGWB psychological general Well-Being indeksom kod pacijenata u programima asistirane reprodukcije radi ispitivanja uticaja psiholo{kog stresa na ishod IVF - in vitro fertilisation. Analizirane su psiholo{ke promene kod `ena koje su ostale trudne i `ena koje nisu bile trudne. U obzir su uzimani parametri ukupnog broja embriona, njihov kvalitet kao i broj transferisanih embriona. Nisu na|eni dokazi da psiholo{ki stres ima bilo kakav uticaj na ishod IVF - in vitro fertilisation tretmana. Prilikom savetovanja sa neplodnim parovima mogu}e je smanjiti stres koji do`ivljavaju tokom tretmana, informi{u}i ih, izme|u ostalog, i o ovim nalazima.
135
Pretestikularni uzroci
HYPOPITUITARIS MUS - PREPUBERTETSKI PO~ETAK - POSTPUBERTETSKI PO~ETAK VIAK ESTROGENA - TUMORI KOJI STVARAJU ESTROGEN (KORA NADBUBREGA) - CIRRHOSIS HEPATIS - EGZOGENI ESTROGEN VIAK GLUKOKORTIKODA - ENDOGENI (CUSHING) - EGZOGENI (LE~ENJE) ULCEROZNOG KOLITA, ASTME I SL) HYPOTHYROIDIS MUS DIABETES MELLITUS
Testikularni uzroci
MATURACIONI ZASTOJ HYPOSPERMATOGENESIS (PROPORCIONALNAHIPOPLAZIJA SVIH GERMINATIVNIH }ELIJA) ODSUSTVO GERMINATIVNIH ]ELIJA (SINDROM PRISUSTVA SAMO SERTOLIJEVIH }ELIJA) KLINEFELTER-OV SINDROM (SKLEROZIRAJU}A TUBULARNA DEGENERACIJA) ANOMALIJE SEKSUALNIH HROMOZOMA I POREME]AJI SEKSUALNE DIFERENCIJACIJE CRYPTORRHISMUS OTE]ENJE ZRA^ENJEM VIRUSNI ORHITISI
Posttestikularni uzroci
BLOK DUKTUSNOG SISTEMA KOJI VODI SPERMU OD TESTISA A. KONGENITALNI - ATRESIA VAS DEFERENSA I/ILI
EPIDIDIMISA
B.
136
gonadotropina. Kori{}enjem ove dve metode mo`e se odrediti osnovna promena koja je uzrok steriliteta. Zavisno od nivoa gonadotropina u urinu sterilitet se mo`e podeliti u tri kategorije: 1. Hipogonadotropni 2. Hipergonadotropni 3. Normogonadotropni. Ova biohemijska klasifikacija je, tako|e, va`na za razja{njenje mu{kog steriliteta. Kao primer pretestikularnog steriliteta navodi se hipopituitarizmus gde je sni`en nivo gonadotropina, a povi{en nivo cirkuli{u}eg estrogena (estrogen stvaraju}i tumori kore nadbubrega, ciroza jetre, egzogeni estrogen). Vi{ak estrogena dovodi do supresije stvaranja gonadotropina {to je pra}eno sekundarnom insuficijencijom testisa.
Hipopitu u itarismu us
Naj~e{}i uzrok pretestikularnog steriliteta je hipopituitarismus. Svejedno o kom se vidu pituitarne insuficijencije radi, uvek je prisutna testikularna insuficijencija. Ovi slu~ajevi se dele prema tome da li je hipopituitarizam nastao pre ili posle puberteta.
a) Prepubertalni hipopituitarismus
Ovi pacijenti imaju male, nezrele seminiferne tubule koji li~e na tubule prepubertalnih testisa. Tubuli su oblo`eni nediferentovanim germinativnim elementima i nezrelim Sertolijevim }elijama. Nema
znakova maturacije germinativnih }elija preko stadijuma spermatogonija, ili primarnih spermatocita. Tunika proprija je fina i tanka. Kao i u prepubertalnim testisima nema peritubularnih elasti~nih elemenata, jer se isti javljaju samo pod adekvatnom stimulacijom gonadotropinima u pubertetu. Leydigove }elije su nezrele i slabo razvijene. One li~e na nediferentovane mezenhimske }elije. Klini~ki gonadalna insuficijencija nastala zbog prepubertalnog hipopituitarizma mo`e biti izazvana organskim lezijama, u ili oko hipofize, ili zbog genetskog defekta u sekreciji gonadotropina. U organske lezije spadaju tumori, ciste, ili trauma u predelu sellae turcicae ili supraselarne regije. Ovi pacijenti su seksualno infantilni, ne pokazuju somatski rast i ispoljavaju razne stepene hipofunkcije tiroideje i nadbubrega. Nasuprot tome, pacijenti sa genetskim defektima u sekreciji gonadotropina su po pravilu visoki i evnuhoidni i ne pokazuju znake defekta somatotropina, tireotropina ili adrenokortikotropina. Zato se ovakav sindrom naziva hipogonadotropni evnuhoidizam. Karakteristi~no je da se u hipofizi ne dijagnostikuju organske promene. Sindrom je ~esto udru`en sa kongenitalnim anomalijama kao {to su anosmia, rascepljena usna, rascepljeno nepce i kraniofacijalna asimetrija. Postoje najmanje dve varijante hipogonadotropnog evnuhoidizma. Prva, klasi~na forma pokazuje deficit FSH - follicle stimulating hormone-a i LH - luteinizing hormone-a. Ovi pacijenti nikada nisu imali normalan pubertet. Oni su evnuhoidne gra|e sa dugim nogama, oskudnim dlakama na licu i telu, istanjenim, slabo razvijenim mi{i}ima, malim genitalijama i odsustvom ejakulacije. Histolo{ka slika testisa odgovara prepubertetskim testisima.
137
U drugom obliku hipogonadotropnog evnuhoidizma lu~enje FSH - follicle stimulating hormona je normalno, ali postoje deficiti razli~itog intenziteta lu~enja LH luteinizing hormona. Koli~ina LH luteinizing hormona nije dovoljna da odr`i produkciju normalnog nivoa androgena i da dovede do razvoja sekundarnih seksualnih karakteristika. Prisutni FSH - follicle stimulating hormon je dovoljan da izazove spermatogenezu razli~itog stepena tako da se u spermi mogu na}i spermatozoidi u razli~itom broju. Zbog toga se ovi pacijenti nazivaju fertilni evnuhoidi. Biopsije testisa pokazuju ve}i stepen razvoja seminifernih tubula, a Leydigove }elije su slabije razvijene.
b) Postpubertalni hipopituitarismus
Ako se hipopituitarizam javi posle puberteta, seminiferni tubuli, koji su
dostigli normalne dimenzije, ne regresiraju na prepubertetsko stanje. Oni pokazuju maturacioni arest, gubitak germinativnih }elija, redukciju dijametra tubula, progresivno zadebljanje i hijalinizaciju tunike proprije. Vremenom se tubuli transformi{u u hijalinisane kolagene trake. Specijalnim bojenjem se identifikuju elasti~na vlakna oko skleroti~nih tubula {to ukazuje da su tubuli imali prethodno normalan razvojni put i da su bili normalno stimulisani gonadotropinima. Leydigove }elije su uglavnom deformisane i neprimetne i ~esto sadr`e lipohrom i Reinkeove kristale. Klini~ki ove promene su ~esto posledica adenoma hipofize, naj~e{}e hromofobnog adenoma, a nekad i kraniofaringioma. Do istih promena mogu dovesti i acidofilni adenomi. Kao slede}i uzrok se navodi trauma ove regije.
138
Hormonska regulacija hipofizno-testikularne osovine koja zahvata interreakcije izme|u hipotalamusa, prednjeg re`nja hipofize, testisa i duktusa je prikazano na prethodnoj slici. Sekrecija GnRH - gonadotropin releasing hormon od strane hipotalamusa stimuli{e sintezu i osloba|anje FSH follicle stimulating hormona i LH luteinizing hormona od strane hipofize. FSH - follicle stimulating hormon deluje direktno na Sertolijeve }elije u tubulima testisa i pove}ava sintezu androgen vezuju}eg proteina. FSH - follicle stimulating hormon omogu}uje {irenje tubula. LH luteinizing hormon indukuje Leydigove }elije da sinteti{u testosteron koji difunduje u susedne tubule i pove}ava spermatogenezu. Testosteron deluje preko feedback mehanizma na hipotalamus i, mogu}e, na prednji re`anj hipofize i na taj na~in ograni~ava sekreciju LH - luteinizing hor-
mona. Inhibin koga stvaraju Sertolijeve }elije deluje na hipofizu ograni~avaju}i FSH - follicle stimulating hormona sekreciju i tako|e deluje na hipotalamus ograni~avaju}i sekreciju GnRH - gonadotropin releasing hormona i posledi~no FSH - follicle stimulating hormona. Intracelularni efekti testosterona su posredovani androgenim receptorima u androgen reaguju}im }elijama. Kompleks hormon-receptor se ve`e za promotornu regiju androgen stvaraju}eg gena stimuli{u}i transkripciju mRNK - messenger ribonucleic acid-a i sintezu proteina.
Vi{ak estrogena
Vi{ak estrogena suprimira sekreciju gonadotropina i dovodi do sekundarne insuficijencije testisa. Ima i mi{ljenja da estrogen mo`e imati i direktno dejstvo. Vi{ak estrogena se sre}e kod ciroze jetre,
139
tumora koji stvaraju estrogen, tumora kore nadbubrega. Tumori Sertolijevih }elija, ili tumori Leydigovih }elija mogu, tako|e, da stvaraju estrogen. Najzad, davanje estrogena kod pacijenata sa karcinomom prostate, dovodi do insuficijencije testisa. Ovo se, uglavnom, sre}e u postpubertalnom periodu i uslovljava defekt u maturaciji germinativnih }elija, pa se i germinativni epitel smanjuje, a seminiferni kanali zadebljavaju i hijalinizuju. Vremenom se razvije kompletna skleroza tubula. Leydigove }elije atrofiraju.
Hypothyroidismus
Ovi pacijenti imaju redukovan fertilitet. Na biopsiji testisa se konstatuje hipospermatogeneza. Kada se tiroksin izbalansira fertilitet se oporavlja.
Diabetes mellitus
Kod ovih pacijenata je smanjen fertilitet zbog arterioskleroze testikularnih arterija i njihovih grana, {to dovodi do hipospermatogeneze, zadebljanja tunike proprije i seminifernih tubula. Ovi pacijenti imaju i neuropatiju {to je pra}eno impotencijom.
Vi{ak androgena
Vi{ak androgena, sli~no vi{ku estrogena, suprimira sekreciju gonadotropina i dovodi do insuficijencije testisa. Endogeni vi{ak androgena mo`e biti udru`en sa raznim biohemijskim varijantama adronogenitalnog sindroma. Vi{ak endogenog androgena mo`e biti posledica androgen stvaraju}ih tumora kore nadbubrega i testisa. Nalaz u testisima zavisi od toga da li se tumor javio pre ili posle puberteta. Ako se razvio pre puberteta vide se virilizam i nezreli testisi. Ako je tumor nastao postpubertalno, testisi pokazuju progresivni gubitak germinativnih }elija i sklerozu tubula. Kada se tumor odstrani nema oporavka. Egzogeni androgeni se pona{aju kao endogeni.
Vi{ak glukokortikoida
Vi{ak glukokortikoida se javlja kod Cushingovog sindroma. Egzogeni glukokortikoidi se unose iz terapijskih razloga kod ulceroznog kolitisa, astme i reumatoidnog artritisa i rezultiraju oligospermijom, maturacionim zastojem i hipospermatogenezom. Nakon korekcije nivoa sledi oporavak.
140
Cisti~ni prostori fokalno sadr`e acelularni sekret i oblo`eni su spljo{tenim }elijama, ili niskim kubi~nim }elijama. Sekret je negativan na mucin i alcian plavo. Nekada su prisutni mikrokalcifikati. Lezija je naj~e{}e unilateralna, re|e bilateralna, a pacijenti pokazuju skrotalnu masu ili uve}anje testisa. Cisti~ni prostori mogu komprimirati testis tako da ovaj atrofira. Ova anomalija nastaje kao rezultat defektnog povezivanja ili nepovezivanja izme|u eferentnih duktusa i rete testisa i seminifernih kanala. Ova hipoteza je izvedena na embriolo{kim osnovama. Eferentni duktusi nastaju od mezonefri~kih duktusa, dok rete testis i seminiferni tubuli nastaju od gonadalnog blastema. Kod odraslih se opisuju ste~ene promene u rete testis kada je evidentna i opstrukcija. Opstrukcija epididimisa je naj~e{}i nalaz kod ovih pacijenata.
Hypospermatogenesis
To je proporcionalna hipoplazija svih germinativnih }elija. U ovom stanju svi }elijski tipovi, uklju~uju}i spermatogonije, spermatocite, spermatide i spermatozoide su prisutni u odgovaraju}im proporcijama, ali je broj smanjen. Kao posledica se vidi op{te istanjenje germinativnog epitela. Sertolijeve i Leydigove }elije su normalne. Dijametar tubula je u granicama normalnog. Klini~ki pacijenti su oligospermi~ni, sa normalnim urinarnim gonadotropinima i 17 ketosteroidima kao i normalnom koli~inom fruktoze u spermi.
141
142
Prisutna je azoospermija. Ako je defekt androgena nagla{en onda je nivo fruktoze nizak. Urinarni gonadotropini su povi{eni i zahvataju FSH - follicle stimulating hormon i LH - luteinizing hormon. ^esto je prisutna subnormalna inteligencija. Klasi~ni Klinefelterov sindrom pokazuje XXY hromozomski tip.
na povi{enu temperaturu razvijaju se normalno kao rezultat stimulacije gonadotropinom i nagla{enije. Nekada pokazuju nazna~enu vakuolizaciju citoplazme. Klini~ki pacijenti sa bilateralnim kriptorhizmom u postpubertalnom periodu imaju normalne urinarne 17 ketosteroide i LH - luteinizing hormon, {to ukazuje da je funkcija Leydigovih }elija normalna. Urinarni FSH - follicle stimulating hormon je povi{en, a spermatogeneza odsutna. U slu~ajevima neoperativnog tretmana i intraabdominalnog zadr`avanja testisa pove}ava se rizik maligne degeneracije. Smatra se da je relativni rizik 20 40 %.
Sl. 3.51- Klinefelter-ov sindrom Fokalna hiperplazija intersticijalnih }elija i hijalinizacija tubula
Cryptorrhismus
Kriptorhizam ima brojne uzroke. U nekim slu~ajevima testisi ne silaze u skrotum zbog anomalija ingvinalnog kanala. U drugim slu~ajevima nenapu{tanje ingvinalnog kanala je posledica insuficijentne stimulacije gonadotropinima. Nekada je posledica nasle|enih defekata. Anatomski kriptorhizam se deli na abdominalni i ingvinalni, gornji i donji, jednostrani i obostrani. Od donjeg ingvinalnog kriptorhizma treba razlikovati retraktilni testis. Histolo{ki kriptorhini testisi pokazuju male nezrele tubule sa razli~itim brojem spermatogonija zavisno od du`ine zadr`avanja u ingvinalnoj ili abdominalnoj poziciji. Nakon puberteta, germinativne }elije u kriptorhinim testisima postepeno i{~ezavaju sve dok kompletno ne i{~eznu, pa su tubuli oblo`eni jedino Sertolijevim }elijama. Leydigove }elije koje su rezistentnije
143
O{te}enje zra~enjem
Zra~enje testisa preko odre|enih doza dovodi do permanentne destrukcije germinativnih }elija. Nasuprot njima Leydigove }elije su relativno rezistentne. Histolo{ki germinativne }elije podle`u degeneraciji i dolazi do njihovog gubitka. Tubuli su oblo`eni Sertolijevim }elijama. Dijametar tubula se smanjuje, a tunika proprija progresivno zadebljava. Vremenom svi tubuli skleroziraju, ali su Leydigove }elije o~uvane. Klini~ki pacijenti su oligospermi~ni, a kasnije azoospermi~ni. Urinarni FSH - follicle stimulating hormon je pove}an zbog gubitka germinativnih }elija, ali po{to su Leydigove }elije intaktne, urinarni 17 ketosteroidi i LH - luteinizing hormon su u granicama normale.
ina nakon akutne infekcije. Zahvatanje testisa nije uniformno i varira od dela do dela testisa. Leydigove }elije su otpornije na o{te}enje i obi~no su o~uvane. Klini~ki opseg o{te}enja varira, a testisi postaju manji. Pacijenti su prvo oligospermi~ni, a kasnije azoospermi~ni. Urinarni FSH - follicle stimulating hormon je povi{en dok su 17 ketosteroidi i LH - luteinizing hormon normalni.
Mumps orchitis
Kada se mumps orchitis javi pre puberteta pacijenti se oporavljaju bez posledica. Me|utim, kada infekcija nastane posle puberteta kod jednog broja pacijenata se javljaju promene. U akutnoj fazi mumps orhitisa vidi se edem intersticijuma, mononuklearni i granulocitni infiltrat, degeneracija i lju{tenje germinativnih }elija. Nakon akutne inflamacije razvijaju se hroni~ne promene koje se ispoljavaju kao gubitak germinativnih }elija, hijalinizacija i skleroza seminifernih kanala. Po{to hroni~ne promene progrediraju to se kompletno razaranje zavr{ava za 10 do 20 god-
144
Sterilitet sa hipoandrogenizcijom
HIPOTALAMO-HIPOFIZNI UZROCI
- PANHIPOPITUITARISMUS - IZOLOVANI DEFICIT GINADOTROPINA - CUSHING SINDROM - HYPERPROLACTINEMIA - HEMOCHROMATOSIS
APLAZIJA GERMINATIVNIH }ELIJA CRYPTORRHISMUS VARICOCELA SINDROM NEPOKRETNIH CILIJA MYCOPLASMA INFEKCIJA ZRA~ENJE LEKOVI (CICKLOFOSFAMID) TOKSINI SPOLJNE SREDINE AUTOIMUNITET FEBRILNE BOLESTI
CELIJAKIJA
STE~ENI DEFEKTI
- VIRUSNI ORHITISI - TRAUMA - ZRA~ENJE - LEKOVI (SPIRONOLAKTON, ALKOHOL, KETOCONAZOL, CIKLOFOSFAMID) - TOKSINI IZ SPOLJNE SREDINE - AUTOIMUNITET - GRANULOMATOZNE BOLESTI - SISTEMSKE BOLESTI - BOLESTI JETRE - BUBRE`NA INSUFICIJENCIJA - ANEMIJA SRPASTIH }ELIJA - NEUROLOKE BOLESTI (MIOTONI~NA DISTROFIJA I PARAPLEGIJA) - REZISTENTNOST NA ANDROGENE
TRANSPORT SPERME OPSTRUKCIJA EPIDIDIMISA ILI VAS DEFERENSA (CISTI~NA FIBROZA, DEJSTVO DIETHYLSTILBESTROLA) KONGENITALNO ODSUSTVO.
145
cilju kontrole nataliteta. Ove opstrukcije nemaju {tetan efekat na germinativni epitel i Leydigove }elije, ako se nije razvio orchitis. O~uvanost germinativnog epitela je posledica ~injenice da epididimis u infekciji postaje pove}an i akomodira se na situaciju, a prispele germinativne }elije razara i fagocitira i resorbuje raspadne produkte. Klini~ki tubuli epididimisa su dilatirani proksimalno od opstrukcije. U seminifernim tubulima se vidi blaga dilatacija i hipospermatogeneza {to je posledica atrofije usled pritiska.
a) Kongenitalna opstrukcija
Kongenitalna opstrukcija je naj~e{}e posledica atrezije vas deferensa ili epididimisa. Kada je pojava obostrana onda je prisutna azoospermija i sterilitet. Nespajanje vas deferensa i epididimisa je drugi uzrok, ali je to retka pojava.
b) Ste~eni blok
Ste~ena opstrukcija je posledica infekcija ili hirur{kog podvezivanja. Naj~e{}a infekcija je gonorea. Opstrukcija se vidi u predelu repa epididima ili u proksimalnom delu vas deferensa. Po{to je ova infekcija obostrana onda, nastaju azoospermija i sterilitet. Drugi uzrok je tuberkuloza koja ~e{to zahvata epididimis. Ona nastaje {irenjem infekcije sa prostate, ili iz seminalnih vezikula i ejakulatornih duktusa. Nespecifi~ne gnojne infekcije koje su posledica {irenja gnojnog prostatitisa tako|e dovode do opstrukcije izvodnih kanala. Hirur{ka okluzija mo`e da se javi akcidentno, ili zbog `eljenog podvezivanja u
146
ovih pacijenata pokazuju poreme}en motilitet. Bez obzira na tip, opstrukcija nema {tetnog efekta na germinativni epitel, ili na Leydigove }elije. Ako do|e do ligiranja vaskulature onda nastaju promene u germinativnom epitelu. Opstrukcija se tretira hirur{kom korekcijom. Korekcija uro|enih opstrukcija je uglavnom bezuspe{na, dok je korekcija ligiranja, ili ste~enih opstrukcija uspe{nija.
Hlamidija ima visoku prevalencu. Klica mo`e da se doka`e u ejakulatu do 5% kod svih 15 -29 - godi{njaka.
147
Kako nisu dokazana negativna dejstva na procenat uspeha programa asistirane reprodukcije, nije obavezan screening na gonoreju ili na lues kod asimptomatskih mu{karaca. U po~etnoj fazi dolazi do prostatitisa, sa mogu}no{}u preno{enja upale na glandulu veziculozu. Na kraju mo`e da do|e do epididimitisa sa trajnom neplodno{}u.
majki. Ukoliko ve} nije inficirana visoko kontamiranim virusom, partnerka mo`e pouzdano da bude za{ti}ena aktivnom imunizacijom. Kada titar dostigne nivo od 10 ml U/ml, ona je za{ti}ena i mo`e da bude podvrgnuta postupku IVF - in vitro fertilisation.
HCV Hepatitis C
Efikasna HCV- hepatitis C vakcina ne}e biti na raspolaganju u bliskoj budu}nosti zbog izra`enih mutacija pojedina~nih genotipova i subtipova. U slu~ajevima prisustva virusa u ejakulatu u koncentraciji od 50 do 200 ekvivalenta genoma po ml je te{ko sa sigurno{}u dokazivanje virusa tehnikama amplifikacije genoma, pa je stopa detekcije virusa u spermi viremi~nih mu{karaca u literaturi opisana u procentima od 5 do 57%. Virus mo`e da se doka`e jedino u semenoj plazmi i u okruglim }elijama, ali ne na spermatozoidima, ili u njima. Va`no je naglasiti da virusi mogu pouzdano da se izdvoje i neutrali{e mogu}nost preno{enja, sekvencijalnom pripremom sperme pomo}u gradijentne separacije centrifugiranjem i swim-up metodom. U programu ART assisted reproductive technology redukuje se ionako niska stopa horizontalne transmisije, koja u dugogodi{njim monogamnim partnerskim vezama iznosi samo oko 2,5% . Preno{enje infekcije sa mu{karca je malo verovatno, ali ne mo`e u potpunosti da se isklju~i. Kod serolo{kog dokazivanja anti HCV - hepatitis C kod mu{kog partnera negativan rezultat nije siguran dokaz, jer u dana{nje vreme nije prona|en nijedan visoko senzitivni sistem dokazivanja za HCV - hepatitis C na spermatozoidima. Alternativno bi trebalo da se provere hepatolo{ke terapijske opcije za eliminaciju
Virusi
Za vreme akutne virusne infekcije organizma i u ejakulatu mo`e da se doka`e prisustvo virusa. Za reproduktivnu medicinu relevantni su, pre svega, uzro~nici hroni~nih infekcija. Tu se ubrajaju posebno HBV hepatitis B virus, HCV- hepatitis C, HIV human imunodeficijentni virus, HPV - humanes papilloma virus i CMV-citomegalo virus.
Hepatitis B - HBV
Kao {to je napred navedeno screening hepatitisa B se sprovodi odre|ivanjem Hbs-Ag. Virus se nalazi u slobodnom obliku u semenoj plazmi. Integrisani HBVhepatitis B genom mo`e da se doka`e u leukocitima i spermatozoidima. Ova integracija se obja{njava obrnutom transkriptaznom aktivno{}u virusne DNK - deoksiribonukleinske kiseline polimeraze. Hipoteza o vertikalnoj transmisiji putem germinalne linije tra`i nova istra`ivanja. Integrisani HBV - hepatitis B u leukocitima se zna~ajno elimini{e u postupku pripreme sperme, ali penetracijom zara`enih spermatozoida mo`e da do|e do infekcije fetusa. U literaturi nema izve{taja o slu~aju paterno-fetalnih infekcija u postupku asistirane reprodukcije, ali su opisani slu~ajevi konatalnih infekcija dece iz spontanih trudno}a kod Hbs-Ag negativnih
148
Do danas, posle vi{e od desetogodi{nje primene ove metode, nisu zabele`ene infekcije majke ili deteta.
Prisustvo odgovaraju}ih sekvenci je dokazano u spermatozoidima inficiranih mu{karaca, {to dozvoljava mogu}nost pojavljivanja paterno-fetalne infekcije embriona. U literaturi nema dokaza za to, kao i opisa mogu}ih klini~kih slika. Rutinsko dokazivanje HSV - herpes simplex virus i CMV - citomegalo virus u fazi pripreme je diskutabilno, jer protiv navedenih uzro~nika nisu na raspolaganju ni etablirane terapije eliminacije, a ni prevencija vakcinacijom, tako da pozitivan nalaz screeninga ostaje bez terapijske konsekvence. U homolognom sistemu se u ovom trenutku stoga ne preporu~uje generalni screening infekcije na HPV - humani papilloma virus, HSV - herpes simplex virus i CMV - citomegalo virus.
149
Postupci asistirane reprodukcije skrivaju potencijalni rizik, da se pacijentkinji, ili ro|enom detetu, ali i osoblju koje radi u laboratoriji, prenesu neki od navedenih virusa. Da bi se ovi rizici spre~ili, moraju da budu poznati potencijalni putevi infekcije i da se izrade standardi za prevenciju od infekcije. Preporuke u uputstvima za rad i
njihova kontrola, ali posebno savetovanje bra~nih parova o individualnim konstelacijama rizika, su u odgovornosti ordiniraju}ih lekara koji se bave reprodukcijom. Kao osnova za ovo treba da slu`e postoje}e preporuke, koje reflektuju aktuelno infektolo{ko stanje znanja u reproduktivnoj medicini.
150
3. DIJAGNOSTIKA STERILITETA
Postavljanje dijagnoze je prvi korak u le~enju steriliteta. Ukoliko se dijagnostika ne uradi kompletno, kompromituju se svi naredni postupci u le~enju. Ispitivanje bra~nog para je kao {to je ve} re~eno nedeljiva celina, zna~i istovremeno se rade osnovni pregledi oba partnera. Histerosalpingosonografska dijagnoza jajovodi prohodni, ta~na je u oko 85% slu~ajeva - jajovodi obturirani, ta~na u oko 50% slu~ajeva, sa ve}om precizno{}u kod terminalnih obturacija u odnosu na proksimalne. Podaci o ostalim nalazima u maloj karlici, na primer prisustvo adhezija, endometrioze, peritonealnih promena, nije bilo mogu}e ta~no dijagnostikovati.
151
procenu sekcionih ravni koje se u zavisnosti od odre|enog polja interesa, pregledaju na jedan od nekoliko razli~itih modaliteta posmatranja u cilju maksimizovanja dostupnih informacija i pobolj{anja utiska prostora. Trodimenzionalna sonografija na jedinstven na~in dozvoljava prikaz koronalne ravni normalne na lice transdjusera olak{avaju}i prepoznavanje povr{inskih neregularnosti koje se mogu uzeti u obzir tokom merenja volumena. Digitalna tehnologija omogu}ava trodimenzionalno snimljenim slikama kori{}enje u telemedicini, jer dozvoljava memorisanje velikih nizova podataka, bez gubitka informacija, koji se kasnije mogu analizirati off-line i proceniti od strane stru~njaka u virtuelnom konsultovanju u realnom vremenu. Dvodimenzionalna kolor dopler sonografija pru`a subjektivnu procenu uterine i ovarijalne vaskularnosti. Ona je ograni~ena pru`anjem opisa u jednoj ravni naspram uzorka volumena koji se dobija trodimenzionalnim prikazom. Trodimenzionalna sonografija pru`a slede}e prednosti u pore|enju sa dvodimenzionalnom: - Precizno merenje dimenzija organa i volumena, - Pobolj{ane informacije o anatomiji i protoku krvi, - Pobolj{ana procena slo`enih anatomskih anomalija, - Bolja specifi~nost u pogledu potvrde normalnosti, - Standardizacija procedure sonografskog pregleda, - Smanjeno vreme pregleda efikasnom upotrebom opreme i vremena, - Telemedicinske i tercijarne konsultacije.
152
VI - vaskularizacioni indeks, odra`ava odnos informacija sa doplera unutar ukupnih podataka u odnosu na kolor i sive informacije, FI - flow index, indeks protoka koji predstavlja srednju vrednost intenziteta doplerovog signala, i VFI - vascularisation flow index, indeks vaskularizacionog protoka koji predstavlja kombinaciju prethodna dva. Ta~na veza ovih indeksa sa stvarnim protokom i vaskularno{}u in vivo tek treba da se utvrdi, ali se pokazalo da su promenljivi, kako unutar pojedina~nih tako i me|u razli~itim subjektima, {to govori da mogu imati veoma va`nu ulogu u identifikovanju i kategorizaciji razlika me|u grupama pacijenata. Veoma je va`no da se indeksi mogu izra~unati na na~in koji se mo`e reprodukovati nakon pribavljanja trodimenzionalnih podataka sa doplera {to se pokazalo pouzdanim.
Ispitivanje steriliteta
Trodimenzionalni ultrazvuk se koristi za dijagnostikovanje materi~nih anomalija, procenu tubarne prolaznosti i isklju~enje intrauterine i ovarijalne patologije.
Anomalije uterusa
Kongenitalne anomalije uterusa se dovode u vezu sa povi{enim rizikom od ponovljenog poba~aja u prvom i tre}em tromese~ju i preranim poro|ajem. Metaanaliza objavljenih retrospektivnih podata-
ka upore|enja ishoda trudno}a pre i posle histeroskopske septoplastike je pokazala primetno pobolja{nje nakon operacije. Precizna i pouzdana dijagnoza je va`na, jer dozvoljava identifikaciju pacijenata izlo`enih riziku od ovih komplikacija i pravovremenu hirur{ku intervenciju. Nesumnjivo je da je ovo podru~je na kome je trodimenzionalna sonografija najvi{e doprinela i postala prva linija ispitivanja u centrima u kojima je na raspolaganju. Ovo odra`ava njenu sposobnost da istovremeno prika`e endometrijalnu {upljinu i miometrijum u koronalnoj ravni. Po postoje}im statisti~kim podacima do 24% `ena sa ponovljenim gubitkom trudno}e mo`e imati materi~ne anomalije, {to je pet puta ve}i broj u odnosu na kontrolnu grupu. U pogledu tipa anomalije naj~e{}a je uterus arcuatus, zatim sledi subseptalna i bikornualna materica sa slo`enijim anomalijama kao {to je uterus didelphys, dok je unikornualna materica najre|a. @ene sa subseptalnom matericom imaju zna~ajno ve}i udeo poba~aja u prvom tromese~ju, a `ene sa uterus arcuatis-om zna~ajno ve}i udeo poba~aja u drugom tromese~ju i u prevremenom poro|aju u pore|enju sa `enama koje imaju normalnu matericu. U ura|enim studijama se pokazalo da je ishod povezan sa stepenom defekta i du`inom {upljine, koja je zna~ajno manja kod uterus arcuatis-a i subseptalne materice `ena sa ponovljenim poba~ajem. Upotrebljene tehnike merenja i klasifikacije dozvoljavaju pore|enje me|u studijama u skladu sa upotrebljenim stepenom standardizacije, na osnovu merenja distorzije fundusa od sredi{ne ta~ke imaginarne horizontalne linije koja spaja gornje aspekte kornuata sa gornjim aspektom materi~ne {upljine. Trodimenzionalna sonografija nudi
153
pouzdan i standardizovan metod dijagnostikovanja, razlikovanja i kvantifikovanja materi~nih anomalija. Trodimenzionalna sonografija je zna~ajno doprinela na{em razumevanju materi~nih anomalija kvalifikuju}i njihov uticaj na reproduktivni ishod.
U nekim drugim studijama, kao kod Sankpal-a objavljeni su manje obe}avaju}i rezultati iste tehnike pri proceni tubarne prolaznosti.
Policisti~ni jajnici
Nekoliko grupa je koristilo trodimenzionalnu sonografiju da prika`e ovarijalni volumen i vaskularnost koji su pove}ani kod sindroma policisti~nih jajnika. Trodimenzionalna sonografija, tako|e, dozvoljava merenje stromalnog volumena putem izra~unavanja i oduzimanja ukupnog folikularnog volumena od ovarijalnog volumena. Koriste}i ovu tehniku, KyeiMensah je pokazao da je stromalni volumen u pozitivnoj korelaciji sa koncentracijama serumskog androstenediona kod `ena sa klini~kim dokazima policisti~nih jajnika. Me|utim, koriste}i sli~an pristup, Nardo nije mogao da utvrdi vezu izme|u serumskog FSH - follicle stimulating hormona, LH - luteinizing hormona, ili testosterona i ovarijalnog stromalnog volumena kod neplodnih `ena sa PCOS - polycystic ovarian syndrome rezistentnim na klomifen-citrat u istoj fazi menstrualnog ciklusa.
Intrauterina patologija
La Tore je uporedio trodimenzionalnu sonografiju sa konvencionalnim na~inima vizuelizacije sa i bez kontrasta. Standardna dvodimenzionalna sonografija je pokazala relativno lo{u specifi~nost od samo 69,5 % ta~nosti. Pobolj{ano je na 94,1% kada je dvodimenzionalna sonografija kori{}ena u kombinaciji sa salinskom infuzijom. Trodimenzionalna sonografija se pokazala skoro jednako dobro i dijagnostikovala je prisustvo polipa sa ta~no{}u od 88,8% i kasnije je ta~no identifikovala kompletnu intrauterinu patologiju kada je kori{}ena u kombinaciji sa salinskom infuzijom.
Prolaznost tuba
Kombinacija kontrastnih medijuma i trodimenzionalne sonografije je tako|e kori{}ena za procenu tubalne prohodnosti. Trodimenzionalna salinska sonohisterosalpingografija na osnovu dosada{njih studija prikazuje ~itavu konturu uterinske {upljine kod 96% slu~ajeva, u pore|enju sa samo 64% pomo}u konvencionalne rentgenske histerosalpingografije, pa je ona dovedena u vezu sa pozitivnom prediktivnom vredno{}u i specifi~no{}u predvi|anja tubarne prolaznosti od 100% kod nasumi~no odabranih neplodnih pacijenata. Potvr|eno je da trodimenzionalno prikazivanje slike doplerom pokazuje slobodnu te~nost skoro dvostruko ~e{}e od konvencionalnog na~ina kada se koristi tokom histerosalpingosonografije.
154
endometrijalnu vaskularnost je pokazala da su uspe{ni ciklusi za~e}a povezani sa zna~ajno ve}im endometrijalnim indeksom protoka. Subendometrijalni vaskularizacioni indeks protoka VFI - vascularisation flow index se pokazao kao najbolji prediktor za~e}a, jer je superiorniji od vaskularizacionog indeksa VI - vascularisation index, indeksa protoka FI - flow index i endometrijanog volumena u analizi krive radnih karakteristika primaoca. Trodimenzionalna sonografija se mo`e koristiti za pregled endometrijalne vaskularnosti i odre|ivanje endometrijalne receptivnosti pre stimulacije jajnika. Postoji dovoljno dokaza koji podupiru mi{ljenje da su teorijske prednosti trodimenzionalne sonografije prevedene u klini~ku praksu na polju reproduktivne medicine. Prostorna orijentacija i dodatne informacije koje se mogu dobiti iz pojedina~nih sekcionih ravni su veoma pobolj{ale na{e znanje o anomalijama uterus-a i doprinele razumevanju uticaja ovih anomalija na ishod trudno}e. Kvantitativna trodimenzionalna analiza volumena i vaskularnosti se pokazala manje preciznom u klini~koj praksi. Uloga trodimenzionalne sonografije se jo{ uvek istra`uje u oblastima normalne fiziologije i kod patofiziolo{kih promena.
3.1.2. Histerosalpingografija
HSG - histerosalpingogram je rentgenska procedura koja se obavlja radi utvr|ivanja da li su Falopijeve tube prolazne i da se vidi da li je oblik {upljine materice normalan, sa ta~no{}u nalaza prohodnosti tuba u oko 90% slu~ajeva. Ono
155
{to je nedostupno ovoj metodi su ostali podaci o stanju u maloj karlici, prisustvo adhezija ili endometrioze. U preoperativnoj pripremi za operativnu korekciju anomalija uterusa histerosalpingografija je neophodna radi procene operativne tehnike i pristupa.
Krvarenje se obi~no javlja u prvom ili drugom danu nakon HSG histerosalpingograma kao posledica traume u toku intervencije.
HSG - histerosalpingogram se smatra veoma bezbednom procedurom. Komplikacije se javljaju u manje od 1% slu~ajeva. Naj~e{}i ozbiljan problem sa HSG - histerosalpingogramom je pelvi~na infekcija. Ovo se obi~no de{ava u prisustvu prethodne tubarne bolesti. U retkim slu~ajevima infekcija mo`e o{tetiti Falopijeve tube. Izlaganje zra~enju je veoma nisko, manje nego kod pregleda bubrega, ili stomaka i nije bilo negativnih efekata od ovog zra~enja, ~ak i ako do|e do za~e}a tokom istog meseca. HSG histerosalpingogram ne treba obaviti ako se sumnja na trudno}u. Retki su slu~ajevi kada pacijent mo`e imati alergijsku reakciju na jodni kontrast koji se koristi kod HSG - histerosalpingograma. Pacijenti koji su alergi~ni na jod mogu da urade sonohisterogram po{to ta procedura koristi te~nosti koje ne sadr`e jod. Sonohiste rogrami daju dobre podatke o {upljini uterusa, a ograni~ene o Falopijevim tubama.
3.1.3. Laparoskopija
Laparoskopija je najpreciznija dijagnosti~ka metoda u oblasti steriliteta. Uzimaju}i u obzir izuzetno male rizike i komplikacije, ova metoda se primenjuje u ve}ini centara koji se posebno bave problemima steriliteta. Dana{nji stav je da se pacijent ne mo`e smatrati potpuno ispitanim i pripremljenim za po~etak terapije bez laparoskopske dijagnostike.
156
Preventiva povreda
Pribli`no polovina svih komplikacija laparoskopske metode se javljaju tokom aplikacije instrumenata, pa je va`na primena bezbedne tehnike. U ve}ini slu~aja se koristi pneumoperitoneum pre ubacivanja primarnog troakara. Druga mogu}nost je otvoreni laparoskopski pristup, ili Hason-ova tehnika. Ne postoje ubedljivi dokazi da je jedan pristup bolji od drugog. Preventivne mere koje se primenjuju radi izbegavanja mogu}ih povreda su slede}e:
Pozicija pacijenta: operacioni sto treba da bude ravan, bez naginjanja glave sve dok se troakar ne uvede u abdominalnu {upljinu. Ako je pacijent suvi{e rano stavljen u Trendelerburgov polo`aj, mo`e do}i do nepravilnog polo`aja lumbalnog dela ki~me sto dovodi velike krvne sudove bli`e umbilikusu ~ime se pove}ava rizik od povrede Veresovom kanilom, ili troakarom. Veresova kanila i troakar treba da budu uvedeni pod uglom od 45 u odnosu na sakrum, ali ne previ{e vertikalno. Na ovaj na~in se izbegava povreda u srednjoj liniji velikih krvnih sudova, aorte i vene kave. Veresova kanila i troakar moraju da budu uvedeni du` sredi{ne linije: ne sme se dozvoliti da igla ode u stranu, jer to sa sobom nosi opasnost povrede ilija~nih sudova. Kod gojaznih pacijenata treba koristiti dovoljno duga~ku Veresovu kanilu ili troakar. Ako je neophodno, instrumenti treba da budu uvedeni kroz umbilikus, umesto tradicionalnim subumbilikalnim putem. Prilikom ubacivanja Veresove kanile proveriti da ne izlazi krv, {to bi zna~ilo da je u nekom krvnom sudu. Pre spajanja Veres kanile sa sistemom za ugljen dioksid potrebno je izbaciti iz cevi sav atmosferski vazduh. Zapremina
vazduha u cevi mo`e biti preko 100 ml. Ovo je neophodno iz dva razloga. Prvo, embolija ugljen dioksidom je manje opasna od embolije vazduhom i drugo, kako je vazduh manje resorptibilan od ugljen dioksida, du`e }e ostati u peritonealnoj {upljini sa ve}om iritacijom dijafragme i postoperativnim bolom u ramenu. Pritisak insuflacije treba da bude manji od 15 mm Hg, izmedju 10 do 12 mm Hg. Nizak pritisak insuflacije manje naru{ava vensku cirkulaciju smanjuju}i rizik venske tromboze, jer je pritisak u ilija~noj veni <10 mm Hg. Ako je igla perforirala u ilija~nu venu, onemogu}ava se gasna embolija. Postoji nekoliko metoda za proveru pravilne aplikacije Veresove kanile u peritonealnu {upljinu, kao test aspiracije. Danas retko koristimo ove testove, pa se umesto njih oslanjamo na pra}enje pritiska i protoka. Kada je pritisak insuflacije pode{en na 10 do 12 mm Hg, a protok gasa na ve}u brzinu, ako je Veresova kanila pravilno postavljena, protok treba pribli`no da iznosi 2 L/min, a pritisak insuflacije 8 do 10 mm Hg. Ako je protok manji od 1 L/min, Veresova kanila je mo`da pogre{no postavljena. Kada se uvede laparoskop uradi se pa`ljiv pregled abdomena, uklju~uju}i i gornju abdominalnu {upljinu. Kada je potvr|eno da se laparoskop nalazi u peritonealnoj {upljini pacijent se tek onda polo`i glavom nani`e da bi se olak{ao pregled pelvi~nih organa. Uvo|enje sekundarnih troakara je pod vizuelnom kontrolom. Lokalizacija povr{inskih epigastri~nih krvnih sudova treba da bude proverena transiluminacijom abdominalnog zida pomo}u svetla koje dolazi sa vrha laparoskopa. Lokalizacija inferiornih epigastri~nih sudova se identifikuje vizuelnim pregledom.
157
Komplikacije laparoskopije
Dok operativna laparoskopija postaje sve {ire prihva}ena, razvijaju se nove tehnike i sve ve}i broj hirurga usvaja ovaj tip terapije, pa se mo`e o~ekivati da }e broj komplikacija po~eti da raste. Frekventnost pojavljivanja komplikacija je 1,1% do 5,2% kod manjih procedura i 2,5% do 6% kod velikih. Sve vi{e je o~igledno da, u cilju smanjivanja broja komplikacija, programi obuke moraju uklju~ivati nadgledanje na svim nivoima razvoja i mora postojati vi{i stepen svesti o potencijalnim rizicima laparoskopske hirurgije. Komplikacije u toku laparoskopije se mogu dovesti u vezu sa: 1. Anestezijom, 2. Indukcijom pneumoperitoneuma, 3. Uvo|enjem primarnih i sekundarnih troakara, 4. Termalnim instrumentima, 5. Mehani~kim instrumentima, 6. Drugim okolnostima.
ima slobodu da naredi hirurgu da pacijenta vrati u po~etni polo`aj, evakui{e pneumoperitoneum i prekine operaciju. Vazovagalni refleks mo`e da izazove {ok i kolaps, naro~ito ako anestezija nije dovoljno duboka. I ovo se mo`e spre~iti efikasnom anestezijom i isklju~enjem ostalih uzroka {oka.
Komplikacije anestezije
Komplikacije koje se mogu direktno pripisati op{tem anestetiku se ne razlikuju od onih koje se mogu pojaviti kada se obavlja bilo koji drugi tip operacije. Neke osobine laparoskopske hirurgije imaju predispozicije prema specifi~nim anestetskim komplikacijama. Upotreba Trendelenburgove pozicije i distenzija abdomena mogu smanjiti ekskurziju dijafragme. Ugljen-dioksid se mo`e apsorbovati naro~ito tokom produ`enih operacija. Nadgledanje oksimetrijom pulsa, upotreba endotrahealne intubacije i asistirana ventilacija pozitivnim pritiskom smanjuju rizik od hiperkarbije na minimum. Ako do|e do aritmije, anesteziolog }e biti odgovoran za njenu kontrolu i on
158
^vor se vezuje na povr{ini ispod ko`e, jer ostavlja manji o`iljak i manje je bolno u postoperativnom toku. Kada primarna ligatura nije efikasna neophodno je pro{iriti ranu da bi se locirala arterija koja krvari. 2. Povreda intra-abdominalnih krvnih sudova Povrede manjih krvnih sudova se mogu sanirati bipolarnom elektro-koagulacijom. O{te}enje velikih krvnih sudova naneto troakarom je te`e od povreda Veresovom kanilom zbog veli~ine vrha i mo`e rezultovati obilnim krvarenjem. Povreda krvnih sudova omentuma mo`e ugroziti vitalnost dela creva. Kod ovog tipa povreda neophodna je laparotomija sa hemostazom krvnog suda i revizijom creva od strane hirurga. Ako se sumnja na povredu aorte, vene cave inferior, ili iliake, instrument kojim je u~injena povreda treba ostaviti da bi se ozna~ilo mesto povrede. Obi~no postoji veliki hematom koji skriva mesto same povrede. Dramati~an kolaps nastaje penetracijom velikog krvnog suda, ali krvarenje ne mora biti odmah o~igledno, ako se radi o retroperitonealnom krvnom sudu. Nakon obavljene hemostaze neophodna je temeljna inspekcija kompletne trbu{ne duplje sa pomeranjem creva radi pregleda aorte oko bifurkacije gde su naj~e{}e povrede. Propu{tanje obavljanja ove procedure mo`e rezultovati nastavljanjem krvarenja i formiranjem velikog hematoma koji i nekoliko ~asova kasnije mo`e da dovode do hemoragi~nog {oka. Prema tome, prilikom zavr{etka bilo koje laparoskopske procedure moraju se proveriti veliki krvni sudovi i potra`iti hematomi. Ovo se naro~ito odnosi na operativni tretman endometrioze na bo~nom karli~nom zidu gde su locirani veliki krvni sudovi.
Medijastinalni emfizem
Medijastinalni emfizem mo`e izazvati sr~ane smetnje koje }e dijagnostikovati anesteziolog. Laparoskopija se mora prekinuti i poku{ati da se evakui{e {to ve}a koli~ina gasa. Pacijent mora biti pod intenzivnom kontrolom sve dok se gas ne apsorbuje.
Pneumotoraks
Pneumotoraks nastaje ubacivanjem Veresove kanile u pleuralnu {upljinu. Zato je va`no da se kod visoke aplikacije kanila usmeri {to dalje od dijafragme. Na pneumotoraks treba posumnjati uvek kada se jave te{ko}e kod ventilacije pacijenta. Intervencija se prekida i poku{ava da se elimini{e {to vi{e gasa. Kod te`ih slu~ajeva je potrebna asistirana ventilacija i ubacivanje pleuralne tube.
Pneumo-omentum
Omentum se perforira Veresovom kanilom u oko 2% slu~ajeva. Pogre{na aplikacija se prepoznaje povi{enjem insuflacionog pritiska. Stanje je obi~no bezopasno, osim ako do|e do perforacije krvnog suda.
159
Gasna embolija
Intravaskularna insuflacija gasa mo`e dovesti do gasne embolije, pa ~ak i smrti. Ovo se mo`e desiti samo ako se penetracija Veresovom kanilom ne prepozna i zapo~ne insuflacija. Ovo se mo`e spre~iti aspiracionim testom i rutinskim kori{}enjem niskoga pritiska insuflacije gasa. Gasna embolija je mogu}a, ali se retko de{ava, jer je gas lako rastvorljiv i brzo se resorbuje tako da se, ~ak i ako je postojao umeren embolus, cirkulatorne promene vra}aju u normalu u roku od nekoliko minuta, a pacijent se oporavlja. Kod masivne embolije pacijenta treba okrenuti u levu lateralnu poziciju i ukoliko ne do|e do trenutnog oporavka, uraditi punkciju srca radi oslobadjanja gasa.
Azotni oksid poma`e sagorevanje i postavlja se pitanje rizika pri kori{}enju visoko-frekventne monopolarne struje.
160
Povreda be{ike
Rutinsko pra`njenje be{ike pre intervencije trebalo bi da spre~i povredjivanje be{ike. Ako je prime}ena pneumaturija, iglu treba delimi~no povu}i, a stvaranje pneumoperitoneuma nastaviti. Peritoneum be{ike treba pa`ljivo pregledati da bi se proverilo da nije izazvana ozbiljnija povreda. Tretman jednostavne perforacije je konzervativan uz postoperativnu drena`u be{ike. Posekotine be{ike mogu nastati tokom mobilizacije be{ike kod karli~nih operacija. Be{ika bi trebala da bude za{ivena u dva sloja uz aplikaciju Folijevog katetera.
manjeg deseroziranja do vidljive perforacije. Perforacija zahteva laparotomiju, uklanjanje o{te}enog tkiva i hirur{ku korekciju. U slu~aju neprepoznavanja povrede nastaje ishemi~na nekroza na mestu opekotine. U samom po~etku simptomi nisu izra`eni. Pacijent se obi~no `ali kako se ne ose}a dobro i ima nejasne abdominalne simptome, neprijatnost, anoreksiju i mogu}u pireksiju. Peritonitis se polako razvija tokom nekoliko narednih dana. Uvek se mora imati na umu da je elektri~na struja potencijalno opasna i da se sva pravila koja se ti~u njene upotrebe moraju strogo po{tovati.
Termalna o{te}enja
Monopolarna elektri~na struja ulazi u telo pacijenta iz elektrode koja se koristi u toku intervencije. Na povratnoj putanji ka neutralnoj elektrodi struja mo`e da pro|e preko male povr{ine gde se dodiruju dva organa. Gustina energije u toj ta~ci mo`e biti velika. Na ovaj na~in dolazi do opekotina izvan vidnog polja hirurga. Postoji i opasnost od lateralnog {irenja toplote kod primene monopolarne ili bipolarne struje. Va`no je osigurati da nijedan drugi organ nije u dodiru ili u blizini organa koji se tretira. Creva su organ koji se naj~e{}e povre|uje. Povreda se mo`e kretati od
Perforacija materice
Perforacija materice mo`e biti izazvana manipulacijom kanile ili tokom dilatacije i kireta`e. Perforaciju uvek treba pregledati laparoskopom na kraju procedure. Krvarenje je obi~no neznatno i komplikacija obi~no ne zahteva dalji tretman.
Bol u ramenu
Ugljen-dioksid se pretvara u ugljenu kiselinu kada je u kontaktu sa telesnim te~nostima. Ovo iritira peritoneum. Peritonealna iritacija dijafragme izaziva bol koji se prenosi na rame freni~nim nervom. Ovaj bol se mo`e zameniti sr~anim bolom i tretirati na neodgovaraju}i na~in.
161
Pelvi~na inflamacija
Postoji mali rizik od stvaranja pelvi~ne infekcije uterinskom kanilom i hromopertubacijom. Postoperativna pelvi~na infekcija je manje ~esta nakon laparoskopske hirurgije nego nakon laparotomije.
skladu sa slo`eno{}u laparoskopske procedure o kojoj se radi. Sredstva dijagnoze i tretmana komplikacija su analizirana zajedno sa zna~ajem stepena iskustva hirurga. Stepen mortaliteta je bio 3,33 na 100 000 laparoskopija. Ukupni stepen komplikacija je bio 4,64 na 1000 laparoskopija. Stepen komplikacija koje su zahtevale laparotomiju je bio 3,20 na 1000. Stepen komplikacija je bio u zna~ajnoj korelaciji sa slo`eno{}u laparoskopske procedure. Jedna od tri komplikacije (34,1%) se desila tokom pripreme za laparoskopiju, a jedna od ~etiri (28,6%) nije dijagnostifikovana tokom operacije. Dok su se pojavljivale nove indikacije za laparoskopsku hirurgiju u ginekologiji, postojalo je paralelno i statisti~ki zna~ajno pove}anje stepena urolo{kih komplikacija. Pove}ano iskustvo hirurga je imalo tri posledice: statisti~ki zna~ajan pad broja povreda creva, pad broja komplikacija koje zahtevaju laparotomiju onih laparoskopskih hirur{kih procedura koje su dobro definisane i promenu na~ina na koji su komplikacije tretirane uz zna~ajno smanjenje udela incidenata tretiranih laparoskopijom.
Strana tela
Ponekada se delovi instrumenata mogu nenamerno ispustiti i izgubiti u peritonealnoj {upljini. Uklanjaju se laparaskopski, ako se pronadju ili laparatomijom.
3.1.4. Histeroskopija
Histeroskopija se ne primenjuje rutinski u fazi dijagnostike steriliteta. U slucajevima sumnje na odredjene patoloske promene u kavumu uterusa u prethodnim nalazima, pristupa se histeroskopiji. Naj~e{}a patologija koju sre}emo u ovoj oblasti, a koja se dijagnostikuje i terapeutski re{ava histeroskopijom su polipi uterusa, malformacije uterusa, manji intrakavitarni miomi, sinehije, stenoze cerviksa uterusa. U skorije vreme se i neki slu~ajevi tubarnih
Analiza komplikacije
U sedam francuskih centara je obavljena studija o laparoskopskoj ginekolo{koj dijagnosti~koj i operativnoj hirurgiji. Studija obuhvata period od devet godina tokom kojih je obavljeno 29 966 dijagnosti~kih i operativnih laparoskopskih operacija. Rizik od komplikacija je procenjen u
162
Studije koje direktno upore|uju rezultate sonohisterosalpingografije sa rezultatima dobijenim putem HSG - histerosalpingograma su dale neusagla{ene rezultate.
3.1.5. Sonohisterosalpingografija
Za sonohisterografiju se smatra da ima ve}u osetljivost od HSG - histerosalpingograma u detekciji intrauterinske patologije Sonohisterosalpingografija se bazira na detekciji akumulacije fluida u cul-de-sac kao indikacije tubarne prohodnosti. Ova metoda ne daje precizne podatke o tubarnoj anatomiji i ne mo`e da utvrdi da li je samo jedna ili su obe tube prohodne. Novi sonografski kontrastni medijum, koji se sastoji od surfaktanta koji stvara mikro-mehuri}e kada se stimuli{e ultrazvukom je pobolj{ao osetljivost ove metode. Tehnolo{ki napredak ultrasonografije je pro{irio mogu}nosti sonohisterosalpingografije. Trodimenzionalni transvaginalni ultrazvuk je pobolj{ao generisanje koronalnih slika, a doplerova tehnika vizualizaciju kretanja fluida kroz Falopijeve tube. Me|utim, ~ak i sa ovim pobolj{anjima je malo verovatno da }e uskoro sonohisterosalpingografija zameniti tradicionalni HSG histerosalpingogram.
> =2.0 ml >= 7.2 ml >=20 miliona spermatozoida/ml > = 40 miliona spermatozoida /ml
>=50% pokretnih (stepen a+b) ili Prokrvljenost >=25% pokretnih (stepen a), 60 minuta od ejakulacije Morgologija >=15% Vitalnost Bela krvna zrnca Mar test >=75% isklju~uju}i boju <1 milion }elija/ml
<50% pokretnih spermatozoida sa zadr`anim mehuri}ima Immunobead <50% pokretnih spermatozoida sa test adherentnim ~esticama
163
Sve ve}i broj klini~kih studija se bavio utvrdjivanjem grani~nih vrednosti radi klasifikacije subfertilnih i fertilnih pacijenata. Predlo`ene grani~ne vrednosti za subfertilne pacijente su prikazane u narednoj tabeli.
Tabela 3-8: Grani~ne vrednosti kod subplodnih mu{karaca
Ombelet 1997 Koncentracija 14.3 x sperme 106/ml Pokretljivost stepen a Morfologija strogi kriterijum 28% 5%
Guzick Gunalp 2001 2001 13.5 x 6 106/ml 9x10 /ml 32% 14%
9%
5%
Procenjivanje uzoraka sperme treba da bude standardizovano od trenutka prikupljanja do kona~nog brojanja normalnih spermatozoida u fiksiranom uzorku. Kontinuirana kontrola kvaliteta ove analize je od
najve}eg zna~aja. Razne dr`ave su utvrdile objektivan sistem kontrole kvaliteta. Ovi sistemi su ~esto pod direktnom kontrolom ministarstva zdravlja. Prikupljanje sperme je prva faza u radu. Uzorak se uzima u laboratoriji u posebnu sterilnu posudu nakon perioda apstinencije od 2-3 dana. Kao alternativa, uzorak mo`e biti donet u laboratoriju u roku od jednog ~asa od ejakulacije odr`avan na telesnoj temperaturi tokom transporta. Lubrikacija se ne koristi prilikom pribavljanja uzorka po{to mo`e biti toksi~na po spermatozoide. Kada se uzorak pribavlja u toku odnosa obezbe|uje se poseban kondom dizajniran za ovu svrhu. Dve analize se obavljaju u razmaku od nekoliko nedelja, jer se broj spermatozoida mo`e menjati. Makroskopska procena je druga faza. Tokom inicijalnog makroskopskog ispitivanja uzorka, volumen, boja, pH, viskoznost i koncentracija se bele`e kao {to je prikazano u slede}oj tabeli.
Dug period apstinencije >> 2ml Siva opalescentna Normalna jasna `elatinazna tela Boja @uta Crvenkasto-braon Viskoznost posle likvifikacije Visoka > =7.2 pH < 7.2 Dug period apstinencije Uzimanje B vitamina Eritrociti - Smetnje u prokrvljenosti spermatozoida - Nedostatak homogenosti uzorka Normalna - Azoospermija - Opstrukcija ejakulatornih vodova - Bilateralno kongenitalno odsustvo vas deferens
164
Mikroskopska procena je tre}a faza pregleda sperme. Prva mikroskopska procena uzorka uklju~uje procenjivanje pokretljivosti i aglutinacije spermatozoida i prisustva }elijskih elemenata, eritrocita i belih krvnih zrnca i epitelnih }elija. Pojava bakterija, tako|e, mora biti evidentirana. Koncentracija spermatozoida se odre|uje hemocitometrom ili specijalnim tipovima komora za brojanje, kao {to je Maklerova komora. Uzorci u kojima nisu detektovani spermatozoidi se centrifugiraju radi utvr|ivanja spermatozoida u talogu. Preporu~uje se centrifugiranje > 3000g u trajanju od 15 minuta. Ako se spermatozoidi ne na|u u talogu, uzorak se kvalifikuje kao azoospermi~an. Razli~ite klasifikacije uzorka sperme prema broju, prokrvljenosti i morfologiji su prikazane u slede}oj tabeli.
Tabela 3-10: Podela terminologije prema Svetskoj zdravstvenoj organizaciji WHO
Procena morfologije sperme je ~etvrta faza pregleda. Prave se dva razmaza od sve`eg uzorka za dvostruku procenu. Razmaz obojen po Papanikolau je najrasprostranjeniji metod kori{}en u androlo{kim laboratorijama, jer pru`a dobru obojenost spermatozoida i drugih }elija. Posti`e se obojenost akrozomalnih i postakrozomnih regija glave spermatozoida, citoplazmi~nih kapljica kao i srednjeg dela i repa spermatozoida. Treba pregledati i proceniti 2 X 200 spermatozoida po svakom uzorku. Glava, vrat, srednji deo i rep se pa`ljivo procenjuju.
Pokretljivost Astenozoospermija manja od referentne vrednosti Normalne forme Teratozoospermija manje od referentne vrednosti* Azoospermija Spermatozoidi nisu prisutni
Normalni spermatozoid ima ovalnu glavu du`ine 4 - 5.5 m i {irine 2.5 - 3.5 m. Odnos du`ine i {irine treba da bude 1.5 1.75. Srednji deo bi trebao biti {irok, manji od 1 m, oko 1.5 puta du`i od glave i aksijalno spojen. Citoplazmi~ne kapljice su upola manje od normalne glave.
165
< Sl. 3.62- Centrozoma spermatozoida, snimljeno TEM transmission electron micrograph-ijom
Sl. 3.63- Mitohondrija spermatozoida, snimljena TEM - transmission electron micrograph-ijom >
Rep treba da bude prav, uniforman, tanji od prednjeg dela i duga~ak pribli`no 45m. Svi grani~ni oblici se smatraju abnormalnim.
U tabeli su prikazane sumirane morfolo{ke karakteristike koje se ispituju kod tipi~ne analize sperme.
Defekti glave
- Velika, mala, zailjena, piriformno-okrugla - Amorfne glave - Vakuolirane glave (>20% glave zauzimaju nezamrljana vakuolarna podru~ja) - Malo akrozomalno podru~je (<40% glave) - Veliko akrozomalno podru~je (>70% glave) - Dvostruke glave - Bilo koja kombinacija ovih defekata - Savijen vrat: vrat i rep formiraju ugao ve}i od 90% u odnosu na dugu osu glave - Asimetri~no umetanje srednjeg dela u glavu - Debeo ili nepravilan srednji deo - Abnormalno tanak srednji deo - Bilo koja kombinacija ovih defekata - Kratak - Viestruki repovi - Ukosnica - Neravni repovi - Savijeni repovi (>90) - Repovi nepravilne irine, uvijeni repovi - Bilo koja kombinacija ovih defekata Ve}e od 1/3 prostora normalne glave spermatozoida; kapljice se obi~no nalaze na boku srednjeg dela
Defekti repa
Citoplazmi~ne kapljice
166
Povremeno se de{ava da brojni spermatozoidi imaju specifi~ne strukturalne defekte, kao {to je poreme}aj razvoja akrozoma koji uzrokuje defekt nazvan globozoospermija. Neuspeh spajanja bazalne plo~e sa nukleusom, na polu koji je naspram akrozoma, uzrokuje odvajanje glave i repova. Glave bivaju apsorbovane, pa se u spermi mogu na}i samo repovi, {to ovim strukturama daje defekt. Ovaj defekt je nazvan pinhead (glava ~iode) i ne spada u defekte glave, jer vrlo retko poseduje hromatin ili neke druge strukture glave. Transmisiona elektronska analiza sa preporu~uje u slu~ajevima kada postoji totalna astenozoospermija. Ovaj dodatni korak se preduzima radi definisanja porekla nepokretljivosti, kao {to mo`e biti sindrom nepokretnih cilia. Procena pokretljivost je peta faza pregleda sperme. Preporu~uje se jednostavan sistem procene pokretljivosti. Slo`eni sistemi bazirani na ra~unaru koji koriste softver za analizu slike CASA - computer aded sperm analysis nisu neophodni. Procenjuje se pet mikroskopskih polja radi analize oko 200 spermatozoida. Hiperaktivni spermatozoidi nisu uklju~eni u standardni protokol, prikazan u slede}oj tabeli, ali oni daju kvalitativne informacije. Ovi spermatozoidi imaju veoma brzu progresivnu pokretjlivost > 50mm/s.
Tabela 3-11: Gradacija pokretljivosti prema standardima WHO
>=25mm/s; STEPEN Brzo 1 okvir plo~ice ili progresivan 5 du`ina glave A spermatozoida Sporo STEPEN 5-24mm/s progresivan B STEPEN Neprogresivan 5mm/s C STEPEN Nepokretan _ D
Biohemijske analize i odredjivanje biohemijskih markera funkcije spermatozoida su dodatne analize. Pojava biohemijskih testova mu{kog faktora neplodnosti omogu}ava standardizovana ispitivanja sa koeficijentom varijacije karakteristi~nim za klini~ku hemiju, za razliku od sistema biolo{kih testova koji mogu biti veoma promenljivi. Biohemijski parametri se mogu koristiti u klini~koj praksi za procenu oplodne sposobnosti spermatozoida. Tu spadaju testovi akrozina, anilin plavog, odre|ivanje nivoa ROS- reactive oxygen species. Testovi procene funkcije mu{ke polne `lezde su odredjivanje koncentracije fruktoze (13 mmol ili vi{e), alfa-glukozidaze (20mU ili vi{e) i specifi~ni markeri prostate kao {to je PSA- prostate cancer screening. Identifikacija mu{karaca sa hroni~nom inflamacijom genitalnog trakta testira se odredjivanjem granulocitne elastaze, C3 komplementne komponente, ceruloplazmina, IgA - immunoglobulina, IgG - immunoglobulina, ROS - reactive oxygen species. Treba pomenuti jo{ neke testove koji se sre}u u praksi kao na primer: odre|ivanje koncentracije karnitina (0,8 - 2.9 mmol), cinka (2,4 mmola ili vise), citric acida (52 mmola ili vi{e), kisele fosfataze (200 U ili vi{e). Dalja dodatna ispitivanja su: SPA sperm penetration assay / hamster egg penetration test, HOS - hypoosmotic swelling test, vezivanje spermatozoida sa zonu pellucidu, imunolo{ki testovi: imunobead test (manje od 20 % spermatozoida sa adherentnim partikulama), MAR - test (manje od 10 % spermatozoida sa adherentnim partikulama), Penetrak test - cervical mucus test, PCT - postkoitalni test, SCSA - sperm chromatin structural assay koji podrazumeva analizu fragmentacije DNK - deoksiribonukleinske kiseline spermatozoida kao pokazatelja redukovanog fertilizacionog kapaciteta.
167
bazi molekularnih markera mo}i da bude definisan dodatno precizan individualni profil gena sa prognosti~kom i predikativnom relevantno{}u kao po~etak personalizovane medicine. Ove nove tehnologije ce na}i svakako i svoje mesto u oblasti steriliteta i posebno u domenima asistirane reprodukcije.
168
4. TERAPIJA STERILITETA
Zahtevi koji se postavljaju pred lekare koji se bave humanom reprodukcijom u odnosu na komunikaciju sa pacijentima mogu u potpunosti da se svrstaju u slede}e oblasti: korektne informacije o procesu i kompetentno obave{tenje, organizaciono besprekorno sprovo|enje dijagnostike i terapije u skladu sa aktuelno va`e}im reproduktivno medicinskim standardom i psihosocijalna pomo} u procesu savladavanja psihosocijalnih kriza. Infertilni parovi nemaju nerealne i neostvarive zahteve prema lekarima koji se bave reprodukcijom. Velika potreba za informacijama mo`e da se zadovolji kroz procesuirano otklanjanje nejasno}a i organizaciju kontinuirane informisanosti na svim nivoima rada. Naravno da se o~ekuje visoka reproduktivno medicinska kompetentnost, ali oni kojih se to ti~e, ne mogu da je procenjuju. Oni od lekara koji se bave reprodukcijom o~ekuju komplementarnu i uravnote`enu individualnu psihosocijalnu pomo} u procesu savladavanja krize zbog svojih problema sa sterilitetom. Stoga je za lekare koji se bave reprodukcijom apsolutno potrebna kompetentnost u psihosocijalnom savetovanju i intervencijama kod kriza i kod formulisanja indikacija za specifi~ne intervencije.
169
reprodukcije zbog slabijih rezultata i ve}e traume za pacijenta. Posebno poglavlje u operativi danas zauzima prevencija adhezija nastalih pri hirur{kim intervencijama, kada lokalizovani nedostatak kiseonika operativnog polja, hipoksija, izaziva fibrinolizu sa skupljanjem fibrina na traumatizovanoj povr{ini. Zna~aj priraslica je izuzetan kod ginekolo{kih operacija i to u otvorenoj, ali i u endoskopskoj tehnici. U sada{nje vreme prevencija adhezija se sprovodi aplikacijom takozvanih proizvoda za blokadu. Na raspolaganju su lokalno deluju}e viskozne supstance, zatim proizvodi od polietilenglikolne i hijaluronske kiseline i preparati regenerisane oksidirane celuloze. Dobre rezultate zbog svoje raspodele i delovanja u celokupnom peritonealnom prostoru pokazuje i icodexsin.
Mikro-endoskopski postupak spada u novije metode operativnog le~enja. Spektar endoskopski izvodljivih operacija se poslednjih godina kontinuirano pro{irivao i u me|uvremenu obuhvata i kompleksne zahvate. Razvoj fiber-endoskopa sa pre~nicima ispod jednog milimetra otvara i pristup do unutra{njosti tuba, koje uprkos svom klini~kom zna~aju dosada uop{te nisu bile pristupa~ne za endoskopski pregled i terapiju. Danas su na raspolaganju fleksibilni mikro endoskopi sa rezolucijom od 3000 piksela i sa pre~nikom od 0,5 mm. Primenom fiber opti~ke tehnologije u budu}nosti }e mo}i da se uspe{no pro{ire dijagnosti~ke i terapeutske mogu}nosti pregleda i le~enja unutra{njosti jajovoda.
170
Druga oblast gde se prioritet daje hirurgiji u odnosu na asistiranu reproduktivnu tehnologiju je laparoskopska ovarijalna dijatermija kod policisti~nih jajnika. Danas je ova hirur{ka metoda prihva}ena kao efikasan tretman ovog stanja. Optimalna tehnika podrazumeva ~etiri mesta vaporizacije na svakom jajniku, u trajanju od po 5 sekundi primenom energije od 30W.
mima kroz ve}i broj radova dolazi se do zaklju~ka da nema potpunog konsenzusa o tome koji tipovi intramuralnih fibroida treba da se uklone. Mnogi autori razmatraju uklanjanje, ako je fibroid ve}i od 5 cm, dok drugi kompletiraju operativnu indikaciju postojanjem neplodnosti. Na osnovu sprovedenih meta-analiza ~ini se jasnim da prisustvo intramuralnih fibroida, ~ak i manjih od 5 cm, uzrokuje smanjenje stepena klini~ke trudno}e kao i zna~ajan porast broja poba~aja nakon IVF in vitro fertilisation tretmana u pore|enju sa `enama bez mioma. Istovremeno nema ubedljivih podataka koji bi pokazali da njihovo uklanjanje u ovoj grupi `ena zna~ajno pobolj{ava stepen za~e}a i smanjuje stepen poba~aja.
Tabela 3-12: Meta-analiza uticaja intramuralnih mioma na broj trudno}a nakon IVF tretmana
Studija Eldar-Geva (1998) Hart (2001)* Ng i Ho (2002) ^ek (2002)** Ukupno** TE 55 85 77 61 279
Intramuralni miom BT/TE 9/55 (16%) 20/86 (23%) 20/77 (26%) 26/61 (43%) 75/279 (27%) TE 318 322 312 61 1013
Kontrola BT/TE 98/318 (30%) 110/322 (34%) 74/312 (24%) 32/61 (52%) 314/1013 (31%)
Tabela 3-13: Meta-analiza uticaja intramuralnih mioma na broj poba~aja nakon IVF tretmana
Fibroid 3/9 (33%) 7/20 (35%) 4/20 (20%) 10/24 (43%) 24/73 (33%)
Kontrola 20/98 (20%) 19/110 (17%) 6/74 (8%) 7/31 (23%) 52/313 (17%)
171
Jasna indikacija za operativni tretman je od posebnog zna~aja kod mikrohirur{kih rekonstruktivnih zahvata na tubama. Uspeh salpingostomije direktno zavisi od stepena o{te}enja jajovoda. Kod slu~ajeva sa bla`im oblikom bolesti, stepen postoperativnih trudno}a je do 39%. Prognosti~ki dobre promene za salpingostomiju uklju~uju: - minimalni hidrosalpinks, - minimalne peritubarne adhezije, - normalnu mukozu, - normalan ili tanak zid tube, - parcijalnu okluziju. Hirurzi koji ne selektiraju pa`ljivo i stru~no slu~ajeve za operacije ostvaruju lo{ije rezultate i ~esto kompromituju dobre operativne metode.
Ako se uzme kao primer formular za saglasnost za oreraciju mioma, on bi trebao da sadr`i i slede}e podatke o mogu}im komplikacijama: - transfuzija (oko 20%); - histerektomija (oko 2%); - intrauterinske adhezije; - ruptura uterusnog o`iljka tokom kasnije trudno}e (do 1%); - recidiv mioma (oko 27% u prvih 10 godina). Za hirurgiju postoje tri zlatna pravila i ona glase: bezbednost, bezbednost i bezbednost. Bezbednost pacijenta mora da bude najva`nija stvar kod svih tipova operacija.
172
tranija. Pod uslovom da se po{tuju pravila bezbednosti, elektri~na energija je efikasnija i manje skupa od ostalih oblika energije; - Tipovi elektri~ne energije: monopolarna ili bipolarna. Kada je potrebna hemostaza, a operativno polje je blizu creva, bipolarna dijatermija je bezbednija od monopolarne, jer je manji rizik slu~ajne opekotine; - Monopolarna elektri~na energija se koristi za: se~enje, koagulaciju ili njihovu kombinaciju. Prilikom se~enja avaskularnog tkiva, ako se `eli izbe}i koagulaciona povreda ise~enih ivica (npr. dva kraja Falopijeve tube), mo`e se koristiti ~isto se~enje elektri~nom energijom. Prilikom se~enja tkiva koje sadr`i male krvne sudove, koristi se kombinovani na~in, jer omogu}ava istovremeno se~enje i koagulaciju tkiva. Iako se koagulacioni na~in, tako|e, mo`e koristiti za se~enje tkiva, obi~no se ne preporu~uje; - Pode{avanje snage i gustina snage: izbor pode{avanja snage veoma zavisi od veli~ine i oblika vrha instrumenta. Ako instrument sa ravnim ili zaobljenim vrhom sa velikom kontaktnom povr{inom koristimo za odre|eni nivo snage, koristi se manja gustina snage. S druge strane, kada imamo o{tri instrument, ista snaga }e proizvesti mnogo ve}u gustinu snage. Zato je neophodno smanjiti snagu kada se koristi o{tri instrument da bi se izbegle nepotrebne opekotine okolnog tkiva zbog stvaranja {irokog elektri~nog luka; - Da li vrh instrumenta treba da bude u dodiru sa tkivom. Kada se koristi monopolarni elektricitet, ako je vrh instrumenta u dodiru sa tkivom do}i }e do efekta su{enja, pa je ovo naro~ito pogodno za dijatermiju dubljih lezija i hemostazu. Me|utim, ako vrh instrumenta nije u direktnom dodiru sa
tkivom, do}i }e do stvaranja varnica. Struja mo`e da pre|e sa elektrode na tkivo preko provodnog medijuma tj. vazduha. Ovaj prustup je pogodan za povr{insko uklanjanje endometrioznih naslaga ili za se~enje tkiva vaporizacijom. Va`no je da se bezkontaktni metod ne koristi kada je operativno polje blizu creva ili uretre; - Brzina pomeranja }e odrediti kona~an uticaj na tkivo. Prilikom kori{}enja o{trog kompleta za dijatermiju, brzi pokreti }e rezultovati efektom povr{inskog se~enja dok }e spori pokreti dozvoliti dublju penetraciju sa izvesnim stepenom koagulacije; - Moraju se izbe}i nenamerne opekotine koje se mogu javiti kao posledica probijanja izolacije, kapacitivne sprege i direktne sprege. [to se ti~e direktne sprege, ako aktivna elektroda dodiruje drugi metalni instrument, elektricitet se mo`e preusmeriti u drugi deo tela {to bi rezultovalo nenamernim opekotinama. Zbog toga je va`no ne dozvoliti aktivnom elementu da dodirne bilo koju drugu metalnu strukturu. U ovom pogledu je instrument sa kratkim aktivnim elementom bezbedniji od onog sa dugim aktivnim elementom. Kapacitivna sprega se javlja kao posledica elektromagnetnog fenomena da kada struja te~e kroz cevastu strukturu stvara elektromagnetno polje i sekundarnu struju koja mo`e da podstakne elektri~no pra`njenje. Ako se naelektrisanje stalno prazni kroz abdominalni zid nije opasno. Me|utim, ako je instrument izolovan do}i }e do kumulacije naelektrisanja do zna~ajnog nivoa, pa pri dodiru intra-abdominalnog organa, na primer creva, mo`e do}i do stvaranja opekotine. Da bi se izbegla kapacitivna sprega potrebno je izbegavati upotrebu hibridnog sistema kanila; drugim re~ima, plasti~ni izolator metalne unutra{njosti.
173
Reproduktivna hirurgija, kao i ostale grane medicine i hirurgije, je pod stalnim i drasti~nim promenama. Napredak op{te tehnologije sa razvojem sve bolje aparature pru`a hirurgu mogu}nost preciznijeg rada, ve}u atraumati~nost i skra}enje vremena operacije. To zahteva kontinuiranu edukaciju kao i uostalom u ukupnoj medicinskoj nauci.
- tople slane kupke i kupke sa ugljenhidroksidom, - kupke za noge, - postepene kupke, kod kojih se temperatura polako pove}ava, - naizmeni~ne kupke sa naizmeni~no toplim i hladnim fazama, - hladne kupke i polivanja ili ulazak u vodu po Kneipp-principu, - ango ili pakovanja sa morskim muljem, - toplo obavijanje tela, - termofori
Masa`e
Mogu}nost da se otkloni napetost postoji u primeni klasi~ne masa`e mi{i}a, masa`e vezivnog tkiva i masa`e refleksnih zona.
IV DEO
ASISTIRANA REPRODUKTIVNA TEHNOLOGIJA
177
1. IN VITRO FERTILIZACIJA
U dana{nje vreme kada se posmatra sveukupna medicinska tehnologija usmerena na pojedinca, na ubla`enje bolesti i pobolj{anje kvaliteta `ivota, ni{ta ne mo`e da se ravna sa doprinosom tehnologije asistirane reprodukcije. Ne postoji `ivotno iskustvo koje bi moglo da se ravna sa ro|enjem bebe u pogledu zna~aja i va`nosti. Odgovornost odgajanja i vaspitanja dece ima dugoro~ni i bitan uticaj na pojedince, porodicu i dru{tvo. Tako se asistirana reprodukcija ne mo`e uzimati kao jo{ samo jedan oblik invazivne medicinske tehnologije, ve} se mora tretirati sa po{tovanjem i odgovorno{}u prema najosnovnijim delovima ljudskog `ivota. biolog Robert Edwards prvi uspeli da epohalnom realizacijom oplodnje van tela `ene postignu ro|enje prve bebe. Oni su omogu}ili da primenom njihove metode, milioni `ena rode koje nisu mogle spontano da ostanu gravidne. Njihova saradnja i rad su trajali deset godina i najve}im delom se odvijali u Bolnici u Oldhamu.
Prva beba u svetu za~eta vantelesnim putem je Louise Joy (sre}a) Brown, ro|ena u 23,47 sati, 25. jula 1978. godine putem carskog reza koji je uradio Patrick Steptoe. [est meseci kasnije ro|ena je druga beba, de~ak Alastair Montgomery. Danas se procenjuje da se 1,33% ro|ene dece ra|a nakon primene neke od metoda
178
asistirane reproduktivne tehnologije. Louise Joy Brown je po~etkom 2007. godine rodila dete. Oplodnja u in vitro uslovima, osim svoje ogromne vrednosti primene u prakti~noj medicini otvorila je vrata nau~nom istra`ivanju, jer je ~ovek prvi put mogao da posmatra u laboratorijskim uslovima procese po~etka `ivota sa nezamislivim nau~nim mogu}nostima daljeg istra`ivanja potpuno novih oblasti. Rezultat toga je ogroman nau~ni huk novih istra`ivanja i otkri}a u poslednjih dvadeset godina. Metoda vantelesne oplodnje je kompleksna i sastoji se iz nekoliko delova: - stimulacija folikulogeneze, - punkcija i aspiracija folikula, - identifikacija jajne }elije, - fertilizacija, - embrio transfer, - luteal support.
specifi~ni oocitni faktori i faktori koje stvaraju granulozne }elije. Morfolo{ka i endokrina merenja su pokazala da je antralni folikul, ~iji je dijametar manji do 4 mm, prisutan u toku ciklusa i da ga je mogu}e stimulisati sa FSH - follicle stimulating hormonom. Na kraju lutealne faze, dijametar najve}ih folikula kre}e se izme|u 2 - 5 mm. Granulozne }elije u ovoj fazi su osetljivije na FSH - follicle stimulating hormon stimulaciju, ukazuju}i da su spremne za slede}i ciklus. Zahvaljuju}i gubitku funkcije corpus luteum-a, te padu estrogena, koncentracija FSH - folikul stimulirajuceg hormona raste na kraju lutealne faze. Svaki folikul ima isti potencijal da dostigne potpunu maturaciju, ali samo oni folikuli koji su u odmaklom stadijumu maturacije u toku interciklusnog rasta FSH - folikul stimulirajuceg hormona, tzv. praga za ovarijalnu stimulaciju, postaju gonadotropno zavisni i nastavljaju rast. Smatra se da antralnih folikula koji su regrutovani u toku luteofolikularne tranzicije ima oko 5 - 10 po ovarijumu. Smanjenje koncentracije FSH - folikul stimulirajuceg hormona u toku folikularne faze, poznato kao FSH - follicle stimulating hormone window, odlu~uju}e je za selekciju jednog dominantnog folikula iz regrutovane grupe. Samo jedan folikul izbegne atreziju zahvaljuju}i pove}anoj senzitivnosti za stimulaciju FSH - folikul stimuliraju}eg hormona. U ovom procesu isto tako aktivno u~estvuju faktori, pove}an broj granuloznih }elija, sticanje LH - luteinizing hormone receptora, pove}anje FSH - follicle stimulating hormone receptora na granuloznim }elijama kombinovano sa autokrinom i parakrinom regulacijom multiplog intraovarijalnog growth factor sistema. Jedan od mehanizama koji obja{njava ovu pojavu, bazira se na identifikovanju nekoliko izoformi FSH - folikul stimuliraju}eg
179
hormona, od kojih svaki pokazuje razli~iti stepen biopotencijala koji dominira u toku folikularne faze. Upotreba preparata gonadotropina u tretmanu problema neplodnosti bila je poznata od prve polovine dvadesetog veka. Inicijalno su kori{}eni preparati dobijeni iz seruma gravidne kobile, svinje i ekstrakti humane {titne `lezde za stumulaciju ovarijuma. Po~etkom pedesetih godina, HMG - human menopausal gonadotrophin je postao gonadotropinski preparat prvog izbora i dobijao se iz urina `ena u menopauzi. HMG - humani menopauzalni gonadotropin je inicijalno kori{}en u cilju indukcije ovulacije kod `ena sa anovulacijom. Sa uvo|enjem metode IVF - in vitro fertilizacije krajem sedamdesetih godina, HMG - humani menopauzalni gonadotropin dobija va`nu ulogu u stimulaciji multiplog razvoja folikula. Slede}a faza u razvoju gonadotropina za klini~ku upotrebu bilo je uklanjanje LH luteinizing hormona iz HMG - humanog menopauzalnog gonadotropina primenom imunoafinitetnih metoda. U-FSH - urinarni folikul stimuliraju}i hormon je sadr`ao FSH - folikul stimuliraju}i hormon zajedno sa koekstrahovanim urinarnim proteinima. Krajem osamdesetih godina dobija se visoko pre~i{}eni HP U-FSH - high purity urinarni folikul stimuliraju}i hormon koji se sastojao od 9000 IU FSH - folikul stimuliraju}eg hormon aktivnosti / mg proteina i 1% urinarnih proteina. U daljem razvoju poku{avano je da se dobije i visoko pre~i{}eni HMG - humani menopauzalni gonadotropin sa definisanim vrednostima FSH - folikul stimuliraju}eg hormona i LH - luteinizirajuceg hormona. Dobijeni preparat je imao oko 2000 IU specifi~ne aktivnosti / mg proteina. LH
komponenta je morala biti dodata upotrebom HCG - humanog horionskog gonadotropina, koji ima ve}i polu`ivot nego LH luteiniziraju}i hormon. Prisustvo varijabilnih koli~ina HCG - humanog horionskog gonadotropina u HMG - human menopauzalnog gonadodotropina preparatima je moglo da dovede do pove}anja varijacija izme|u razli~itih serija sa posledi~nom folikularnom atresijom. Analize tako dobijenog visoko pre~i{}enog HP HMG - high purity - human menopauzalnog gonadotropina su pokazivale prisustvo od najmanje 30% proteinskih ne~isto}a, uklju~uju}i leukocitni inhibitor elastaze, protein C inhibitor i cink alfa 2-glikoprotein. Izolovanje gena koji kodira sintezu beta subjedinice humanog FSH - folikul stimulirajuceg hormona 1983. godine omogu}ilo je realizaciju proizvodnje ~istog FSH folikul stimuliraju}eg hormona uz kori{}enje rekombinantne tehnologije. Prvi humani r-FSH - rek o mbinantni folikul stimuliraju}i hormon bio je odobren za klini~ku upotrebu 1995. godine. To je bio folitropin alfa. Drugi r-FSH - rekombinantni folikul stimuliraju}i hormon, folitropin beta, odobren je 1996. godine. Alfa i beta folitropin su sli~ni u smislu imunopotencije, in vitro biopotencije i unutra{njeg karbohidratnog sastava. Folitropin alfa poseduje ve}i sadr`aj acidnih glikoformi. Princip protokola ovarijalne stimulacije sastoji se u davanju gonadotropnih preparata sa ciljem stimulacije multiplog razvoja folikula. Prematurni skok LH - luteiniziraju}eg hormona kupira se davanjem GnRH - gonadotropin releasing hormon agonista i u novije vreme antagonista, po~inju}i pre po~etka ciklusa, ~ime se posti`e hipofizna down regulacija.
180
Izazivanje mejoti~ke deobe oocita posti`e se bolus injekcijom HCG - humanog gonadotropnog hormona, ili primenom r-LH - rekombinantnog luteiniziraju}eg hormona, ili GnRH - gonadotropin releasing hormon antagonista, ukoliko su u protokolu stimulacije kori{}eni GnRH gonadotropin releasing hormon agonisti. Corpus luteum se u lutealnoj fazi podr`ava primenom egzogenog progesterona. Kori{}ene grupe lekova su slede}e:
GnRH antagon
Antagonisti imaju potencijalnih prednosti u odnosu na agoniste zbog br`eg dejstva i odsustva simptoma koji nastaju usled pada nivoa hormona.
FSH
Rekombinantni hormon FSH je identi~an prirodnom hormonu, ali budu}i da je rekombinantni ne mo`e da prenosi nijedan infektivni agens. Koristi se za stimulisanje rasta i razvoja folikula.
GnRH agonisti
Ovu grupu predstavljaju sintetski lekovi, analozi prirodnih substanci koji mogu biti agonisti ili antagonisti po svom delovanju. Oni na po~etku kratko stimuli{u hipofizu, a potom izazivaju kontinuiranu supresiju - down regulaciju, omogu}avaju}i bolju kontrolu hormonske stumulacije kupiraju}i prematurni skok LH - luteiniziraju}eg hormona. Analiza vi{egodi{njih klini~kih studija pokazala je da njihova upotreba pove}ava procenat klini~kih trudno}a, smanjuje procenat prekida ciklusa i pove}ava broj dobijenih oocita u pore|enju sa ciklusima bez agonista. Deluju jo{ 10 - 18 dana od poslednje doze.
HMG
HMG - humani menopauzalni gonadotropin je ekstrahovan iz urina `ena u postmenopauzi i sadr`i me{avinu FSH - folikul stimuliraju}eg hormona i LH - luteiniziraju}eg hormona zajedno sa urinarnim proteinima.
HCG
Humani horionski gonadotropin se inicira 36 - 38 sati pre punkcije folikula radi maturacije folikula i izazivanja ovulacije.
COS - kontrolisana stimulacija ovarijuma se posti`e primenom odre|enih protokola dugog, kratkog i ultrakratkog, kao i protokola stimulacije sa antagonistima.
181
Po~etne doze pri kori{}enju protokola stimulacije se odre|uju jo{ uvek empirijski, mada statisti~kom analizom velikog broja klini~kih studija pokazuje se da je mogu}e i ovu oblast regulisati tipizacijom modela zasnovanim na ~etiri osnovne karakteristike pacijenata: godina starosti, BMI - body mass index-a, vrednosti FSH - folikul stimuliraju}eg hormona i broja antralnih folikula. Doze preparata gonadotropina kao i drugih peptida i proteina koji se koriste u farmakolo{koj praksi se tradicionalno iskazuju u IU - internacionalnim jedinicama koje predstavljaju aktivnost merenu u in vivo biolo{kim parametrima po Steelman-Pohley bioeseju ve} preko 50 godina. Procedure za sakupljanje i interpretaciju podataka su velike, a koeficijent varijacije mo`e biti 10 - 20%, {to mo`e imati za posledicu neravnomernu stimulaciju. Nedavni napredak u procesu proizvodnje kao i razvoju validnih fizi~ko-hemijskih metoda za odre|ivanje strukture gonadotropina omogu}ilo je da se u procesu proizvodnje rekombinantnih gonadotropina r-FSH - rekombinantni folikul stimuliraju}i hormon, r-LH - rekombinantni luteiniziraju}i hormon i r-HCG - rekombinantni humani horionski gonadotropin, upotrebi
FbM - filled by mass tehnika. FbM - filled by mass tehnikom gonadotropini su ta~no dozirani, kvantifikovani HPLC - high performance liquid chromatography, visoko efikasnom te~nom hromatografijom, metodom podr`anom mapiranjem glikana, izo-elektri~nim fokusiranjem i podacima o specifi~noj aktivnosti koji demonstriraju fizi~ko-hemijsku postojanost produkta. COS - kontrolisana ovarijalna stimulacija se posti`e, uz primenu odre|enog protokola, svakodnevnim pra}enjem razvoja folikula ultrazvu~nom sonografijom i doza`om hormona.
182
Dominantni folikul se identifikuje na osnovu: dijametra ve}eg od 10 mm, intrafolikularnih endokrinih promena i indukcije enzimske aromatozne aktivnosti. Utvr|en je porast inhibina B neposredno nakon interciklusnog rasta FSH - folikul stimulirajuceg hormona. Inhibin B limitira trajanje rasta FSH - folikul stimuliraju}eg hormona skra}uju}i FSH - folikul stimuliraju}eg hormona window, putem negativnog feed back-a sa hipofizom i mo`e da bude odlu~uju}i za monofolikularni razvoj. Primena malih doza egzogenog FSH folikul stimuliraju}eg hormona u toku sredine folikularne faze mo`e da poremeti ovaj mehanizam spre~avaju}i pad njegovih vrednosti pro{irenjem FSH - folikul stimuliraju}eg hormona window. Ovo ukazuje da se selekcija dominantnog folikula de{ava relativno kasno u toku folikularne faze oko 7 dana. U toku sedam dana preovulatornog LH - luteinizing hormone peak-a, folikul raste linearno u proseku 1,1 mm dnevno, dosti`u}i prose~nu preovulatornu veli~inu od oko 20,5 mm.
Uticaj pretretmana kontraceptivnim pilulama OCP - oral contraceptive pill na broj teku}ih trudno}a kod pacijenata u programima stimulisanih ciklusa u pore|nju sa pacijentima u tretmanima bez predtretmana nisu pokazali nikakvu signifikantnu statisti~ku razliku u broju trudno}a. Ono {to se u svim klini~kim radovima pokazalo zna~ajno je ve}i broj gubitaka rane trudno}e kod pacijenata sa predtretmanom kontraceptivnim pilulama OCP oral contraceptive pill.
183
koncentracije serumskog estradiola i progesterona, {to direktno ima uticaj na kvalitet endometrijuma. Danas, najve}i broj protokola stimulacije podrazumeva upotrebu GnRH - gonadotropin releasing hormon analoga i gonadotropina. Histolo{ke promene endometrijuma u toku menstrualnog ciklusa opisane su jo{ pre 50 godina. Histolo{ka maturacija u prirodnom i stimulisanom ciklusu u lutealnoj fazi nultog dana i 7. dana je data na slede}im slikama.
Sl. 4.11- Lutealna faza, prirodni ciklus, 7. dan
U stimulisanom ciklusu na dan punkcije i va|enja oocita glandularne }elije pokazuju subnuklearnu vakuolizaciju i veoma malo mitoti~kih figura.
U lutealnoj fazi sedmog dana stimulisanog ciklusa endometrijum pokazuje glandularno stromalnu disinhroniju sa perzistiraju}im vakuolama u `lezdama. Histolo{ki nalazi u preovulatornoj fazi ciklusa pokazuju proliferativne i rane sekretorne promene, ~ak i pre nego {to do|e do po~etka rasta progesterona. U preovulatornoj fazi registruje se op{te odmakla maturacija endometrijuma. Na dan punkcije oocita vidi se dalji progres maturacije endometrijuma. Dva dana nakon punkcije oocita, registruje se diskordinantna stromalna maturacija sa edemom i vaskularnom hipertrofijom. Nije na|ena zna~ajna razlika izme|u stimulisanih i prirodnih ciklusa.
184
U ranoj srednjoj lutealnoj fazi i 4. dana nakon punkcije oocita, glandularni razvoj ne pokazuje razlike izme|u stimulisanog i spontanog ciklusa. U ciklusima gde je primenjen luteal support sa HCG - human chorionic gonadotropinom ili vaginalnim progesteronom na|ena je normalna histologija bez razlike, zbog primene luteal support-a. U lutealnoj fazi od 11 - 13. dana nakon HCG - human chorionic gonadotropin injekcije na|en je normalni endometrijum. [to se ti~e pore|enja endometrijuma u preovulatornoj fazi izme|u 2 i 4. dana u ciklusima sa primenom agonista i antagonista, uzorci biopsije pokazuju sli~ne endometrijalne promene. U srednjoj lutealnoj fazi u pore|enju sa ciklusima sa agonistima, po~etni rezultati pokazuju manje ka{njenje kod primene antagonista ukoliko se ne primenjuje luteal support. S obzirom na te{ko}e proistekle iz razli~itih protokola stimulacije i primene agonista, kao i razli~itog re`ima lutealne podr{ke i metoda analiza endometrijalne biopsije, te{ko je izvu}i precizan zaklju~ak. Op{te je mi{ljenje da je u peri i postovulatornom periodu prisutna uznapredovala maturacija endometrijuma, pra}ena normalnim karakteristikama endometrijuma u ranoj lutealnoj fazi rezultiraju}i u ~estoj glandularno - stromalnoj disihroniji u srednjoj i kasnoj lutealnoj fazi. Opa`anja kod primene GnRH - gonadotropin releasing hormon agonista, potvr|uju klini~ku potrebu za lutealnom podr{kom u ovim ciklusima u cilju korigovanja u srednjoj lutealnoj fazi, tj. manje ka{njenje glandularnog razvoja. Posebne promene endometrijuma u IVF - in vitro fertilisation ciklusima verovatno su uzrokovane dejstvom nekoliko faktora. Rano i pove}ano izlaganje endometrijuma dejstvu progesterona mo`e da objasni
ranu sekretornu transformaciju, kao i sledstveni glandularni arest u sredini lutealne faze. Pove}ani serumski nivo estradiola u stimulisanim ciklusima povezan je sa ~estom glandularno - stromalnom asihronijom. HCG - human chorionic gonadotropin je mogu}i uzrok poreme}ene endometrijalne morfologije u lutealnoj fazi. Na kraju je dokazano da GnRH - gonadotropin releasing hormon i njegovi agonisti imaju antiproliferativni efekat na endometrijum. Endometrijalni steroidni receptori u stimulisanom ciklusu su od posebnog zna~aja. U stimulisanim ciklusima glandularni i stromalni progesteronski receptori su smanjeni u preovulatornoj i lutealnoj fazi. Podaci o endometrijalnim estrogenim receptorima u stimulisanim ciklusima su manje jasni, budu}i da je na|eno u razli~itim studijama i smanjenje i pove}anje glandularnih estrogenih receptora. Drugog dana nakon punkcije oocita, na|en je nizak nivo progesteronskih receptora povezan sa smanjenim brojem estrogenih receptora, kako glandularnih tako i stromalnih, {to je potvr|eno i u toku lutealne faze u stimulisanim ciklusima. Neke od studija su pokazale odsustvo razlika u steroidnim receptorima izme|u prirodnog i stimulisanog ciklusa u toku razli~itih dana lutealne faze, ali su ukazale na razli~itu regulaciju progesteron povezanih molekula, kao {to su growth faktori i ubiquitin u prirodnim i stimulisanim ciklusima. Ovi rezultati potkrepljuju zapa`anja o modifikovanom endometrijalnom okru`enju u stimulisanim ciklusima u pore|enju sa prirodnim. Markeri implantacionog prozora u stimulisanim ciklusima su posebno istra`eni zbog njihovog zna~aja. Implantation window - implantacioni prozor je definisan kao ograni~eni period u
185
toku koga je uterus receptivan za implantaciju slobodne blastociste. Pretpostavlja se da u humanom prirodnom ciklusu apozicija blastociste po~inje oko LH-peak + 6 dana i zavr{ena je LH-peak + 10 dana. U toku receptivne faze endometrijum privremeno sekretuje proteine koji }e biti prepoznati od strane embriona i koji }e olak{ati njegov rast i diferencijaciju. U najzna~ajnije faktore implantacije spadaju luminalne epitelne pinopode, ekspresija adhezionih molekula i citokina.
toku priprodnog i stimulisanog ciklusa. Integrini su povr{inski }elijski adhezioni molekuli uklju~eni u {iroki spektar }elijskih procesa.
Pinopodi su opisani kao epitelne projekcije sa pinocitoti~kom aktivno{}u. Kod normalnih fertilnih `ena, formacija i regresija pinopoda je blisko povezana sa koncentracijom serumskog progesterona kao i sa down regulacijom progesteronskih receptora B u glandularnim i luminalnim }elijama. Pinopode su dokazane na apikalnoj povr{ini luminalnih epitelnih }elija u toku postojanja implantation window-a od 20 - 22. dana. Me|utim, nedavne studije dovode u pitanje ovu pretpostavku, budu}i da pojava pinopoda varira i do 5 dana izme|u `ena, kao i da direktno u~e{}e ovih struktura u implantaciji embriona nije potvr|eno. Novije studije koje su upore|ivale ekspresiju pinopoda kod istih pacijenata nisu pokazale razlike u ekspresiji u
Na slici se vidi integrin 7. dana lutealne faze u stimulisanom ciklusu. Glandularni epitel pokazuje membranozno bojenje. Pretpostavlja se da su tri integrina: alfa 1 beta 1, alfa 4 beta 1 i alfa 5 beta 3, va`na za endometrijalnu receptivnost, budu}i da se jasno ispoljavaju u toku implantation window-a. LIF -leukemia inhibitory factor je pleiotrofi~ni citokin iz gp 130 familije. LIF leukemia inhibitory factor se pojavio kao prvi citokin koji je uklju~en u razvoj i implantaciju embriona.
186
U stimulisanom ciklusu 7. dana lutealne faze raspoznaje se intenzivno bazalno i apikalno citoplazmati~no bojenje. Razvoj endometrijuma u IVF - in vitro fertilisation ciklusima pokazuje progres koji je ve}i ili jednak za 2 dana u odnosu na prirodni ciklus na dan ovulacije. Ovaj progres je vi{e istaknut u ciklusima sa prematurnim porastom serumskog progesterona na ili pre dana injekcije HCG human chorionic gonadotropina. U GnRH - gonadotropin releasing hormon antagonist ciklusima, stepen endometrijalnog progresa se mo`e predvideti pomo}u visokih koncentracija LH luteinizing hormona u vreme inicijacije stimulacije rekombinovanim FSH - rekombinantni folikul stimuliraju}i hormona i trajanjem tokom stimulacije rFSH - rekombinantni folikul stimuliraju}i hormona pre antagonist inhibicije. Ova korelacija nije bila prisutna kod GnRH - gonadotropin releasing hormon agonist ciklusa, gde niska serumska koncentracija LH - luteinizing hormona nastaje kao rezultat hipofizne desenzibilizacije. Endometrijalne morfoloske karakteristike posebnih sekretornih transformacija u oba stimulatorna re`ima uklju~uju pojavu uniformnih glandularnih subnukleolarnih vakuola, zamenjuju}i nukleus. Ove histolo{ke promene su povezane sa smanjenjem proliferacionog indeksa i proliferacionog sadr`aja i kod `lezda, i u stromi. Implantacija korelira negativno sa zna~ajnim endometrijalnim maturacionim progresom koji je ve}i od 3 dana na dan punkcije oocita. Na dan punkcije ni jedan endometrijalni marker nije povezan sa ishodom klini~ke trudno}e. Dosada{nja iskustva su pokazala da u stimulisanim ciklusima sa embriotransferom,
izmenjeni endometrijum kao posledica terapije tokom IVF - in vitro fertilisation ima manji uticaj na endometrijalnu receptivnost nego {to se ranije pretpostavljalo. Kvalitetan embrion mo`e u odre|enom stepenu da kompenzuje manje optimalan razvoj endometrijuma. Postoje jaki dokazi iz histolo{kih opservacija i ekspresije implantation window-a markera da ovarijalna stimulacija u toku IVF - in vitro fertilisation menja endometrijalni razvoj u lutealnoj fazi. Iz studija o IVF - in vitro fertilisation ciklusima se pokazalo da samo ekstremno devijantna endometrijalna morfologija ima uticaj na receptivnost endometrijuma za implantaciju. Dalje otkrivanje molekula uklju~enih u implantacione mehanizme neophodno je za bolje razumevanje veze izme|u nastalih promena razvoja i receptivnosti u IVF - in vitro fertilisation ciklusima.
187
dostigne srednji pre~nik od 16 - 18 milimetara. U kontekstu trenutne prakse asistirane reprodukcije, gde mnogi programi kombinuju ovarijalnu stimulaciju pituitarnom regulacijom sa GnRH - gonadotropin releasing hormonom, sazrevanje oocita se obi~no podsti~e u odsustvu endogenog LH - luteinizing hormone talasa pomo}u HCG - human chorionic gonadotropina kada nekoliko folikula ima srednji pre~nik ve}i od 18 mm. Mi{ljenja su podeljena o optimalnom pre~niku koji folikuli treba da dostignu pre primene egzogenog HCG - human chorionic gonadotropina, 16mm, 18mm ili vi{e od 20mm. Postoje nesumnjivi dokazi da zreli folikuli vr{e parakrini efekat unutar jajnika. Tako zreli oociti u drugoj metafazi mogu biti dobijeni iz relativno malih folikula koji imaju srednji pre~nik manji od 16 mm, pod uslovom da je bar neki od cohort-a dostigao optimalnu veli~inu. Me|utim, ne suprostavljaju}i se uspehu ovog metoda u nadokna|ivanju oocita koji su dostigli nuklearnu zrelost, postoje dokazi da je ve}ina ovih oocita manje kompetentna. Tako, bez obzira na nadoknadu mejoti~ki zrelih oocita koji imaju prihvatljiv stepen oplodnje, ve}ina embriona nema kapacitet da se implantira ili da se razvije u fetus sposoban za normalan rast i razvoj. Ovo se mo`e povezati sa izve{tajem o velikom padu aneuploidnosti oocita koji mo`e pogoditi vi{e od 25% morfolo{ki normalnih oocita. Bilo je sugerisano da poreme}aji hromozomske segregacije i spindle defekti mogu biti rezultat suptilnih promena u fiziologiji citoplazme kao {to je smanjeni intracelularni pH. Transvaginalna punkcija folikula kori{}enjem abdominalne sonde je prvi put opisana od strane Dellenbach-a 1984. godine. Mnogo direktniji i lak{i metod posti`e se ne{to kasnije uvo|enjem vaginalne sonde.
Prvi put ova tehnika opisana je 1984. godine od strane Wickland-a. Prednosti ove metode su da je minimalni rizik povre|ivanja mokra}ne be{ike, ve}a preciznost lokalizacije folikula, kao i mogu}nost izvo|enja postupka u lokalnoj anesteziji.
188
Zreo preovulatorni oocit karakteri{e ekstenzivno rastresit, pro{iren kumulus i coronae radiata. Prisustvo prvog polarnog tela ukazuje da je oocit u metafazi II. Oocit srednje zrelosti karakteri{e neznatno gu{}a korona radiata uz rastresit cumulus. Ne identifikuju se germinal vesicle i polarno telo. Nezreo oocit ima kompaktnu coronu, a cumulus se sastoji od samo nekoliko }elijskih slojeva. Germinal vesicle se lako prime}uje kod nezrelih oocita. Atreti~ni oocit karakteri{e oskudan, kompaktan cumulus sa crnom i nepravilno oblikovanom ooplazmom.
mogla biti upotrebljena konvencionalna IVF - in vitro fertilizacija. Kod prve tehnike PZD - partial zona dissectio pravljen je mali otvor u zona pelucidi koji je dozvoljavao spermatozoidima direktan pristup oolemi. Ukupni rezultati PZD - partial zona dissectio su bili razo~aravaju}i. Slede}a tehnika koja je bila predstavljena je bila SUZI subzonska inseminacija. Nekoliko pokretnih spermatozoida je injektovano kroz perivitelinski prostor. Na ovaj na~in fertilizovano je pribli`no 20% oocita. Iskustvo sa primenom ove dve metode je pokazalo da je procenat normalnih oplodnji bio previ{e mali. U ve}ini klini~kih radova potvr|eno je da je u proseku samo jedan ili dva embriona transferirano, i to, kod oko 66% pacijenata od ukupnog broja. Procenti trudno}a i poro|aja su bili premali da bi se ove tehnike razmatrale za rutinsku klini~ku primenu. U julu 1992. godine je objavljena prva trudno}a i poro|aj nakon uvo|enja metode ICSI - intra citoplasmatic sperm inection, kada se jedan spermatozoid injektuje u oocit nakon prolaska kroz zona pellucidu i kroz membranu oocita, oolemu. U narednom periodu, do danas, istra`ivanja su se fokusirala na odnos izme|u smanjene zrelosti spermatozoida i frekventnosti hromozomnih aneuploidnosti i paralelno na efikasnost raznih metoda pripreme spermatozoida koje se koriste u asistiranoj reprodukciji radi eliminacije nezrelih spermatozoida. Klju~ne ta~ke dosada{njih istra`ivanja koje treba naglasiti su slede}e: - zadr`avanje citoplazme kao markera nezrelosti spermatozoida i dvotalasni {ablon izbacivanja testis specifi~nog HspA2 - heat shock 70kDa protein 2 prate}eg proteina kod razvijenih spermatozoida tokom mejoze i kasne spermatogeneze;
189
- }elijsko sazrevanje, remodeliranje membrane i njihov doprinos funkciji oplodnje spermatozoida; - veza izme|u spermatozoida i hromozomskih aneuploidnosti; - relativne efikasnosti gustinskog gradijenta i swim-up metode pri eliminisanju aneuploidnih i diploidnih spermatozoida; - upotreba vezivanja HA - hyaluronic acid- a pri selekciji pojedina~nih zrelih spermatozoida sa niskim nivoima hromozomskih aneuploidnosti i degradacije DNK deoksiribonukleinske kiseline (DNA - deoxyribonucleic acid).
Zadr`avanje citoplazme kao markera nezrelosti spermatozoida i drugi biohemijski markeri }elijskog sazrevanja spermatozoida imaju posebnu va`nost kao objektivni biohemijski markeri zrelosti koji bi predvideli mu{ku plodnost nezavisno od tradicionalnih kriterijuma koncentracije spermatozoida i njihove pokretljivosti. U merenjima spermatozoidne kreatinN-fosfotransferaze ili CK - kreatin kinaze otkriveno je zna~ajno ve}i nivo aktivnosti CK - kreatin kinaze spermatozoida kod mu{karaca sa smanjenom fertilno{cu. [abloni imuno bojenja kreatin kinaze su pokazali da je visoka aktivnost CK - kreatin kinaze spermatozoida direktna posledica pove}anih koncentracija proteina citoplazme i CK - kreatin kinaze u samom spermatozoidu. U analizi elektroforezom ekstrakta ljudske sperme na|en je jo{ jedan protein koji sadr`i ATP - adenosine triphosphate i koji je bio u srazmeri sa pojavljivanjem zrelih spermatozoida, koje karakteri{e niska aktivnost CK - kreatin kinaze i nezadr`avanje citoplazme. Nedavno je identifikovan ovaj razvojno regulisani protein kao 70 kDa prate}i protein koji je nazvan HspA2 recombinant protein - heat shock 70kDa protein 2. Bliska inverzna korelacija izme|u
broja spermatozoida sa zadr`avanjem citoplazme i odnosa HspA2 - rekombinantni protein je pokazala da su eliminacija citoplazme i po~etak sinteze me|usobno povezani. Ovaj protein se pokazao kao najkorisiji objektivni biohemijski marker. U spermatogenezi istovremeno sa eliminacijom citoplazme i po~etkom sinteze HspA2 - proteina, membrana spermatozoida prolazi kroz remodeliranje vezano za sazrevanje. Ovaj korak remodeliranja olak{ava formiranje receptora koji slu`e za vezivanje za zonu pellucidu i za vezivanje hialuronske kiseline kod zrelih spermatozoida. Nezreli spermatozoidi imaju povi{ene stepene peroksidacije lipida . Utvr|eno je u daljim studijama da se svi doga|aji tokom sazrevanja spermatozoida, koji su u vezi sa padom aktivnosti CK kreatin kinaze i pove}anjem ekspresije HspA2 - recombinant protein zavr{avaju do trenutka kada spermatozoidi u|u u epididimis.
]elijsko sazrevanje i remodeliranje membrane imaju uticaja na funkciju oplodnje. Prediktivne vrednosti aktivnosti kreatin kinaze koja predstavlja zadr`avanje citoplazme je testirana kod parova le~enih intrauterinom inseminacijom kod kojih je suprug bio oligospermi~an. U svim slu~ajevima identi~ne koncentracije spermatozoida i parametara pokretljivosti postojala je ~etvorostruko ni`a aktivnost kreatin kinaze spermatozoida parova kod kojih je do{lo do trudno}e. U studijima je potvr|eno da su samo zreli spermatozoidi sa niskom kreatin kinazom bili sposobni da se ve`u za zonu pelucidu. Spermatozoidi sa zadr`anom citoplazmom se nisu vezivali za oocite. U daljem prou~avanju se pokazalo da se remodeliranje membrane kod spermatozoida odvija istovremeno sa istiskivanjem citoplazme
190
tokom spermatogenetskog sazrevanja. Ovo je demonstrirano bliskom korelacijom izme|u koncentracije kreatin kinaze ili odnosa HspA2 - heat shock 70kDa protein 2 recombinantnog proteina i gustine enzima plazme spermatozoida 1,2 -galaktosiltransferaze kod spermatozoida razli~ite zrelosti. Ovaj nalaz obja{njava dve va`ne karakteristike nezrelih spermatozoida: zadr`avanje citoplazme i deficijenciju u vezivanju sa zonom pelucidom. Izbacivanje HspA2 - heat shock 70kDa protein 2 proteina se odvija istovremeno sa kretanjem spermatozoidnih proteina, koji je u osnovi istiskivanja citoplazme i remodeliranja plazma membrane spermatozoida. Ovo omogu}ava vezivanje spermatozoida za zonu pelucidu. Sinteza Hsp70 - 2 - heat shock 70kDa protein 2 familije proteina reguli{e se u toku razvoja i Hsp70-2 - heat shock 70kDa protein 2 se pojavljuje tokom profaze mejoze. Protein Hsp70 -2 - heat shock 70kDa protein 2 koji osloba|a testis, prvo se sinteti{e kod pahitenskih spermatocita tokom mejotske faze spermatogeneze i istrajava u spermatidima i zrelim spermatozoidima. Funkcije Hsp70 - 2 - heat shock 70kDa protein 2 su odr`avanje sinaptonemalnih kompleksa i pomaganje kreatanju hromozoma tokom mejoze i razvoja spermatocita. Prema tome, ciljano inaktivacija Hsp70 -2 - heat shock 70kDa protein 2 gena izaziva zastoj sazrevanja spermatozoida i azospermiju, {to mo`e biti povezano sa lo{om mejotskom rekombinacijom spermatocita, reme}enjem regulatornog mehanizma }elijskog ciklusa mejoze, ili sa direktnom degradacijom apoptoti~kog mehanizma spermatocita, ili ~ak spermatida, ili ejakuliranih nezrelih spermatozoida.
zna~aja. Frekvencija hromozomskih aneuploidnosti je ve}a kod nezrelih spermatozoida u odnosu na zrele. Ra|ene su korelacione analize o zavisnosti izme|u udela nezrelih spermatozoida i zadr`avanja citoplazme i frekvencije ukupnih dizomija, diploidije i ukupnih dizomija i diploidije. Me|u raznim dizomijama je dizomija Y hromozoma u najboljoj korelaciji sa incidencijom nezrelih spermatozoida. Treba posebno izdvojiti rezultate studija koje su utvrdile da nije bilo nikakve korelacije izme|u nezrelih spermatozoida i incidencije diploidije, sto zna~i da pojava diploidnosti nije u vezi sa nezrelo{}u spermatozoida.
Relativne efikasnosti gustinskog gradijenta i swim-up metode pri eliminisanju aneuploidnih i diploidnih spermatozoida su potvr|ene u mnogobrojnim istra`ivanjima. Nezreli spermatozoidi imaju manju gustinu zbog zadr`ane citoplazme, u pore|enju sa zrelim spermatozoidima koji se sastoje od nukleusa, akrozoma, strukture repa i plazma membrane. Zbog ovog razloga se zreli spermatozoidi, bez citoplazme, talo`e na dnu gustinskih gradijenata, dok se nezreli spermatozoidi zadr`avaju u gornjem delu, bilo na vrhu faze gradijenata, ili u slu~aju multifaznih gradijenata, u me|uprostoru izme|u razli~itih faza gradijenta. Gradijent se sastoji od koloidnih ~estica SiO2 stabilisanih kovalentno povezanim hidrofilnim koloidalnim ~esticama silana SiH4. Rastvor sadr`i EDTA - ethylenediaminetetraacetic acid i glukozu. Gradijent se naj~e{}e formira postepeno u slojevima rastvora od 90%, 70% i 40% u cilju selektiranja odre|enih pre~nika }elija. Prvi sloj }e zadr`ati epitelne }elije i krvne }elije. Sloj sa koncentracijom od 70% }e odvojiti nezrele spermatozoide, okrugle spermatide kao i one sa abnormalno oblikovanim glavama.
191
U praksi je i dualni gradijent sastavljen od 40% i 90% rastvora podjednako efikasan u izdvajanju normalnih spermatozoida. U studijama koje su ra|ene analiziralo se da li gustinski gradijenti elimini{u nezrele spermatozoide iz delova taloga, da li se odvajaju spermatozoidi sa hromozomskim aneuploidijama i diploidijama iz dela taloga i da li postoji veza izme|u pojave nezrelih spermatozoida i spermatozoida sa hromozomskim aneuploidijama. U studijama je kori{}en Percoll gradijent i njegovi derivati. Upotrebom FISH - fluorescence in situ hybridization metodom su procenjivani nukleusi spermatozoida, u svakoj od 20 frakcija pomo}u centromerskih sondi za hromozome X, Y i 17, {to je prikazano na slici br. 4.18. U istra`ivanjima je potvr|eno da je u~estalost hromozomskih aberacija kod spermatozoida, kako aneuploidija tako i diploidije, zna~ajno smanjena u 80% Percoll talogu nasuprot inicijalnim frekvencijama koje su odre|ivane u spermatozoidima ejakulata.
Ovi nalazi mogu se objasniti pove}anim brojem zrelih spermatozoida u 80% Percoll talogu. Tako|e je sa stanovi{ta zrelosti spermatozoida, uzorak izdvojen u talogu homogeniji od inicijalnih uzoraka. U~estalosti dizomije i diploidije spermatozoida u Percoll talogu smanjene su 2,8 puta u odnosu na inicijalni uzorak. Porede}i odvojeno dizomije i diploidiju, mo`e se konstatovati da je smanjenje bilo o~iglednije kod disomija, i to, 3,3 puta u odnosu na diploidiju, ~ije smanjenje je bilo 2,1 puta. Dizomije su u direktnoj korelaciji sa eliminacijom nezrelih spermatozoida iz ejakulata u odnosu na diploidnosti. Swim-up tehnika se ~esto koristi za pripremu spermatozoida u metodama asistirane reprodukcije. Uvo|enje fluoroscentne in situ hibridizacije FISH - fluorescence in situ hybridization sa hromozom specifi~nim DNK - deoksiribonukleinska kiselina sondama je olak{alo detekciju aneuploidija X i Y hromozoma i nekih autozoma, kao i detekciju diploidnosti. Publikacije koje su se bavile rezultatima posle
normalan
dizomija
diploidija
Sl. 4.18- FISH - fluorescence in situ hybridization dekompenzovano jedro spermatozoida (markeri centromera X, Y i 17)
192
swim-up separacije fokusirale su se na pitanje eliminacije spermatozoida sa aneuploidijama i diploidijom, ali su objavljeni rezultati protivure~ni. Postoje izve{taji koji pokazuju da nije bilo promena u frekvencijama aneuploidnosti ili diploidnosti inicijalnog ejakulata nasuprot swim-up selektiranim spermatozoidima. U drugim studijama je utvr|en pad frekvencije pojave diploidnosti nakon swim-up pripreme sperme. U nekim studijima nije bilo razlika u frekvencijama dizomije ili diploidnosti izme|u inicijalnog uzorka i swim-up separisanih spermatozoida pri koncentraciji ve}oj od 30 miliona/ml, ali je utvr|eno smanjenje broja aneuploidnih i diploidnih spermatozoida u grupi pacijenata sa brojem manjim od 30 miliona/ml. Postojale su individualne varijacije u frekvenciji dizomija polnog hromozoma zbog varijacija u broju nezrelih spermatozoida. Ove razlike me|u razli~itim studijama se obja{njavaju varijacijama u selekciji pacijenata i zbog malog broja procenjenih nukleusa spermatozoida. Za pouzdanu procenu broja aneuploidnosti i diploidnosti, s obzirom na srednju frekvenciju od 0,1% do 0,6%, ili 1 do 6 devijantnih nukleusa spermatozoida na svakih 1.000 trebalo bi proce-
niti pribli`no 6.000 -10.000 spermatozoida u svakom uzorku, {to kod ve}ine studija nije slu~aj. Od posebnog interesa je bilo pitanje stepena eliminacije hromozomskih aberacija kori{}enjem swim-up metode, jer su dosada{nje studije pokazale da je gradijentna separacija efikasnija u eliminaciji spermatozoida sa dizomijama, nego u eliminaciji spermatozoida sa diploidijom. Nezreli spermatozoidi su identifikovani prisustvom zadr`ane citoplazme ozna~ene pomo}u kreatin kinaze-imunocitohemije. Aneuploidnosti su detektovane pomo}u FISH - fluorescence in situ hybridization metode. U jednoj od studija analizirani su i dobijeni slede}i podaci: Efikasnost swim-up procedure je merena pore|enjem broja pokretnih spermatozoida u inicijalnom uzorku sa brojem nakon swim-up selekcije. U ovoj grupi je broj pokretnih spermatozoida bio 37,4 4,3% {to je i prikazano u donjoj tabeli. Zajedno sa pove}anjem broja pokretnih spermatozoida u swim-up selektiranoj spermi, deo nezrelih spermatozoida sa zadr`anom citoplazmom je tako|e opao. Odnos zrelih i nezrelih spermatozoida: inicijalni uzorak 55,5% u odnosu prema 44,5%, swim-up 71,7% u odnosu prema 28,3%.
Koncentracija (M/ml) 10 45,5 22,3 12,2 32,7 15,8 10,4 8,9 19,74,64
Pokretljivost (%) 50 42,1 46,1 30,7 48,4 42,3 43,4 59,2 45,22,87
Swim-up Prinos pokretnih pokretljivost (%) spermatozoida (%) 90 52 92,6 43,4 76,1 49,5 30 10 90 70,8 75 51,5 70 1,55 50 6,6 71,77,73 37,48,33
193
Analiziraju}i ostale dizomije utvr|eno je zna~ajno smanjenje dizomija polnog hromozoma, sa ukupnim smanjenjem od 1,4 puta. Frekvencija diploidnosti i njeno smanjenje je pokazalo rezultat druga~iji od onog kod dizomija. Diploidija je skoro trostruko smanjena, u~estalost diploidija kod swim-up selektiranih spermatozoida smanjena je 2,9 puta u odnosu na inicijalni uzorak. Kao {to je ranije konstatovano kod primene gradijentne i swim-up metode selektuju se i dizomije i diploidija. Swimup metoda pokazala se efikasnijom u smanjenju u~estalosti diploidija spermatozoida, dok je gradijentna metoda bila efikasnija u eliminaciji dizomija. Za razliku od selekcije gradijentnim rastvorom, nije bilo korelacije izme|u redukcije dizomija i udela nezrelih spermatozoida sa zadr`avanjem citoplazme. Ovo pokazuje da zrelost spermatozoida i pokretljivost nisu u bliskoj vezi. Porede}i rezultate dobijene primenom gradijentne i swim-up metode pri eliminaciji aneuploidnih spermatozoida do{lo se do slede}ih zaklju~aka: Gradijentna separacija je veoma efikasna u smanjenju udela spermatozoida sa dizomijama, ali nije podjednako efikasna i u selekciji diploidnosti, jer gustina spermatozoida igra odre|enu ulogu. Swim-up je manje efikasna metoda u selekciji spermatozoida sa dizomijama, u odnosu na separaciju gradijentnim rastvorom, jer pokretljivost spermatozoida i zrelost nisu uvek u direktnoj korelaciji. Efekat eliminacije spermatozoida sa dizomijom kod gradijentne centrifuge u odnosu na swim-up su 2,7 puta u odnosu na 1,4 puta. Spermatozoidi sa zna~ajno sni`enom zrelo{}u ostaju u talogu, kao {to je ranije pokazano da spermatozoidi sa abnor-
malnom morfologijom imaju manje efikasnu pokretljivost. Swim-up metoda je efikasnija od gradijentne separacije u eliminisanju diploidnih spermatozoida. Faktor eliminacije diploidnosti kod gradijentne centrifuge u odnosu na swim-up je 1,85 puta u odnosu na 2,86 puta. Smatra se da su diploidni spermatozoidi te`i, pa je zbog toga efikasnost njihovog kretanja umanjena.
Upotreba vezivanja HA - hyaluronic acid - a pri odabiranju pojedina~nih zrelih spermatozoida sa niskim nivoima hromozomskih aneuploidnosti i degradacije DNK - deoksiribonukleinske kiseline je novijeg datuma. Zreli spermatozoidi u odnosu na hijaluronsku kiselinu pokazuju pove}anu brzinu kretanja i prolongiranu pokretljivost.
Na osnovu veze izme|u sazrevanja spermatozoida i remodeliranja plazma membrane dokazano je prisustvo receptora HA - hyaluronic acid kod zrelih spermatozoida, za razliku od nezrelih. Na osnovu ovoga mogu}a je selekcija zrelih spermatozoida pomo}u HA hyaluronic acid-a.
194
Postoje veze izme|u mejotskih defekata i nedostataka remodeliranja plazma membrane. Ove veze su bazirane na dualnim funkcijama HspA2 - heat shock 70kDa protein 2, prate}eg proteina koji podr`ava mejozu, kao komponente sinaptonemalnog kompleksa koja olak{ava remodeliranje plazma membrane i formiranje zona pellucida-e.
U mnogim studijama je istra`ivana efikasnost selektiranja zdravih spermatozoida od spermatozoida sa hromozomskim aneuploidijama i diploidijom. Rezultati su pokazali da je kod spermatozoida vezanih za HA - hyaluronic acid opao broj dizomija. Pad broja dizomija kod polnih hromozoma je bio ~etvorostruk. Broj diploidnih spermatozoida je bio smanjen {est puta. Podaci pokazuju da je selekcija putem HA- hyaluronic acid eliminisala spermatozoide sa dizomijom i diploidno{}u, efikasnije od gradijentne separacije i od swim-up tehnike. Broj aneuploidnosti i diploidnosti u postupku HA - hyaluronic acid vezivanjem je smanjen u opsegu od 0,04 - 0,13%. Selekcija spermatozoida pomo}u HA hyaluronic acid-a pru`a novo, bezbedno i efikasno re{enje za izdvajanje zrelih spermatozoida za ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. Na osnovu dosada{njih istra`ivanja mo`e se zaklju~iti da se zreli spermatozoidi trajno vezuju za povr{ine sa HA - hyaluronic acid, da se vezivanje spermatozoida mo`e testirati pomo}u HAhyaluronic acid-a i da se broj spermatozoida sa hromozomskim anomalijama smanjuje pribli`no 4 - 6 puta.
Tabela 4-2: U~estalost dizomije i diploidije u ejakulatu i sperme tretirane HA - hyaluronic acid-om
Dizomija Polni
Sl. 4.21- Aspiracija spermatozoida u programu ICSI - intra citoplasmatic sperm injection selektiranog uz pomo} HA - hyaluronic acid-a
17 17 0.04
Pove}an broj hromozomskih aberacija usled upotrebe nezrelih spermatozoida za ICSI - intra citoplasmatic sperm injection je od velikog zna~aja.
5,3x
<0,001 <0,001
195
Analiziraju}i radove pokazalo se da su uzro~ne veze izme|u stepena aneuploidija i infertiliteta posledica neadekvatne definicije mu{ke neplodnosti. Konvencionalna definicija je bazirana na koncentraciji i pokretljivosti spermatozoida, koja kod zna~ajnog dela oligospermi~nih ili, ~ak normospermi~nih mu{karaca ne odra`ava pravi status oplodnog potencijala spermatozoida. Aktivnost kreatin kinaze, nasuprot tome, bolje prikazuje prose~nu zrelost spermatozoida u odnosu na zadr`avanje citoplazme. Podaci o aktivnostima kreatin kinaze nisu merilo stvarne zrelosti pojedina~nih spermatozoida zbog velike varijacije u stepenu zadr`avanja citoplazme. Relativna frekvencija spermatozoida sa umanjenom zrelo{}u, koja je va`na u odnosu na podatke dobijene FISH - fluorescence in situ hybridization analizama za pojedina~ne nukleuse spermatozoida je odre|ena procenjivanjem pojedina~nih spermatozoida putem imunocitohemije. Veza izme|u pokretljivosti i morfologije i selektivna eliminacija dizomi~nih spermatozoida pomo}u gradijentne selekcije su dobro dokumentovani zna~ajnim redukcijama broja spermatozoida sa citoplazmom, kao i zna~ajnim smanjenjem aktivnosti CK kreatin kinaze u gradijentnim talozima. Tako su objektivni biohemijski podaci potvrdili pretpostavku koja se odnosi na vezu izme|u nezrelosti spermatozoida i njihove umanjene gustine koja je posledica zadr`avanja citoplazme kod nezrelih spermatozoida. Zbog toga je u pripremi za asistiranu reprodukciju, swim-up metod veoma efikasan u smanjenju dela diploidnosti. Suprotno ovome, kod smanjenja dizomije gradijentna selekcija je metoda izbora. Uloga aneuploidnih spermatozoida sa neadekvatnim remodeliranjem plazma
membrane, nije bila va`na kod klasi~ne oplodnje zbog prisustva barijere zone pelucide. Uvo|enjem ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metode se premo{}ava konvencionalni proces prirodne selekcije spermatozoid - zona. Selekcija spermatozoida pomo}u HA - hyaluronic acid-a pru`a priliku za oplodnju zrelim spermatozoidima. Osim toga, upotreba slajdova prevu~enih sa HA - hyaluronic acid-om dozvoljava istovremeno testiranje svakog pacijenta i na udeo zrelih spermatozoida i na ukupan broj pokretnih zrelih spermatozoida. Ovi podaci su veoma va`ni kod procenjivanja parova sa mu{kom neplodno{}u i kod slu~ajeva idiopatskog steriliteta, kao i u utvr|ivanju modaliteta asistirane reprodukcije koji mo`e biti optimalno primenjen u tretmanu datog para. Intracitoplazmi~na injekcija sperme sa testikularnim spermatozoidima je od dodatnog zna~aja, jer se danas sve ~e{}e primenjuje u praksi. Osim zrelih spermatozoida, testikularni uzorci ~esto sadr`e ostatke }elija i nepo`eljne }elije kao {to su nezreli spermatozoidi, okrugli spermatidi, spermatociti i spermatogonije, kao i somatske }elije, uklju~uju}i i nukleaze Sertolijevih }elija, crvena krvna zrnca, ostatke seminifernih tubula, citoplazmu okruglih spermatida i netaknute Sertolijeve i Leydigove }elije. Priprema testikularnih uzoraka je slo`enija od one koja se obavlja kod epididimalnih spermatozoida. Standardni metod za izbacivanje spermatozoida iz seminifernih tubula za kori{}enje u ICSI intra citoplasmatic sperm injection je priprema uzorka dobijenog biopsijom, razvla~enjem pomo}u igala ili staklenih slajdova. Spermatozoidi se dobijaju bilo iz otvorene biopsije ili putem punkcije iglom.
196
Modifikacije ove tehnike su smek{avanje, maceracija pomo}u mikro-mlinova, enzimski tretman ili tretiranje uzorka eritrocitnim lizing puferom - lysing buffer. Izme|u ove dve metode nema razlike {to se ti~e procenta oplodnje, razvoja embriona i implantacije. Uzorci sperme, tako|e, mogu biti dobijeni filtriranjem kroz filter od 40m radi uklanjanja }elijskih i tubularnih ostataka. U nekim embriolo{kim laboratorijama se razmotavanje pojedina~nih tubula posti`e forcepsom i kompresovanjem fragmenata tubula, po~ev od srednjeg dela ka krajevima. Uzorci testikularne sperme mogu dalje biti obra|ivani jednostavnim ispiranjem u medijumu ili neprekidnom centrifugom radi uklanjanja ostataka i dobijanja suspenzije testikularnih spermatozoida. Radi za{tite spermatozoida od potencijalne {tete uticaja ROS - reactive oxygen species-a, duplira se koncentracija serumskog albumina ili ceo serum za vreme pripreme spermatozoida. Ve}e koncentracije proteina ili seruma, tako|e, smanjuju mogu}nost prijanjanja spermatozoida za ICSI - intra citoplasmatic sperm injection iglu tokom rada. Pribli`no polovina testikularnih spermatozoida ne pokazuje pokretljivost u vreme pripreme, ali se i nepokretni spermatozoidi mogu upotrebiti za ICSI - intra citoplasmatic sperm injection po{to imaju isti potencijal za oplodnju kao i pokretni spermatozoidi, posle pribli`no 4 sata kultivacije. Kada se testikualarni uzorak stavi u kulturu, udeo pokretnih spermatozoida je obi~no najve}i, 91% posle 24 ~asa od inkubacije. Zbog toga se biopsija zakazuje jedan dan pre punkcije i dobijanja jajnih }elija. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection sa testikularnim spermatozoidima je sli~na sa ICSI - intra citoplasmatic sperm injection
sa ejakuliranim spematozoidima. Posle izdvajanja morfolo{ki normalih i pokretnih spermatozoida spermatozoidi se imobili{u u PVP - polyvinyl pyrrolidone i ubacuju se u oocit. Iako su kondenzacija hromatina i nuklearno sazrevanje nedovr{eni kod testikularnih spermatozoida, rezultat oplodnje sa testikularnim spermatozoidima je sli~an ishodu ICSI - intra citoplasmatic sperm injection sa ejakularnim spermatozoidima. TESE - testicular sperm extraction u kombinaciji sa ICSI - intra citoplasmatic sperm injection je metod izbora u slu~ajevima mu{ke neplodnosti sa opstruktivnom ili neopstruktivnom azoospermijom. Procenat dobijanja spermatozoida kod mu{karaca sa neopstruktivnom azoospermijom se kre}e od 40% do 70%. Postoji direktna korelacija izme|u mogu}nosti dobijanja testikularnih spermatozoida i histopatologije testisa. U pore|enju sa sindromom samo Sertolijevih }elija, Sertoly cell syndrom, {anse za uspe{no nala`enje spermatozoida su bile 44,3 puta ve}e kod slu~ajeva ozbiljne hipospermatogeneze i 8,4 puta ve}e kod mu{karaca sa zastojem sazrevanja. Mogu}nost dobijanja spermatozoida kod azoospermi~nih pacijenata je u direktnoj vezi sa etiologijom poreme}aja. Kada je testikularna histologija normalna, kao kod mu{karaca sa opstruktivnom azoospermijom ili hipoplazijom germinativnih }elija, dobijanje spermatozoida je skoro uvek uspe{no. Kod mu{karaca sa aplazijom germinativnih }elija ili zastojem u spermatogenezi, rezultat je nepredvidljiv i promenljiv. [to se ti~e mu{karaca sa neopstruktivnom i opstruktivnom azoospermijom, podaci koji se odnose na kvalitet i kvantitet spermatozoida su kontraverzni. Nekoliko izve{taja opisuje zna~ajno smanjenje uspe{nih oplodnji i trudno}a u
197
slu~ajevima neopstruktivne azoospermije. Dokazan je manji broj implantacija posle ICSI - intra citoplasmatic sperm injection sa testikularnim spermatozoidima kod neopstruktivne azoospermije u pore|enju sa odgovaraju}om kontrolnom grupom sa ejakularnim spermatozoidima i u slu~ajevima sa opstruktivnom azoospermijom uz normalnu spermatogenezu. Broj trudno}a po broju transfera embriona je zna~ajno smanjen kod pacijenata kod kojih su kori{}eni ejakulirani 21% ili epididimalni 22% spermatozoidi za ICSI - intra citoplasmatic sperm injection {to je u suprotnosti sa nalazima opisanim u drugim izve{tajima koji pokazuju ni`i broj oplodnji kod slu~ajeva neopstruktivne azoospermije. Bez obzira na smanjenu fertilizaciju kod ovih slu~ajeva, broj trudno}a se nije promenio. Postoji jasna korelacija izme|u broja dobijenih spermatozoida i oplodnje u slu~ajevima neopstruktivne azoospermije. Na procenat oplo|enih oocita, tako|e, mogu uticati razni tipovi spermatogenetskih defekata prisutnih u neopstruktivnoj grupi. U slu~ajevima ozbiljnih spermatogenetskih defekata, kao {to je sindrom Sertoly cell only, ozbiljna hipospermatogeneza ili zastoji u sazrevanju mogu se pojaviti spermatozoidi koji nisu zavr{ili citoplazmatsko sazrevanje. Pretpostavlja se da zastoj sazrevanja i aplazija germinativnih }elija imaju genetsko poreklo. Genetski faktori bi, tako|e, mogli objasniti i smanjenje fertilizacije. U nekim studijama je potvr|eno ~e{}e pojavljivanje hromozomskih abnormalnosti, od kojih je preovla|uju}a aneuploidija polnog hromozoma, kod spermatozoida mu{karaca sa neopstruktivnom azoospermijom. Ovi podaci ilustruju va`nost razmatranja potencijalnih genetskih rizika. Jedan od na~ina minimizacije broja hirur{kih procedura na testisu je krioprez-
ervacija biopsiranog testikularnog tkiva i spermatozoida koji nisu iskori{}eni u ICSI - intra citoplasmatic sperm injection ciklusu. Ako ne do|e do trudno}e posle ICSI intra citoplasmatic sperm injection sa sve`im testikularnim spermatozoidima, odmrznuti spermatozoidi mogu biti upotrebljeni u kasnijim ciklusima. ^ak, i u slu~ajevima dijagnosti~ke testikularne biopsije, krioprezervacija testikularnih spermatozoida elimini{e potrebu za drugom biopsijom, {to je od naro~ite koristi pacijentima sa neopstruktivnom azoospermijom i malim testisima. Dijagnosti~kim testikularnim biopsijama treba dati prednost i treba da se planiraju pre po~etka tretmana stimulacije ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. Ukoliko je biopsija negativna, druga opcija je upotreba donorske sperme.
1.6. FERTILIZACIJA
U fazi fertilizacije, zavisno od broja spermatozoida i njihove pokretljivosti, odlu~ujemo se za primenu standardnog programa IVF - in vitro fertilisation, ili metode ICSI - intra citoplasmatic sperm injection.
Sl. 4.22- Zigot: dva pronukleusa u centru, polarno telo na 1 sat, ovarijalne kumulusne }elije okolo
198
Zreli preovulatorni oocit se obi~no inkubira 2-8 ~asova pre oplodnje. U nekim slu~ajevima se nezreli oociti inkubiraju i do 36 ~asova pre inseminacije, da bi se omogu}ilo sazrevanje. Svaki oocit se inseminira zavisno od kvaliteta sperme sa 50.000 - 200.000 pokretnih spermatozoida po oocitu. Spermatozoidi i oociti se koinkubiraju 12 do 18 ~asova u bioinkubatoru. Oociti se potom pregledaju u smislu prisustva pronukleusa kao dokaza oplodnje i ekstruzije drugog polarnog tela. Va`no je obratiti pa`nju na eventualnu polispermi~nu fertilizaciju koju karakteri{e prisustvo vi{e od dva pronukleusa.
Pojava polispermije kod konvencionalne IVF-in vitro fertilizacije se sre}e u oko 10% slu~ajeva.
Poliploidni embrion kasnije mo`e da se deli, te identifikacija anomalije mo`e pro}i nezapa`eno, ukoliko se ne registruje u fazi pronukleusa.
Fragmentacija blastomera je jo{ jedna zagonetka u ranoj humanoj embriogenezi. In vitro fertilisani embrioni ~esto pokazuju abnormalnu ili odlo`enu deobu }elija, pra}enu }elijskom fragmentacijom ili razvojnim arestom.
199
Pojava fragmentacije u IVF - in vitro fertilisation proceduri name}e pitanje da li je ovaj fenomen indikativan za nekvalitetan embrion, ili je fragmentacija normalan proces koji je vezan sa ranu embriogenezu, odnosno, da je to artefakt vezan za suboptimalne uslove in vitro kulture. Fragmentisani embrioni obi~no sadr`e blastomere razli~ite veli~ine.
U najve}em broju slu~ajeva ovi anuklearni }elijski fragmenti sadr`e }elijske organele i druge }elijske proteine. Veli~ina blastomere je obi~no smanjena stepenom fragmentacije i sa umanjenjem }elijskog sadr`aja pokazuju}i negativan efekat na budu}u masu embriona. Fragmentacija mo`e da predstavlja osnovnu razvojnu sposobnost embriona za samokorekciju eliminacijom defektnih }elija u toku ranog razvoja ili samodestrukciju, ako se prepozna postojanje letalnog defekta koji obuhvata neke ili sve blastomere. Novije studije podr`avaju hipotezu da celularna fragmentacija koju sre}emo kod preimplantacionih embriona mo`e da bude regulisana odre|enim komponentama genetskog programa smrti }elije, apoptoze. Formacija fragmenata mo`e da bude meha-
nizam putem kojeg se apoptoti~ni genski produkti uklanjaju iz embriona u cilju ~uvanja embriona od {tetnih efekata poreme}aja balansa pro i anti apoptoti~kih genskih produkata. Sama fragmentacija ne mora da bude letalna, budu}i da u nekim uslovima fragmenti mogu da budu resorbovani i njihovo prisustvo ne mora da ugro`ava dalji razvoj embriona. Ukoliko se poku{aj eliminacije poka`e neuspe{nim, embrion podle`e arestu. Dokazano je da fragmentacija mo`e biti izazvana i neadekvatnim in vitro uslovima kulture embriona. Name}e se pitanje da li se ovaj proces odigrava i u toku rane embriogeneze in vivo. Bez obzira da o fragmentaciji obi~no govorimo u ranim fazama deobe, ona se tako|e, mada u veoma niskom procentu, javlja i kod oocita, odnosno embriona u stadijumu pronukleusa. Mehani~ko uklanjanje fragmenata zna~ajno pobolj{ava procenat implantacije, sugeri{u}i da je sposobnost pove}ane implantacije izra`ena fragmentisano{}u embriona zbog ponovnog uspostavljanja normalnog, od stadijuma zavisnog, prostornog odnosa izme|u blastomera, koji je neophodan za kompaktnost i od eliminacije potencijalno toksi~nog uticaja koji se ispoljava u toku degeneracije ekstracelularnih fragmenata. Ova metoda ne poma`e u slu~ajevima kada fragmenti obuhvataju vi{e od 30% ukupnog volumena embriona, budu}i da ovakvi embrioni nastavljaju sa fragmentacijom i nakon tretmana. Mogu}e je da je fragmentacija normalni mehanizam u razvoju embriona i da je lokalizacija, odnosno, obim fragmentacije faktor koji negativno uti~e na razvojni potencijal embriona. Jedan od mehanizama nastanka fragmenata je i proces onkoze.
200
Isto tako {irok spektar celularnih defekata kao {to je redistribucija mitohondrija ili abnormalna sublokalizacija nekih proteina, mo`e da bude uzrok razvojnog aresta. Kvalitet embriona, odnosno progresija fertilisanog oocita u toku deljenja, formiranje blastociste kao i implantacija, uveliko zavisi od specifi~nih genetskih i razvojnih programa. Jasno je da kvalitet oocita kao i depozicija maj~inih produkata u formi translatovanih proteina i organela, tako|e, uti~u na kvalitet embrionalnog razvoja. Poznato je da je rani razvoj embriona zavistan od citoplazmatskih komponenata, a ne od novoformiranog nukleusa.
Sl. 4.27- Oncosis
Ovu formu smrti }elije karakteri{e stvaranje citoplazmatskih formacija bez organela koje mogu da budu resorbovane od strane }elije i oslobo|ene u uslovima hipoksije. Kako se embrioni kultivi{u u sredini bogatoj kiseonikom pretpostavlja se da se de{avaju sli~ne morfolo{ke promene u blastomerama koje nemaju mitohondrijalni potencijal sposoban da zadovolji energetske zahteve.
Klasifikacija stepena fragmentacije embriona je zavisna od protokola koji se koriste u IVF - in vitro fertilisation laboratorijama, a numeri~ka gradacija je od 1 do 4, ili gradacija upotrebom slova od A do D, koja predstavlja stepen fragmentacije.
Tabela 4-3: Klasifikacija stepena fragmentacije embriona
0% -5% fragmentacija gde je fragmentacija zastupljena do 20% gde je fragmentacija zastupljena od 21% - 50% gde je fragmentacija zastupljena vi{e od 50%
Razvojni arest embriona je slede}i fenomen zapa`en u razvoju embriona. Mehanizam koji dovodi do ove pojave je nejasan, mada je interesantno da razvojni stadijum embriona na kome se prvi put detektuju proteini zavisni od transkripcije koincidira sa pikom incidence aresta deljenja, ukazuju}i da razvojni arest mo`e da bude uzrokovan poreme}ajem procesa transkripcije. Jedan od uzroka razvojnog aresta mogu da budu hromozomske anomalije koje doprinose poreme}aju sinteze informacione RNK, RNK - messenger ribonucleic acid, onemogu}uju}i sintezu proteina i uti~u}i na razvoj embriona.
201
Tip C fragmentacije predstavlja embrione kod kojih je 21 - 50% }elije fragmentirano. Na slici je ~etvoro}elijski embrion.
Kod tipa D fragmentacija zauzima vi{e od 50% }elije. Na slici je prikazan dvo}elijski embrion.
Stepen fragmentacije B podrazumeva prisustvo }elijske fragmentacije do 20%. Na slici je ~etvoro}elijski embrion.
Sl. 4.32- Dvo}elijski embrion tip D fragmentacije
Kultivacija embriona do stadijuma blastociste imala je za cilj selekciju najkvalitetnijih embriona, uz smanjenje broja transferiranih embriona, bez kompromitovanja procenta implantacije.
Klasifikacija blastociste je dvojaka: podela embriona koja se bazira na kvalitetu same blastociste i gradacija u odnosu na kvalitet inner cell mass i trophoectoderma.
202
Prolongirana kultivacija embriona do stadijuma blastociste omogu}ava dalju selekciju embriona. Embrioni u stadijumu blastociste se dele po svom kvalitetu na ~etiri grupe obele`ene slovima od A do D na slede}i na~in: Stadijum A: Blastocista sa po~etnom kavitacijom.
Stadijum B: Blastocela koja ~ini maksimalno 50% volumena embriona sa ili bez unutra{nje }elijske mase ICM - inner cell mass.
Sl. 4.36- Stadijum D blastociste
Uz ovu podelu po kvalitetu blastocista, mo`e se uraditi i gradacija u odnosu na kvalitet inner cell mass i trophoectoderma, te se na osnovu toga blastociste mogu podeliti u tri grupe:
Dobrog kvaliteta: veliki broj }elija sa dobrom me|u}elijskom adhezijom; Srednjeg kvaliteta: mali broj }elija sa slabim adherentnim vezama
Sl. 4.34- Stadijum B blastociste
Stadijum C: Blastocela zauzima najve}i deo blastociste sa ili bez ICM - inner cell mass.
Slabog kvaliteta: nema vidljive inner cell mass, ve} su prisutne retke granulirane, degenerativne }elije trophoectoderma ili trophoblasta.
203
Sl. 4.37- Blastocista dobrog kvaliteta ICM - inner cell mass; C - {upljina blastociste; T - trophoblast
^ini se da gubitak uniformnosti i istanjivanje zona pellucida prethodi in vivo hatching-u. Pokazalo se da se stepen implantacije menjao od 10 do 29% kod embriona zavisno od kvaliteta zona pellucida od uniformne i zadebljale, nasuprot embriona sa nepravilnom i tankom. U nekim studijama je utvr|eno da izlaganje embriona in vitro okru`enju mo`e rezultovati o~vr{}avanjem zona pellucida koja postaje otporna na istanjivanje sa kasnijim {tetnim uticajem na proces hatching-a. Iako je te{ko proceniti i kvantifikovati tvrdo}u zona pellucida, njena debljina se mo`e izmeriti pod invertnim mikroskopom. Smatra se da kod oko 15% IVF - in vitro fertilisation embriona postoji zona pellucida deblja od 15m. U toj grupi je pobolj{an stepen implantacije primenom asistiranog hatching-a zona pellucida kiselim Tyrode medijumom. Metod je definisan kao AH - assisted hatching. U mnogobrojnim studijama koje su usledile od po~etka primene ove metode rezultati su bili promenljivi zbog razli~itih koncepcija, kriterijuma odabira pacijenata i tehnika asistiranog hatching-a. Tokom godina je usavr{eno nekoliko tehnika.
204
Mehani~ki asistirani hatching ili parcijalna disekcija zona pellucida-e se danas re|e primenjuje.
Sl. 4.41- Asistirani hatching kiselim Tyrode rastvorom Sl. 4.40- Mehani~ki asistirani hatching
Parcijalna disekcija zona pellucida-e se obavlja na embrionu pozicioniranim holding pipetom mikroiglom kroz zona pellucida-u na mestu najve}eg perivitelinskog prostora. Embrioni se potom vra}aju u medijum kulture i kultivi{u do transfera. Asistirani hatching je zapo~et parcijalnom resekcijom zone pelucide. Ova metoda je temeljno procenjena u vi{e studija. Osnovno ograni~enje ove tehnike je te{ko}a stvaranja rupe odre|ene veli~ine.
Niska snaga se koristi za perforiranje veoma tanke zona pellucida-e do 10m, srednja snaga se koristi za perforaciju zona pellucida-e ve}ine embriona 10 - 15m, a najve}a snaga se koristi za perforiranje debele, preko 15m zona pellucida-e. Infracrvena laserska dioda talasne du`ine 1.48 m se ~ini najpogodnijom za upotrebu u laboratoriji. Ovaj sistem dozvoljava
205
bezkontaktni mikroskopski pristup laserskog snopa do embriona uz minimalnu absorpciju od strane medijuma. Laserski hatching je predlo`en kao metoda koja se lak{e ponavlja, kontroli{e i koja je tehni~ki lak{a u pore|enju sa mehani~kim i hemijskim sredstvima. Ne postoji op{ta saglasnost u radovima u vezi sa efikasno{}u asistiranog hatching-a. U studijama su dati opre~ni rezultati. Promenljivi kriterijumi selekcije pacijenata i razli~ite metodologije rada ote`avaju interpretiranje podataka. Postoje slaganja u izve{tajima da je proces asistiranog hatching-a dao pozitivne rezultate kod pacijenata sa lo{om morfologijom embriona, kod pacijenata sa povi{enim nivoom FSH - follicle stimulating i kod pacijata sa embrionima koji su imali deblju zona pellucida. Stepen implantacije nije zna~ajno pobolj{an kod pacijenata sa normalnim bazalnim nivoom FSH - follicle stimulating hormone. Ameri~ko dru{tvo reproduktivne medicine je zauzelo stav da asistiran hatching mo`e biti klini~ki koristan kod odre|enih pacijenata, a da rutinsko ili univerzalno obavljanje u tretmanu svih IVF - in vitro fertilisation pacijenata u ovom trenutku se ~ini neopravdanim. Videokinematografska procena varijacija debljine zona pellucida ZPTV - zona pellucida thickness variation je u korelaciji sa procentima uspe{nosti. Srednja vrednost ZPTV - zona pellucida thickness je iznosila 28.6 kod neimplantiranih embriona u odnosu na 17.9 kod implantiranih embriona. Upore|ivanjem razli~itih tehnika asistiranog hatching-a pokazalo se da ne postoji razlika u procentu uspe{nih trudno}a. Potencijalne komplikacije primene asistiranog hatchinga, kao {to su degeneracija embriona i pojava monozigotskih blizanaca,
moraju biti pa`ljivo procenjene i upore|ene. Velika frekventnost vi{estrukih trudno}a zahteva obazrivost kod broja transferiranih embriona. Trebalo bi pomenuti i metodu uklanjanja zone pelucide pronazom sa idejom pobolj{anja procenta implantacije embriona. Koristi se razre|eniji rastvor pronaze 10IU/ml koji se razredi 10 X u medijumu. Embrioni se prebacuju u rastvor pronaze u medijumu pod uljem tokom pribli`no 60 sec. za inicijalno rastvaranje i potom se prebacuju u sve`i medijum i isperu. Enzimati~ne metode rastvaranja i uklanjanja zona pellucida su najkasnije primenjene. Rastvor pronaze se koristi da ukloni zona pellucida-u po obimu. Bezbednost metode je potvr|ena u nekoliko studija.
206
kiselinom. Ve}ina }elijske DNK - deoksiribonukleinske kiseline je inkapsulirana u jedru, manji deo nalazi se i u mitohondrijama. Ukupni humani genom ~ini oko 3 milijarde baznih parova, ili parova nukleotida u DNK - deoksiribonukleinskoj kiselini, sme{tenih na 22 para autozomnih hromozoma ili autozoma i jednom paru polnih hromozoma u svim somatskim }elijama. Tripleti nukleotida na DNK, razli~ite kombinacije tri azotne baze, predstavljaju geneti~ku {ifru ili kod, od koje zavisi aminokiselinski sastav proteina. Specifi~an aminokiselinski sastav odredi}e biolo{ku funkciju proteina, bilo da se radi o njihovoj ulozi u izgradnji }elijskih elemenata ili o funkciji u regulisanju slo`enog dinamizma u }eliji. Geneti~ki kod je bio potpuno de{ifrovan 1967. godine. Celokupan humani genom je de{ifrovan 2000. godine. Dve individue koje imaju isti broj gena mogu se zna~ajno razlikovati u nukleotidnom sastavu DNK molekula i razlike u nukleotidnom sastavu mogu iznositi i do 10% od ukupnog boja nukleotida. Fizi~ka razlika izme|u ljudi i svih drugih `ivotinja nije vezana za promenu u univerzalnom genetskom kodu, ili u univerzalnoj komponenti DNK - deoksiribonukleinske kiseline, ili u univerzalnih 20 amino kiselina. Ona je jedino vezana za redosled nukleotida na datom hromozomu. Jedna jedina gre{ka u redosledu amino kiseline u nekom proteinu mo`e da dovede do dramati~nih promena u njegovoj strukturi, a onda i do ozbiljnih zdravstvenih implikacija. Ve}ina genetskih bolesti su prouzrokovane malim tipografskim gre{kama koje sa~injava genetski kod sa~injen od ~etiri osnovna nukleotida. Mi{i}na distrofija je ili prouzrokovana malom delecijom od nekoliko nukleotida u genu za mi{i}nu distrofiju na hromozomu X, ili u jednoj drugoj varijanti,
sa ne{to ve}im defektom, u kome su iste baze ponovljene nekoliko stotina puta na hromozomu 19 umesto samo deset do pedeset puta u normalnim slu~ajevima. To zna~i da od 6 milijardi nukleotida na DNK, koliko postoji u somatskim }elijama, poreme}aj samo stotinak izaziva te{ko obolenje. Zbog navedenih razloga nakon vi{egodi{nje primene asistirane reproduktivne tehnologije sa pove}anjem primene iz godine u godinu, postajemo svesni i rizika koji prate svakodnevnu klini~ku primenu. Tako u zna~aju posebno mesto dobija procedura PGD - preimplantation genetic diagnosis. PGD - preimplantation genetic diagnosis se primenjuje kod nosioca specifi~nih genetskih defekata, polnih poreme}aja ili hromozomskih poreme}aja. PGD - preimplantation genetic diagnosis procedura se sastoji od faza prikazanih u donjoj tabeli.
Tabela 4-4: Procedura preimplantacione genetske dijagnostike
Centar za medicinsku genetiku Dijagnoza Savetovanje: - geneti~ari - tok le~enja genetska dijagnoza FISH PCR
IVF-ICSI
Biopsija embriona
Transfer embriona Ako se posle genetskog savetovanja o prednostima i nedostacima PGD - preimplantation
207
genetic diagnosis, nasuprot prenatalnoj dijagnozi, bra~ni par odlu~i za PGD preimplantation genetic diagnosis, onda se upu}uje na dalju evaluaciju koja se sastoji od reproduktivne anamneze para, ginekolo{kog pregleda `ene, ispitivanja krvi `ene, uklju~uju}i i proveru estradiola, LH luteinizing hormone-a i FSH - follicle stimulating hormone-a. Pregled na infektivne bolesti ponekad kompletira ovu procenu. Kod nekih klinika, odre|ivanje kariotipa oba partnera spada u standardne procedure, ~ak i kada se FISH - fluorescence in situ hybridization ne koristi u preimplantacionoj genetskoj dijagnozi. Dodatni testovi se obavljaju prema potrebi. Kod skoro svih centara biopsija embriona za PGD - preimplantation genetic diagnosis se obavlja tre}eg dana ranog razvoja embriona.
spermatozoida koji mo`e biti zaka~en za zonu pelucidu. Tre}eg dana posle oplodnje se vr{i biopsija jedne ili dve blastomere iz embriona koji su dostigli osmo}elijski stadijum. ]elije se analiziraju putem FISH - fluorescence in situ hybridization, ili se ekstrahuje DNK - deoksiribonukleinska kiselina iz koje se multiplikuju PCR metodom, polymerase chain reaction, odre|eni delovi, da bi se kasnije analizirali.
Sl. 4.44- FISH - fluorescence in situ hybridization Trizomija 21 - Down - ov sindrom prisustvo tri plavo obojena hromozoma
Da bi se dobili embrioni u ovoj ranoj fazi razvoja, neophodna je IVF - in vitro fertilisation, sa ili bez ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. Radije se koristi tehnika ICSI - intra citoplasmatic sperm injection umesto konvencionalne IVF - in vitro fertilisation kod monogenih poreme}aja koji zahtevaju DNK dijagnozu baziranu na PCR - polymerase chain reaction u cilju spre~avanja kontaminacije od strane
Iako je ova druga tehnika te`a, metod detekcije na nivou jedne }elije je u principu isti kao i metode primenjene na ostala tkiva za prenatalnu dijagnozu, mada rad sa blastomerama ima specifi~ne te{ko}e, uklju~uju}i lizu, multinukleaciju i ispadanje alela kada se jedan od dva alela koji se ispituju multiplicira. I drugi dijagnosti~ki problemi se mogu pojaviti zbog embrionske mozai~nosti. Kontaminacija DNK - deoksiribonukleinske kiseline od strane }elija sperme zaka~enih za zona pellucida-u posle IVF - in vitro fertilisation se mo`e prevazi}i pomo}u ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. Neki centri savetuju pregled dve }elije. Samo kod embriona sa usagla{enim rezul-
208
tatima radi se embriotransfer ili krioprezervacija. Vrlo ~esto se bra~nim parovima savetuje da obave i prenatalnu dijagnozu putem horiocenteze, CVS - chorionic villus sampling, ili amniocenteze.
Hromozomski poreme}aji se mogu podeliti na dve grupe: strukturne i numeri~ke abnormalnosti. Recipro~na translokacija je jo{ uvek najva`nija abnormalnost u prvoj grupi. Svi ovi slu~ajevi imaju sporadi~nu prirodu osim recipro~ne translokacije (11; 22) za koju se zna da se ponavlja. Recipro~nih translokacija ima ~etiri puta vi{e od Robertsonovih translokacija. Inverzije i delecije su razlozi za savetovanje kod manje od 1% slu~ajeva. Pregled na aneuploidnost se obavlja iz razli~itih razloga: starosti majke, ponovljeni neuspeh IVF - in vitro fertilisation, neuspeh implantacije, ponovljeni spontani abortus ili kombinacija ovih razloga.
U~estalost monogenskih poreme}aja se neznatno promenila u odnosu na prethodne godine. Postoji relativno pove}anje dominantnih poreme}aja i smanjenje bolesti vezanih za X hromozom. Tri glavna poreme}aja u svakoj grupi su konstantni tokom godina: cisti~na fibroza, talasemija i spiralna muskularna atrofija kao autozomne recesivne bolesti; miotoni~ka distrofija, Hantingtonova bolest i CharcotMarie-Tooth bolest kao autozomne dominante; Duchenne-ova muskularna distrofija, fragilni-X sindrom i hemofilija kao poreme}aji vezani za X hromozom.
Tabela 4-5: Genska oboljenja koja se mogu diagnostikvati PGD-om:
Prema najnovijim podacima prikupljenim od strane ESHRE - european society for human reproduction and embryology, od ukupnog broja pregledanih pacijenata sa razli~itim indikacijama, oko 25% parova ima jedno ili vi{e bolesne dece, dok je i ve}i procenat parova imao spontane abortuse ili prekide trudno}a posle prenatalne dijagnoze. Genetski rizik je jo{ uvek najva`niji razlog za PGD - preimplantation genetic diagnosis. Pribli`no jednoj ~etvrtini parova je potreban tretman asistirane reprodukcije i oni `ele da ga kombinuju sa PGD - preimplantation genetic diagnosis. Ostali razlozi za PGD - preimplantation genetic diagnosis su bili ponovljeni spontani abortusi. Ove indikacije se mogu podeliti na dve velike grupe: hromozomske aberacije i monogenske bolesti. Oboljenja izazvana mutacijama mitohondrijske DNK indikovana su u manje od 0.5% slu~ajeva.
Adrenoleukodystrophy Alpha-1-Antitrypsin Alpha Thalassemia Alport Disease Alzheimer's disease Becker muscular dystrophy Beta Thalassemia Charcot Marie Tooth
209
Chromosomal aneuploidies by FISH Chromosomal translocations Cystic Fibrosis Duchenne muscular dystrophy Dystonia Epidermolysis Bullosa Fanconi Anemia Familial adenomatous polyposis (FAP) Familial dysautonomia Fragile-X syndrome Gaucher's Disease Hemophilia A HLA typing HSNF5 mutations Huntington disease Hurler syndrome Kell disease Lesch Nyhan Syndrome Long Chain Acyl-Co A Dehydrogenase (LCHAD) deficiency Multiple Epiphysial Dysplasia Myotonic Dystrophy Myotubular myopathy Neurofibromatosis type I Neurofibromatosis type II Osteogenesis imperfecta OTC Deficiency P53 Oncogene Phenylketonuria Polycystic kidney disease (Autosomal Dominant types I and II) Retinitis Pigmentosa SCA 6 Sickle Cell Disease Sonic hedgehog mutations Tay-Sachs Disease Translocations by FISH Tuberous sclerosis X linked Disease by sexing X-linked hydrocephalus X-linked hyper IgM syndrome
Biopsija je uspe{na kod oko 95% slu~ajeva, a dijagnoza dobijena kod oko 85% biopsiranih blastomera. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnika oplodnje je kori{}ena kod ve}ine slu~ajeva.
PGD - AS - preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening su novije metode. Uvedene su nove tehnike, jer upotreba sekvencijalnih medija omogu}ava razvoj do stadijuma blastociste i analiziranje statusa nekoliko hromozoma pre transfera. Postoji podela mi{ljenja da li treba razlikovati PGD - preimplantation genetic diagnosis za nasle|ene genetske bolesti i za detekciju sporadi~nih hromozomskih abnormalnosti radi pobolj{anja uspe{nosti ART - assisted reproductive technology. Ovo je razlog za{to je ova druga procedura odre|ena kao PGD - AS - preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening od strane ESHRE - european society for human reproduction and embryology. Poznato je da se aneuploidnost pove}ava sa staro{}u majke i da je u uzajamnoj vezi sa smanjenom implantacijom i ve}im brojem spontanih abortusa. [to se ti~e kona~ne procene PGD-ASpreimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening, jo{ uvek postoji puno sumnji. Iako je izlo`eno nekoliko indikacija, postoji nedostatak nau~nih dokaza koji bi bio potvr|en prospektivnim studijama. Pored indikacije starosti majke, predlo`eni su i drugi razlozi, kao ponovljeni poba~aji, vi{e neuspelih implantacija i neopstruktivne azoospermije. Do sada nije objavljena nijedna prospektivna studija - randomized controlled trial kod gore navedenih indikacija. PGD - preimplantation genetic diagnosis kod slu~ajeva pacijenata sa Klinefelter
210
sindromom kod kojih postoji fokalna spermatogeneza u testisu, mo`e se realizovati primenom tehnike ICSI - intra citoplasmatic sperm injection u kombinaciji sa PGD preimplantation genetic diagnosis. Objavljeni su slu~ajevi ro|enja zdrave dece.
Na snimku toka embriotransfera kateter se vidi u cerviksu i uterusnoj {upljini ispod `ute linije. Aplikuje se iz vagine u cerviks. Embrioni se osloba|aju iz vrha katetera {to se vidi neposredno desno od oznake L. Treba obratiti pa`nju da ugao izme|u cerviksa i uterusa, zelena linija, nije veliki.
1.10. EMBRIOTRANSFER
Izuzetno brz razvoj tehnika IVF - in vitro fertilisation rezultirao je pove}anjem procenta implantacija kao i pove}anjem procenta multiplih trudno}a, sa svim rizicima koje one sa sobom povla~e. Najva`niji faktor koji uti~e na stepen multiplih trudno}a je broj transferiranih embriona. Strategija koja podrazumeva transfer samo jednog embriona rezultira, uglavnom, trudno}ama sa jednim plodom, ali tako|e mo`e da dovede i do smanjenja sveukupnog procenta uspeha. U dosada{njim retrospektivnim studijama na|eno je da su jedine varijabile na osnovu kojih se mo`e predvideti eventualna multipla trudno}a, starosna dob majke i broj transferiranih embriona dobrog kvaliteta. Na osnovu istra`ivanja odre|en je cutoff limit u odnosu na starosnu dob pacijentkinje radi smanjenja multipnih trudno}a. ET - embryo transfer je procedura ubacivanja oplo|ene jajne celije u uterus.
Na tr`i{tu postoje kateteri za embrio transfer pod kontrolom ultrazvuka. Dana{nji stav je da nije potrebna ultrazvu~na kontrola embrio transfera.
Sl. 4.46- Sonografski prikaz embriotransfera: C cervix; B - vesica urinaria; L - uterusna {upljina; V - vagina
211
Po nekim autorima poja~ana sekrecija u uterusu mo`e biti {tetna za implantaciju i odr`avanje trudno}e. Uterinska te~nost se naj~e{}e vi|a pomo}u ultrazvuka nakon oplodnje. Ova te~nost se samostalno smanjuje u roku od 24 - 48 ~asova. U nekim radovima opisan je postupak intramuskularnog davanja oksitocina pre embriotransfera. Istra`ivanje je pokazalo da vi{e doze oksitocina rezultuju univerzalnom kontrakcijom glatkog mi{i}a, dok ni`e doze rezultuju metaboli~kim kontrakcijama koje po~inju u distalnom delu i nastavljaju se kaudalno, {to rezultuje kompletnijom i sistemati~nijom evakuacijom te~nosti. U daljim istra`ivanjima neophodno je proveriti ispravnost dosada{njih radova.
Potreba za luteal support, podr{kom lutealne faze, prouzrokovana je, s jedne strane, aspiracijom granuloznih }elija u toku punkcije folikula, odnosno, blokadom sekrecije LH - luteinizing hormone-a, upotrebom GnRH - gonadotropin releasing hormon agonista. Ova blokada traje najmanje deset dana nakon prestanka primene GnRH - gonadotropin releasing hormona, {to ima za posledicu poreme}aj sekrecije progesterona od strane corpus luteuma. Ovo uti~e na odnos estrogen - progesteron, {to mo`e da inhibira implantaciju embriona. Razli~ita su mi{ljenja koji tip luteal supporta je najadekvatniji u IVF - in vitro fertilisation ciklusima. Najpre je primenjivan parenteralni progesteron u ulju, zatim oralni, vaginalni progesteron ili HCG - human chorionic gonadotropin koji se ne primenjuje kod high responder - a zbog rizika od OHSS ovarian hyperstimulation syndrome-a. Progesteron primenjen vaginalno predstavlja metodu izbora, jer se izbegavaju bolne i zahtevne intramuskularne injekcije. Diskrepancija izme|u endometrijalnih efekata i relativno niske koncentracije serumskog progesterona nastaje kao posledica lokalnog direktnog transporta ili funkcionalnog portal sistema iz vagine u uterus. Razli~iti mehanizmi mogu da objasne direktni vagina - uterus transport i delovanje terapije, uklju~uju}i difuziju kroz tkivo, intraluminalnu transcervikalnu pasa`u i transport kroz venozni ili limfati~ni cirkulatorni sistem. Druga mogu}nost je olak{ana difuzija sa protiv strujnim arterijsko - venskim izmenama u kojima progesteron difunduje iz utero - vaginalnih limfnih sudova ili vena, u uterusni arterijalni sistem. Krvni sudovi dele zajedni~ku, izmenjiva~ku povr{inu i
212
imaju tok koji ide u suprotnim smerovima. Substance u visokim koncentracijama u venskim i limfnim sudovima mogu da difunduju u obli`nje arterije, gde }e njihova koncentracija rasti iznad one u organima. Vi{a je koncentracija progesterona u uterusnoj arterijalnoj krvi u pore|enju sa perifernom cirkulacijom. Radijalna arterija nakon vaginalne primene progesterona sna`no podr`ava ovaj mehanizam. Brojni su primeri u oganizmu protivstrujne izmene, u bubrezima Henleova petlja ili izmena toplote u sinusu cavernosus-u izme|u karotida i venske drena`e u nazofaringealnoj arei.
Postojanje lokalnog vagina - uterus transportnog sistema name}e pitanje njegovog fiziolo{kog zna~aja. Razumno je pretpostaviti da je primarna funkcija transport prostaglandina prisutnih u spermi. Oni }e aktivirati kontraktilnost uterusa u smislu olak{avanja transporta sperme bez podizanja nivoa prostaglandina u cirkulaciji, izbegavaju}i uzgredne efekte. Ovaj na~in primene lekova, koji je poznat kao first uterine pass effect, potvr|en primenom progesterona, otvorio je put za budu}u upotrebu lekova vaginalnim putem.
213
2. ARTEFICIJALNA INSEMINACIJA
Na odluku koju metodu asistirane reprodukcije primeniti uti~e rezultat analize sperme i drugih mu{kih i `enskih faktora kao {to je prisustvo ovulatornih defekata, endometrioze, tubarnih faktora, endokrine disfunkcije ili abnormalnosti, antispermatozoidnih antitela, itd. Kod bra~nog para sa normalnim nalazom kod `ene i redovnim ovulatornim ciklusima i subfertilnim mu{karcem po~etak terapije mo`e da bude planirani odnos u bar tri ciklusa sa ili bez ovarijalne stimulacije i pra}enjem ovulacije. Broj poku{aja je naj~e{}e limitiran na tri ciklusa. Kod neuspe{nog tretmana slede}i korak je arteficijalna inseminacija, ukoliko je kvalitet sperme odgovaraju}i. Potrebno je oko 5 miliona pokretnih spermatozoida IMC - inseminating motile count morfolo{ki ispravnih. Mnoge studije izve{tavaju o zna~ajnom padu uspe{nosti posle tre}eg poku{aja IUI intrauterine inseminacije, pa se savetuje drugi tretman, kao {to su IVF - in vitro fertilisation ili ICSI-intra citoplasmatic sperm injection. IUI - intrauterina inseminacija mo`e biti kori{}ena kao po~etni tretman kod ve}ine slu~ajeva umerene mu{ke subfertilnosti pre zapo~injanja IVF - in vitro fertilisation ili ICSI - intra citoplasmatic sperm injection, pod uslovom da se mo`e obezbediti neophodan minimum pokretnih spermatozoida. AI - arteficijalna inseminacija se mo`e razvrstati u nekoliko tehnika primene: - intravaginalna inseminacija IVI - intracervikalna inseminacija ICI - intrauterina inseminacija IUI - Fallopian tube sperm perfusion FSP - sperm intrafallopian insemination SIFI - direktna intraperitonealna inseminacija DIPI - intrafolikularna inseminacija IFI IUI - intrauterina je metoda koja se najvi{e koristi. Prednosti AI - arteficijalne inseminacije su mogu}nost selekcije pacijenata, primena kontrolisane ovarijalne stimulacije, monitoring ciklusa uz odre|ivanje individualne terapije (mogu}a primena i u nestimulisanom ciklusu), pripremanje sperme. Indikacije za primenu AI - arteficijalne inseminacije su: nemogu}nost vaginalne ejakulacije zbog: - psihogene ili organske impotencije, - hipospadije ili retrogradne ejakulacije, - krioprezervacija sperme u slu~ajevima malignih oboljenja; androgeni poremecaji: - oligospermia - astenospermia - teratospermia; idiopatski sterilitet; sterilitet uzrokovan cervikalnim faktorom; odsustvo partnera i kori{}enje krioprotektirane sperme.
214
Uobi~ajeni protokoli stimulacije u slu~ajevima AI - arteficijalne inseminacije su stimulacija clomiphen citratom ili analognim lekovima, kao i upotreba HMG - human menopausal gonadotrophin-a ili FSH - follicle stimulating hormone-a, kao i kombinacija ovih preparata. Naj~e{}e se koristi CC - klomifen citrat u koncentraciji od 50 do 100 mg tokom pet dana za ovarijalnu stimulaciju. Uobi~ajen na~in pra}enja rasta i razvoja folikula je ultrazvu~ni monitoring uz eventualno odre|ivanje nivoa E2, kao i merenje debljine i pra}enje strukture endometrijuma.
Inseminacija se uobi~ajeno radi izme|u 13. i 16. dana ciklusa. AI - arteficijalna inseminacija se ne radi ukoliko se registruje vi{e od 6 folikula ve}ih od 15 mm, bez obzira na nivo E2, ili ukoliko je nivo E2 ve}i od 1500 pg /ml. Sperma se za proces inseminacije priprema na nekoliko nacina: - jednostavnim pranjem sperme u medijumu, - swim up tehnikom, - separacijom sperme uz pomo} tzv. density gradienta. Svrha ovog procesiranja sperme je pove}anje koncentracije progresivno pokretnih i morfolo{ki normalnih spermatozoida uz mali volumen, kao i eliminacija seminalnih PG - prostaglandins, limfokina, citokina, raznih infektivnih agenasa i broja slobodnih oksigenih radikala.
Optimum ovarijalne stimulacije podrazumeva 2 - 4 folikula veli~ine 18 - 19 mm, nivo estradiola 150-250 pgm/ml po folikulu, sa trilaminarnim endometrijumom dijametra ve}eg od 9 mm.
Sl. 4.51- Sematski prikaz IUI - intrauterine inseminacije
Uobi~ajena IUI - intrauterina inseminacija se radi 36 do 48 sati nakon davanja HCG - human chorionic gonadotropin-a, a ukoliko se inseminacija radi dva puta, 12 48 sati nakon davanja HCG - human chorionic gonadotropin-a. Nakon IUI - intrauterine inseminacije se savetuje 10 minutni odmor, i seksualni odnosi posle 12 - 18 ~asova.
215
Luteal support je mogu} primenom Utrogestana, Cyclogesta ili eventualno HCG - human chorionic gonadotropin-a 1500 IU 3 ili 6 dana nakon prve doze. Ukoliko se IUI - intrauterina inseminacija vr{i zbog problema od strane mu{kog partnera, mogu}e je raditi i u uslovima nestimulisanog ciklusa. Analiziraju}i rezultate od ukupnog broja trudno}a do kojih do|e, 88% trudno}a se registruje u prva tri ciklusa, a 95% u okviru prva ~etiri poku{aja.
Glavne prednosti AI - arteficijalne inseminacije su da je to relativno jednostavna, neinvazivna metoda koja se mo`e ponavljati. Preporuke su da je indikovana kod `ena do 40 godina starosti. Zabele`eni su dobri rezultati u slu~ajevima idiopatskog steriliteta, kao i u slu~ajevima blagog ili umerenog poreme}aja kod mu{kog partnera. Neuspeh ove metode nakon 4 poku{aja predstavlja indikaciju za IVF - in vitro fertilisation.
216
Sl. 4.52- ICSI - intra citoplasmatic sperm injection holding pipetom fiksirani oocit
Injekciona pipeta se gura kroz zona pellucida-u i membranu oocita u citoplazmu sa prvim polarnim telom na poziciji 12 ili 6 sati.
217
Sl. 4.53- ICSI - intra citoplasmatic sperm injection injekciona igla u oocitu
Genetske ili citogenetske abnormalnosti dece dobijene primenom ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnikom su bile ispitivane u vi{egodi{njim istra`ivanjima. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metoda se mora pokazati bezbednom kao i produktivnom. Kod ICSI - intra citoplasmatic sperm injection je broj spontanih abortusa u blagom porastu kao i kod konvencionalne IVF - in vitro fertilisation u odnosu na spontane trudno}e. Analiziraju}i stru~nu literaturu dobija se prose~an broj spontanih poba~aja u visini od oko 15 %. Broj malformacija kod ro|enih beba se kre}e u odnosu od oko 1,5%. Te`ina beba na ro|enju i broj preranih poro|aja nakon ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metode je adekvatan onima kod konvencionalne IVF - in vitro fertilisation. Iz dosada{njih istra`ivanja su dobijeni podaci da je frekventnost de novo autozomnih poreme}aja 0,36% i de novo polnih hromozomnih abnormalnosti 0,83%. Oba ova rezultata su ve}a u odnosu na op{tu populaciju. Genetske ili citogenetske abnormalnosti dece iz ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metode mogu nastati kao rezultat
nasle|ivanja mutiranog gena ili hromozomske abnormalnosti; Y - delecija DAZ deleted in azoospermia homologog gena kod oligospermi~nih mu{karaca, cisti~na fibroza potomaka koja poti~e od mu{karaca sa kongenitalnim bilateralnim odsustvom vas deferensa CBAVD - congenital bilateral absence of the vas deferens i polne hromozomske abnormalnosti potomaka mu{karaca sa Kinefelterovim sindromom 47, XXY. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnika oplodnje premo{}uje ve}inu molekularnih i }elijskih procedura koje u~estvuju u penetraciji spermatozoida. Selekcija spermatozoida ne bi trebalo biti nasumi~na, moraju se uzeti u obzir pokretljivost, morfologija i ostali markeri normalnog rasta i razvoja. Ve}ina parova sa ozbiljnim oblikom mu{ke neplodnosti mo`e biti tretirana sa ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnikom. Potreban je spermatozoid koji sadr`i funkcionalan genom i centriolu. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection se, tako|e, mo`e primeniti i sa spermatozoidima iz epididimisa i testisa u slu~aju opstrukcije seminalnih sekretornih kanala, kao i azoospermije, ukoliko se mo`e dobiti dovoljan broj spermatozoida iz testikularnog tkiva. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection koja koristi ejakulirane spermatozoide, se mo`e primeniti, u prisustvu oligoastenoteratozoospermije u slu~ajevima sa ponovljenim neuspehom oplodnje posle konvencionalne IVF in vitro fertilisation, u prisustvu visoke koncentracije antispermatozoidnih antitela, kod pacijenata sa kancerom u remisiji kada se spermatozoidi krioprezerviraju pre hemoterapije i radioterapije i kod povreda ki~mene mo`dine, ejakulatornih poreme}aja, retrogradnom
218
ejakulacijom i kod pacijenata kod kojih su spermatozoidi sa~uvani pre vasektomije. Kod preimplantacione genetske dijagnoze na monogenetske bolesti je, tako|e, indicirana ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metoda mo`e biti primenjena sa spermatozoidima iz epididimisa u slu~ajevima opstruktivne azoospermije, kod kongenitalno bilateralnog odsustva vas diferens CBAVD - congenital bilateral absence of the vas deferens, Young-ovog sindroma,
neuspele vazoepididimostomije, neuspele vazovazostomije i bilateralne, iatrogene inguinalne opstrukcije oba ejakulatorna kanala. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metoda, tako|e, mo`e biti primenjena sa testikularnim spermatozoidima u svim slu~ajevima kada epididimalni spermatozoidi ne mogu biti dobijeni u slu~ajevima testikularnog zastoja u sazrevanju, parcijalne aplazije germinativnih }elija ili tubularne skleroze, kao i u izuzetnom slu~aju nekrozoospermije.
Tabela 4-6: Indikacije kod ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metode
Neuspeh oplodnje putem IVF Aglutinacija sperme Teka oligozoospermija - kriptozoospermija Teka astenozoospermija * Imunoloki faktori Opstruktivna i neopstruktivna azoospermija, paraplegija: epididimalno ili testikularno pribavljanje spermatozoida Ejakulatorna disfunkcija: retrogradski ejakulat Pogorana spermatogeneza ili spermiogeneza: nezreli spermatozoidi - Zreli spermatidi - Izdu`uju}i ili izdu`eni spermatidi - Okrugli spermatidi* - Sekundarni spermociti* In vitro sazreli spermatociti i spermatidi* Onkologija: krioprezervirani spermatozoidi pre hemoterapije ili radioterapije Izbegavanje polispermije kod pacijenata sa anamnezom ponovljene polispermije nakon IVF Rane preimplantacione dijagnoze In vitro sazreli oociti*
*rezultati su veoma lo{i kod ovog tipa indikacije, broj oplodnji je manji od 30% i broj trudno}a je manji od 5% konvencionalna IVF - in vitro fertilisation mo`e dati prihvatljive rezultate
219
Treba naglasiti va`nost procene rizika primene ICSI - intra citoplasmatic sperm injection postupka po potomstvo, jer kao {to je ve} re~eno, postoji blago pove}anje de novo hromozomskih abnormalnosti, dok je broj ve}ih kongenitalnih malformacija sli~an kao kod IVF - in vitro fertilisation. Nedavne publikacije su objavile slu~ajeve poreme}aja imprintinga. Potrebne su dodatne studije radi procene uticaja razli~itih tehnologija asistirane reprodukcije i poreme}aja imprintinga. Epididimalni spermatozoidi mogu biti dobijeni putem mikrohirur{ke epididimalne aspiracije sperme.
genezom, biopsija tako|e mo`e biti dobijena perkutanom aspiracijom putem aspiracije finom iglom FNA - fine needle aspiration. Kod pribli`no polovine pacijenata sa neopstruktivnom azoospermijom je mogu}e na}i spermatozoide. Mogu}e je koristiti zamrznute spermatozoide: ejakulirane, epididimalne i testikularne, ~ime se izbegava ponavljanje postupaka dobijanja koji nisu bez potencijalnih rizika. Analizom dosada{njih rezultata ICSI intra citoplasmatic sperm injection procedure utvr|eno je da se ova procedura nije mogla obaviti kod 1 - 3% slu~ajeva. Ovo je naro~ito bilo zastupljeno kod parova sa neopstruktivnom azoospermijom. Prema statisti~kim podacima oko 85% ICSI - intra citoplasmatic sperm injection ciklusa je obavljeno sa sve`im i ejakuliranim spermatozoidima, a oko 15% slu~ajeva sa sve`im i zamrznutim epididimalnim i testikularnim spermatozoidima. Analizom dobijenih oocita kod ove metode oplodnje u 81,5% slu~aja utvr|eno je dobijanje oocita u metafazi 2 sa jednim polarnim telom, 9,8% je sadr`alo oocite u fazi germinalnog vezikula, a kod 3,7% su bili oociti u metafazi 1. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection je obavljena samo na oocitima metafaze 2. Procenti oplodnje se kontinuirano prate sa tendencijom porasta zahvaljuju}i sve ve}oj rutiniranosti medicinskih timova, savr{enijoj opremi i usavr{enim medijumima. Podaci iz literature govore da je procenat oplo|enih oocita primenom ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnike oplodnje sa spermatozoidima dobijenim ejakulacijom ve}i od dve tre}ine. Broj oplo|enih oocita dobijenih hirur{kim putem u slu~aju neopstruktivne azoospermije je manji nego sa ejakuliranim spermatozoidima i u proseku je ve}i od 50%.
220
Dalji razvoj normalno oplo|enih oocita nakon ICSI - intra citoplasmatic sperm injection je procenjivan na sli~an na~in kao i kod IVF - in vitro fertilisation. Preko 80% normalno oplo|enih oocita se razvilo u embrione sa normalnim morfolo{kim kvalitetom. Odsustvo oplodnje nakon ICSI - intra citoplasmatic sperm injection je u slu~ajevima malog broja oocita, prisustva samo nepokretnih spermatozoida, spermatozoida bez akrozoma, nekompetentnih oocita i o{te}enih samom injekcijom. Prema objavljenim izve{tajima centara koji se bave asistiranom reprodukcijom u preko 40% slu~ajeva je bila primenjena ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnika oplodnje od ukupnog broja ciklusa. Mega analiza ura|ena kod pacijenta sa umerenom oligoastenoteratozoospermijom je pokazala da su {anse za oplodnju oocita nakon ICSI - intra citoplasmatic sperm injection 3.9 puta ve}e nego kod klasi~ne IVF - in vitro fertilisation. Analiziraju}i samo one slu~ajeve steriliteta gde nisu bili u pitanju androlo{ki uzroci, radi objektivne komparacije ove dve metode pokazalo se da je broj implantacija bio ve}i u IVF - in vitro fertilisation grupi 30% u odnosu na ICSI - intra citoplasmatic sperm injection grupu gde je bio oko 22%. Zaklju~ak je da ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnika oplodnje ne pru`a prednost nad IVF - in vitro fertilisation u pogledu klini~kog ishoda u slu~ajevima gde se ne radi o androloskom uzroku neplodnosti. Podr`ana je trenutna praksa prema kojoj ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehniku treba primeniti samo za probleme mu{kog faktora. Predlozi da ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metodu treba primeniti kod
svih ciklusa asistirane reprodukcije nisu prihvatljivi. Ako se ovo sprovede bez dodatnih studija, takva politika bi mogla imati ozbiljan uticaj na vreme rada u laboratoriji, medicinska sredstva i, iznad svega, na ukupnu bezbednost usled isklju~enja mehanizama prirodne selekcije gameta i usled invazivnosti same tehnike. Kod slu~ajeva mu{ke neplodnosti usled te{ke OAT- oligoasthenoteratozoospermia-e, ili neopstruktivne azoospermije, potrebno je uraditi analizu kariotipa iz periferne krvi i odre|ivanje AZF - azoospermia factors a, b, c. Kod mu{karaca sa CBAVD - congenital bilateral absence of the vas deferens bi trebalo iztra`iti mutacije u genu cisti~nog fibroznog transmembranskog konduktanskog regulatora CFTR - cystis fibrosis transmembrane conductance regulator gena. Dobro je poznato da se konstitucionalne hromozomske aberacije pove}avaju sa smanjenjem broja spermatozoida. Tako|e je jasno da je incidencija numeri~kih aberacija polnog hromozoma, kao {to su 47, XXY i 47, XYY, povi{ena kod mu{karaca sa azoospermijom. Izgleda da strukturne hromozomske aberacije autozoma, kao {to su Robertson - ova i recipro~ne translokacije, nisu retke kod oligospermi~nih mu{karaca. Kod nekih mu{karaca sa neopstruktivnom azoospermijom histolo{ki je otkriven arest spermatogeneze {to je rezultovalo neuspehom razvoja germinativnih }elija. Poku{aji maturacije germinativnih }elija u kulturi su bili neuspe{ni. Isto tako, postoji rastu}i broj delecije Y hromozoma koje se prepoznaju kao uzrok poreme}ene spermatogeneze. Mu{ka deca ro|ena nakon primene ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnike }e nositi istu deleciju na Y hromozomu kao i njihov otac. Sve dok se ne dobije bolja definicija uzroka poreme}ene spermatogeneze, postoja}e
221
zna~ajan rizik od preno{enja genetskih defekata. Spermatozoidi mu{karaca sa neopstruktivnom azoospermijom imaju ve}u incidenciju hromozomskih aneuploidnosti, od kojih je aneploidnost polnog hromozoma naj~e{}a. Objavljeni statisti~ki podaci upore|enja metoda IVF - in vitro fertilisation i ICSI intra citoplasmatic sperm injection daju slede}e podatke: Prenatalna dijagnoza se obavlja kod oko 50% trudno}a do kojih je do{lo nakon primene ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnike. Kod oko 40% postoji i rizik vezan za godine starosti. Kori{}ene su metode CVS - chorionic villus sampling i amniocenteza. Abnormalni fetalni kariotip je prona|en kod oko 3% svih pregledanih beba. Od toga oko 1,6% anomalija je bilo de novo. Zna~ajno ve}i procenat od oko 2,1% de novo prenatalnih hromozomskih aberacija je prime}en kod slu~ajeva sa koncentracijom spermatozoida manjom od 20 mil /ml u pore|enju sa oko 0,24% pregledanih slu~ajeva gde su koncentracije bile ve}e od 20mil/ml. Statisti~ka razlika je konstatovana za kriterijum pokretljivosti, a ne za kriterijum morfologije. Materinske karakteristike koje su upore|ene, lekovi koji su se davali majkama tokom trudno}e i trajanje trudno}e nisu pokazali zna~ajnu razliku. Utvr|eno je da je prose~na starost majki ve}a u grupi `ena le~enih ICSI - intra citoplasmatic sperm injection, kao i ve}i procenat prvih trudno}a i prvih poro|aja. Te`ina beba na ro|enju, broj neonatalnih komplikacija, ro|enje beba male te`ine, broj mrtvoro|ene dece i broj perinatalnih smrti su sli~ni. Broj prevremenih poro|aja je ne{to ve}i kod dece ro|ene nakon primene ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metode, 31,8% u odnosu na IVF - in vitro fertilisation decu, 29,3%.
Ve}e malformacije definisane kao one koje izazivaju funkcionalna pogor{anja ili zahtevaju hirur{ku korekciju su prime}ene na ro|enju kod 3,4% dece rodjene nakon ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metode i kod 3,8% dece ro|ene nakon IVF - in vitro fertilisation metode. Broj mrtvoro|ene dece posle 20. nedelje trudno}e je bio 1,69% kod ICSI - intra citoplasmatic sperm injection grupe i 1,31% kod IVF - in vitro fertilisation grupe. Ukupan broj malformacija, uklju~uju}i i ve}e malformacije mrtvo-ro|ene dece, malformacije u slu~ajevima spontanih prekida trudno}e i kod `ivo-ro|ene dece je 4,2% kod ICSI - intra citoplasmatic sperm injection i 4,6% kod IVF - in vitro fertilisation. Iz navedenih analiza proisti~e da su neonatalni ishod i rizici nakon ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metode isti sa IVF - in vitro fertilisation metodom. Od uvo|enja ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metode malo studija je pratilo dalji razvoj ro|ene dece. Upore|uju}i objavljene rezultate dosada{njih ispitivanja primenom standardnog testa razvoja kod dece ro|ene nakon IVF in vitro fertilisation metode do starosti od 2 godine, nisu prime}ene razlike u psihomotornom razvoju. U jednoj kasnijoj studiji su upore|eni medicinski i razvojni ishodi 439 dece ro|ene nakon ICSI intra citoplasmatic sperm injection metode (61 par blizanaca), sa istim rezultatima kod 207 dece ro|ene nakon IVF - in vitro fertilisation metode (69 blizanaca), pri starosti od 24 - 28 meseci. Deca su pro{la kroz formalnu procenu razvoja putem Bejlijeve skale razvoja deteta, od strane pedijatra koji nisu znali o kom se tipu tretmana radi. Nije utvr|ena zna~ajna razlika u njihovoj starosti, dobu gestacije, paritetu, te`ini bebe na ro|enju, broju neonatalnih
222
komplikacija ili broju malformacija pri starosti od 2 godine izme|u IVF - in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection ro|enih beba. Multi varijantna regresiona analiza je pokazala da su paritet, pol i starost imali zna~ajan uticaj na rezultat testa, dok sama procedura, IVF - in vitro fertilisation ili ICSI - intra citoplasmatic sperm injection nije uticala na rezultat testa. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection deca, od o~eva koji su imali nisku koncentraciju spermatozoida, nisku pokretljivost spermatozoida i lo{u morfologiju, su imala sli~an razvoj kao i deca od o~eva sa normalnim parametrima spermatozoida. U nekim studijama se pokazalo da je proces ICSI - intra citoplasmatic sperm injection podlo`an uticaju spoljnih faktora. Naro~ito se upotreba testikularnih spermatozoida, umesto zrelih spermatozoida, smatra rizi~nijom po poreme}aje u imprintingu kako je embrion uzgajan in vitro, podlo`an promenama imprintinga. Do sada je ro|eno nekoliko dece sa Angelman-ovim sindromom, usled sporadi~nog defekta imprintinga, nakon ICSI - intra citoplasmatic sperm injection procedure. Nedostatak mutacije sredi{ta imprintinga i detekcija {ablona mozai~ne metilacije ~ini malo mogu}im nasle|ivanje defekata i ukazuje na postzigotski epigenetski defekat. Postoji mogu}nost da ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnika oplodnje uti~e na produkciju ili funkciju izvr{nih, transacting faktora neophodnih za imprinting maj~inskog hromozoma 15. S druge strane, drugi autori u svojim radovima nisu prona{li abnormalni {ablon metilacije na hromozomu 15. Od strane vi{e autora opisani su slu~ajevi BWS - Beckwith - Wiedemann - ovog sindroma.
Smatra se da rasprostranjenost BWS Beckwith Wiedemann syndrome-a iznosi 1/15000. Molekularne studije su pokazale da je ve}ina prou~avane dece imala specifi~ne epigenetske izmene koje se dovode u vezu sa BWS - Beckwith Wiedemann syndrome-om, i to, mutacije imprintinga LIT 1 i H19 gena, i razli~ite izmene metilacije specifi~ne za BWS - Beckwith Wiedemann syndrome. Na osnovu ovih nalaza i zapa`anja da se Angelmanov sindrom pojavio nakon primene ICSI - intra citoplasmatic sperm injection, postoji dovoljno dokaza da neki aspekti ICSI - intra citoplasmatic sperm injection procedure mogu pove}ati frekventnost epigenetskih anomalija {to vodi ka sindromu kongenitalne malformacije. Po{to su svi poreme}aji imprintinga veoma retki, kod BWS Beckwith Wiedemann syndrome-a poga|a 1/15000 dece, Angelman - ovog sindroma 1/30000, Praeder-Vili 1/15000, za detekciju manjih pove}anja je potreban ve}i uzorak. S obzirom na poznatu vezu izme|u BWS - Beckwith Wiedemann syndroma, karcinoma i pove}ane frekventnosti abnormalnosti metilacije H19, mo`emo pretpostaviti da asistirana reprodukcija mo`e biti u direktnoj vezi sa pojavom embrionalnih
223
karcinoma u koje su uklju~ene abnormalnosti metilacije. Po{to je incidencija karcinoma kod dece sa BWS - Beckwith Wiedemann syndromom, mla|e od 4 godine, 0.02 na 110 pacijent - godina, o~ekivano bi bilo primetiti ove probleme od trenutka kada grupe pacijenata postanu dovoljno velike i kada je follow-up primenjen posle neonatalnog perioda 1/1000 pri starosti od 5 godina. Do sada je identifikovano pribli`no 50 gena kod kojih je prisutan genomski imprinting i mnogi nisu bili klonirani ili jo{ uvek imaju nepoznatu funkciju. Iz svih ovih podataka mo`emo zaklju~iti da postoje dokazi za pove}an rizik od poreme}aja imprintinga kod ICSI - intra citoplasmatic sperm injection dece i da de~iji karcinomi mogu biti povezani sa ovim poreme}ajima, ali samo nekoliko zapa`anja u literaturi pru`a podatke o mogu}im frekventnostima ovih pojava. Samo sistemati~no ispitivanje, usmereno
ka onim sindromima i bolestima koje imaju poznat i definisan fenotip povezan sa genomskim imprintingom, mo`e razjasniti da li epigenetske anomalije igraju ulogu u ICSI - intra citoplasmatic sperm injection i IVF - in vitro fertilisation metodi ~e{}e nego kod op{te populacije. Kod analiziranih izve{taja o Angelman - ovom sindromu i o BWS - Beckwith Wiedemann-ovom sindromu, konstatovane su promene na maj~inskom nemetilisanom alelu. Ovo ~ini malo verovatnim povezanost problema sa diferencijacijom spermatozoida i ~ini verovatnijim da ICSI intra citoplasmatic sperm injection procedura ili neki drugi aspekti asistirane reprodukcije remete metilaciju u maj~inskom genomu ili u ranom embrionu. Potrebne su dodatne biolo{ke studije radi razumevanja patogeneze ovih pojava i odgovora na pitanje preventive njihove pojave.
224
225
pokazalo da je TEFNA - testicular fine needle aspiration nanosila ireverzibilno o{te}enje i atrofiju u arhitekturi seminifernih tubula. Za razliku od ovog, TESE - testicular sperm extraction je stvarala samo lokalni o`iljak i fibrozu, pa je ve}i deo testisa bio netaknut i bez o{te}enja. Uzimaju}i u obzir broj dobijenih spermatozoida i invazivnost tehnike prikupljanja, dolazi se do zaklju~ka da je procedura otvorene biopsije metoda izbora. Kao {to je ve} re~eno u poglavlju o pripremi sperme za oplodnju u programima asistirane reprodukcije krioprezervacija biopsiranog testikularnog tkiva i spermatozoida koji nisu iskori{}eni u ICSI - intra citoplasmatic sperm injection ciklusu omogu}uje smanjenje broja hirur{kih intervencija na testisu.
U eksperimentima opisanim na `ivotinjama transplatacija stem }elija iz germinativnih }elija, od plodnog donora u testis neplodnog primaoca, ponovo uspostavlja spematogenezu u testisu primaoca. Rezultuju}i spermatozoidi prenose donorov genotip na potomstvo primaoca. Transplantacija germinativnih }elija poma`e u rasvetljavanju biologije stem }elija dobijenih iz linije germinativnih }elija, razvoju sistema kultivacije spermatogonijskih stem }elija i ispitivanju defekata spermatogeneze. Ksenografti testisa su pogodni za ispitivanje lekova za pobolj{anje mu{ke fertilnosti. Prema tome, transplantacija }elija zametka i ksenografting tkiva testisa pru`aju nove mogu}nosti za prou~avanje i le~enje mu{ke fertilnosti.
226
227
sazrevanje ostaje metod koji treba izabrati radi ostvarivanja uspe{nih trudno}a, bez obzira na potrebu za velikim dozama egzogenih hormona koji imaju svoje rizike i cenu. Jedan od problema kod humanih oocita je pru`anje optimalnih uslova za IVM - in vitro maturation, {to zahteva imitiranje mikro-endokrine sredine dominantnog folikula, jer se ~ini da je ovo va`an preduslov koji je potreban nezrelim oocitima za postizanje pune kompetentnosti nukleusa i citoplazme. Kod IVM - in vitro maturation oocita, uslovi za oplodnju i kultivaciju embriona, kao i za uterinsku receptibilnost pri transferu, se mogu razlikovati od onih kod konvencionalnih ciklusa IVF - in vitro fertilisation, pa }e zbog toga morati da se optimiziraju, da bi se obavila implantacija. ^ini se da je IVM - in vitro maturation naro~ito zahtevna kod ~oveka kod koga se faktori, za koje se zna da imaju negativne posledice po kompetentnost, kao {to je na primer nasle|ivanje maj~ine i-RNK - messenger ribonucleic acid, komplikovano za prou~avanje. Osim toga, promene izazvane procesom in vitro maturacije imaju potencijal da izazovu negativne uticaje na razvoj koji se ne mogu uo~iti na osnovu posmatranja pona{anja embriona u in vitro uslovima tokom preimplantacionih etapa. U nekim radovima dolazi se do podataka da IVF - in vitro fertilisation metoda izla`e embrione uslovima kojih nema u in vivo uslovima, pa ovo mo`e rezultovati nepredvi|enim posledicama, uklju~uju}i i sindrom LOS - large offspring syndrome koji se dovodi u vezu sa pove}anim brojem spontanih abortusa, produ`enim trajanjem gestacije, fizi~kim abnormalnostima i pove}anim mortalitetom i morbiditetom. Dana{nji nalazi indiciraju da su izmenjeni {abloni genomskog imprintinga verovatni i neo~ekivani uzrok ovog sindroma.
Iako nema dokaza za poreme}aje u razvoju, koji se dovode u vezu sa IVF - in vitro fertilisation i kultivacijom embriona, poznato je da su oociti i embrioni i nakon etape blastociste ekstremno osetljivi na spolja{nju sredinu, bilo prirodnu ili ve{ta~ku, pa njihov normalni razvoj mo`e biti ugro`en na puno na~ina. Produ`eno kultivisanje, koje je potrebno za in vitro sazrevanje, se zbog toga mora smatrati potencijalno rizi~nim i mogu}im uzrokom lo{e razvojne kompetentnosti koja se obi~no dovodi u vezu sa IVM - in vitro maturation. U svom trenutnom obliku, IVM - in vitro maturation metoda je u ranoj etapi razvoja i za klini~ku upotrebu se mora primenjivati oprezno. Klini~ke trudno}e kao rezultat IVM - in vitro maturation metode su od posebnog zna~aja u sada{njoj fazi primene ove metode. Puna razvojna kompetentnost oocita i embriona se kona~no odre|uje samo `ivim ro|enjima i mo`e, tako|e razumljivo, zahtevati pa`ljivo pra}enje nakon ro|enja. Za ostvarivanje ovarijalne stimulacije kod IVF - in vitro fertilisation metode koriste se razli~iti protokoli o ~emu je bilo govora u poglavlju o stimulaciji folikulogeneze. Razni protokoli, uklju~uju}i delimi~nu ili minimalnu stimulaciju egzogenim hormonima, se koriste i u pripremama za IVM - in vitro maturation postupak. Kod preliminarnih studija, tretman `ena tokom jednog ili tri dana rFSH - rekombinantni folikul stimuliraju}i hormon rano u folikularnoj fazi, nije pokazao razliku u broju dobijenih oocita ili u frekventnosti sazrevanja, oplodnji ili razvoju embriona u kulturi. Utvr|eno je pove}anje produkcije oocita do proseka od 7,5 oocita nakon rFSH rekombinantni folikul stimuliraju}i hormon tretmana u pore|enju sa 5,2 oocita kod pacijenata koji nisu hormonski tretirani.
228
Posle 48 ~asova kultivacije, sa dodatkom FSH - follicle stimulating hormone-a i HCG - human chorionic gonadotropin-a u medijum, zna~ajno vi{e oocita je zavr{ilo sazrevanje u odnosu na oocite kod `ena koje nisu tretirane, 71,1% prema 43,5%, i bilo je zna~ajno manje degenerisanih oocita. Mogu}e je da je ova in vivo stimulacija pospe{ila produkciju LH - luteinizing hormone receptora koji su bili stimulisani HCG - human chorionic gonadotropin-om dodatim u medijumu tokom IVM - in vitro maturation. Upotreba minimalne ovarijalne stimulacije sa rFSH - rekombinantni folikul stimuliraju}i hormonom se primenjuje po~ev od 3. dana ciklusa kod dve grupe `ena: onih sa redovnim regularnim menstrualnim ciklusima i onih sa policisti~nim ovarijalnim sindromom, PCOS - polycystic ovarian syndrome i neregularnim ciklusima. Kod prirodnog menstrualnog ciklusa u serumu FSH - follicle stimulating hormon po~inje da raste u kasnoj lutealnoj fazi. Kod `ena sa anovulatornim ciklusima je inicirano krvarenje i po~eto je sa niskom dozom rFSH - rekombinantni folikul stimuliraju}i hormonom devetog dana. Davanje gonadotropina je nastavljeno sve dok vode}i folikul nije dostigao oko 10mm u pre~niku. Oociti su dobijeni posle prekida davanja rFSH - rekombinantni folikul stimuliraju}eg hormona od 2 - 5. dana. Pretpostavljalo se da }e rFSH - rekombinantni folikul stimuliraju}i hormon stimulisati rast folikula i time pove}ati broj nezrelih oocita potrebnih za IVM - in vitro maturation. Dobijeno je prose~no 11,2 prema 11,5 nezrelih oocita kod obe grupe `ena, s tim da je 71% nezrelih oocita dostiglo zrelost posle 44 ~asa kultivacije, a 64% je bilo oplo|eno ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnikom. Ovi rezultati se nisu zna~ajno razlikovali izme|u obe grupe.
Razvoj GVBD - germinal vesicle breakdown proteina i sazrevanje do M2 se razlikuju izme|u GV - germinal vesicle oocita dobijenih iz stimulisanih i nestimulisanih jajnika. Osloba|anje GVBD - germinal vesicle breakdown proteina je zna~ajno ranije kod oocita dobijenih iz stimulisanih jajnika u odnosu na oocite iz nestimulisanih jajnika. Posle 12 ~asova kultivacije 80% oocita u GV - germinal vesicle fazi iz stimulisanih jajnika se podvrglo procesu GVBD - germinal vesicle breakdown proteina dok su oni iz nestimulisanih jajnika ostali nepromenjeni. Vreme zavr{etka sazrevanja nukleusa, prikazano osloba|anjem prvog polarnog tela, se razlikovalo: 75% oocita iz stimulisanih jajnika je stiglo do M2 za 30 ~asova kultivacije, dok je 75% oocita iz nestimulisanih jajnika dostiglo M2 fazu za 42 - 45 ~asova. Me|utim, ukupan broj sazrelih oocita dobijenih od stimulisanih i nestimulisanih jajnika nije se razlikovao. Razli~iti mehanizmi sazrevanja stimulisanih folikula sa FSH - follicle stimulating hormone-om ili HCG - human chorionic gonadotropin-om se mogu pripisati razlici reakcije GVBD - germinal vesicle breakdown proteina zbog izmenjenog profila receptora ili zbog post-receptorskih signalnih mehanizama, koje tek treba razjasniti. Terapija gonadotropinom vodi do razvoja folikula i dovodi se u vezu sa povi{enim koncentracijama estradiola. Oociti dobijeni iz stimulisanih jajnika su izlo`eni prete`no estrogenskom miljeu. Pored toga, dodatak estradiola medijumu za sazrevanje oocita mo`e direktno uticati na kvalitet oocita. Nije detektovan uticaj estradiola na GVBD - germinal vesicle breakdown protein ili dalji napredak mejoze. Estradiol podsti~e niz kratkotrajnih pove}anja koncentracije intracelularnog
229
slobodnog Ca2+ koji mo`e doprineti kompetentnosti oocita za oplodnju i za rani razvoj nakon oplodnje. Jedna od studija je nagovestila da davanje hormona rasta tokom ovarijalne stimulacije za ICSI - intra citoplasmatic sperm injection mo`e pomo}i in vitro sazrevanju i oplodnji, me|utim, istovremeno se dobija veliki broj nezrelih oocita, a prona|ene su razlike izme|u grupa pacijenata sa i bez hormona rasta ishoda ICSI intra citoplasmatic sperm injection. Ovaj nalaz nagove{tava da se rezultati ne moraju odnositi isklju~ivo na oocite u sazrevanju. IVM - in vitro maturation i oplodnja su, tako|e, ra|eni kod nezrelih oocita dobijenih u fazi germinal vesicle nakon primene egzogenog HCG - human chorionic gonadotropin-a in vivo. Ove studije se razlikuju u prisustvu ili odsustvu prethodne FSH follicle stimulating hormone stimulacije, broju nezrelih oocita za in vitro sazrevanje, vremenu kultivacije, sazrevanju i kori{}enom medijumu za kultivaciju, stepenu oplodnje i deobi embriona. Nezreli oociti dobijeni nakon in vivo primene HCG human chorionic gonadotropin-a mogu sazreti u kulturi bez dodatka gonadotropina ili steroida. Medijum za kultivaciju obi~no sadr`i serum pacijenta i ponekad granulozne }elije dobijene od istog folikula. Mogu}e je da je HCG - human chorionic gonadotropin inicirao proces sazrevanja ~ak iako su oociti jo{ uvek u GV - germinal vesicle fazi prilikom punkcije. Postoje dokazi da izdvajanje oocita iz njihove normalne folikularne sredine, pre njihove luteinizacije, smanjuje sposobnost oplo|enja, {to se vidi na primeru promene signalizacije kalcijumom kao reakcije na spajanje spermatozoida i oocita.
ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnika oplodnje kod in vitro sazrelih oocita pove}ava verovatno}u oplodnje, jer se premo{}avaju problemi kao {to su, o~vr{}ivanje zona pellucida usled produ`ene kultivacije i promene kortikalne reakcije, zbog neadekvatne periferne migracije kortikalnih granula tokom sazrevanja. Zbog toga se ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnika oplodnje rutinski koristi kod programa IVM - in vitro maturation. Neadekvatne periferne migracije kortikalnih granula se mogu smatrati dokazom nezrelosti ili abnormalnosti ooplazme sa mogu}no{}u postojanja drugih anomalija citoplazme koja poti~u, ili koja su pogor{ana, primenom IVM - in vitro maturation i koje mogu uticati na ishod ili na potomstvo. Sadr`aj medijuma koji se koristi za IVM - in vitro maturation metodu uti~e na ishod sazrevanja. Klju~ni eksperiment, koji je sproveden tokom 1990-ih godine, i koji je ponovo pokrenuo interesovanje za IVM - in vitro maturation tehniku, je koristio folikularnu te~nost kao dodatak medijumu za kultivaciju. Danas sa upotrebom komercijalnih medijuma kori{}enje bioloskih fluida je smanjeno. Razni hormoni i faktori rasta uklju~eni u medijum za kultivaciju, kao {to su epidermalni faktor rasta EGF - epidermal growth factor ili FSH -follicle stimulating hormon sa ili bez humanog horionskog gonadotropina HCG - human chorionic gonadotropin, mogu potpomo}i sazrevanje oocita i razvoj embriona. Ostale supstance koje imaju pozitivan uticaj na sazrevanje i oplodnju kod drugih vrsta, a koje jo{ nisu testirane kod ljudi, uklju~uju glutation i cistein koji deluju na granulozne }elije, a ne direktno na oocite. Granulozne }elije se mogu modifikovati komponentama medijuma za kultivaciju
230
uti~u}i na oocit direktno putem parakrinog dejstva ili fizi~ki putem modifikacije njihovog prisustva i orijentacije oko oocita. IVM - in vitro maturation je najuspe{nija odmah nakon punkcije, jer je oocit okru`en nera{irenim }elijama kumulusa koje ostaju u kulturi do zavr{etka sazrevanja. ]elije kumulusa su veoma metaboli~ki aktivne i na njihove produkte, kao {to su steroidi, mo`e se uticati dodavanjem hormona in vitro. Sazrevanje oocita se odvija, pre svega, supresijom inhibitornih uticaja granuloznih }elija, uklju~uju}i one koje su do{li do oocita preko gap spojeva. Lokalni stimulatorni faktori mogu poja~ati proces. Gonadotropini su glavni faktori za in vivo sazrevanje oocita. Delovanje gonadotropina na folikularnom nivou je slo`enije nego {to se mo`e o~ekivati iz njihove rasprostranjenosti i predvidive primene kao sistemskog inicijatora ovulacije. Granulozne }elije sadr`e mRNK - messenger ribonucleic acid za FSH - follicle stimulating hormone receptore od ranog folikularnog razvoja, dok se LH - luteinizing hormone receptori podsti~u kao reakcija na stimulaciju putem FSH - follicle stimulating hormone-a i nalaze se na periferiji velikih folikula. Dok folikul raste, javljaju se velike varijacije izme|u granuloznih }elija u razli~itim delovima folikula. Unutra{nje kumulusne }elije nastavljaju da rastu i odgovaraju na FSH - follicle stimulating hormone mucifikacijom, dok spolja{nje muralne granulozne }elije izbacuju P450 aromatazu i LH - luteinizing hormone receptore. Kumulusne }elije prisutne kod IVM - in vitro maturation kulture imaju malo LH - luteinizing hormone receptora. Zanimljivo je da izlaganje kompleksa kumulusa na FSH - follicle stimulating hormone in vitro mo`e rezultirati neodgovaraju}im sazrevanjem koje se dovodi u vezu
sa preuranjenom i abnormalnom ekspresijom LH - luteinizing hormone receptora. Osim toga, razli~ite izoforme FSH - follicle stimulating hormone-a imaju uticaj na odabir samog izoforma za IVM - in vitro maturation. U spontanom mejotskom sazrevanju i sazrevanju podstaknutom putem FSH - follicle stimulating hormone-a posreduju razli~ite intracelularne putanje. Bilo je nagove{teno da je sazrevanje podstaknuto sa FSH - follicle stimulating hormone-om posredovano generisanjem stimulatornog signala koji premo{}uje inhibitorni stimulus folikula. Spontano sazrevanje ne zahteva stimulatorni signal, jer rezultira uklanjanjem folikularnih inhibitora. Kod klini~ke IVM - in vitro maturation, FSH - follicle stimulating hormone i LH - luteinizing hormone, ili HCG - human chorionic gonadotropin se obi~no dodaju pri kultivisanju u poku{aju imitiranja in vivo pika i ovi hormoni se smatraju relativno bezbednim, jer se pacijent izla`e njima ranije. FSH - follicle stimulating hormone u kombinaciji sa LH -luteinizing hormone kod in vitro sazrevanja je stimulisao br`i embrionalni razvoj. Epidermalni faktor rasta EGF - epidermal growth factor je prvi put opisan 1962. godine nakon izolacije iz mi{jih submaksilarnih `lezdi.
231
Humani EGF - epidermal growth factor prvobitno nazvan urogastron, je kasnije izolovan iz ljudskog urina i ~lan je familije peptidnih faktora rasta. Kao polipeptidni lanac od 53 amino kiseline, relativno je mali i njegova veli~ina dozvoljava laku penetraciju kroz zonu pelucidu oocita, pa deluje direktno na oocit. EGF - epidermal growth factor ima mitogeno dejstvo u ~itavom nizu mezodermalnih i ektodermalnih tkiva i u~estvuje u regulisanju }elijske proliferacije. EGF epidermal growth factor se sinteti{e u malim antralnim folikulama i ima ulogu u folikularnom rastu kada se odvija brza }elijska proliferacija. TGF - transforming growth factor koji, tako|e, koristi EGF - epidermal growth factor receptor je potentan angiogeni agens koji moduli{e steroidogenezu granuloznih }elija i u~estvuje u folikularnom sazrevanju.
razumevanje uloge EGF - epidermal growth factor-a u razvoju folikula i oocita mo`e biti va`an preduslov u razvoju klini~ki efikasnih sistema rasta i sazrevanja oocita. Sterol aktivacije mejoze MAS - meiosis activating sterol je otkrio 1995. godine Buskoy. MAS - meiosis activating sterol ima sposobnost da inicira mejozu gameta kod fetalnih testisa i da podstakne nastavak in vitro mejoze oocita koji su u hipoksantinskom zastoju.
EGF - epidermal growth factor receptor je prisutan kod mnogih }elija jajnika, uklju~uju}i i oocite primordijalnih, primarnih i preantralnih folikula, kao i granuloznih }elija antralnih folikula. EGF - epidermal growth factor mo`e igrati pozitivnu ulogu u in vitro sazrevanju oocita i, tako|e, mo`e poja~ati sazrevanje i razvoj intrafolikularnih oocita u kulturi folikula. Bolje
Dva prirodna sterola koji podsti~u nastavak mejoze oocita bez i onih okru`enih kumulusnim }elijama su tako|e identifikovani: FF-MAS - folicular fluid meiosis activating sterol i T-MAS - testis meiosis activating sterol ekstrahovan iz testikularnog tkiva. FF-MAS - folicular fluid meiosis activating sterol i T-MAS - meiosis activating sterol su posrednici u biosinteti~koj putanji holesterola, ali se MAS - meiosis activating sterol akumulira samo u gonadama. FSH - follicle stimulating hormone i HCG - human chorionic gonadotropin direktno uti~u na biosintezu holesterola. Za pravovremeni nastavak mejoze oocita, unutar preovulatornog folikula pretpostavljalo se da poti~e od kombinovanih uticaja izmenjene biosinteze holestreola granuloznih i kumulusnih }elija, {to je rezultovalo
232
akumuliranjem MAS - meiosis activating sterola i direktnog transfera MAS - meiosis activating sterola od kumulusnih }elija do oocita preko gap spojeva. Zato MAS meiosis activating sterol mo`e biti endogeni medijator uticaja gonadotropina na oocite. Nekoliko studija je testiralo uticaj pro~i{}enog ili sinteti~kog FF-MAS - folicular fluid meiosis activating sterola na stimulisanje in vitro sazrevanja. Stimulacija endogene produkcije mo`e biti efikasnija od suplementacije, jer se egzogeni MAS - meiosis activating sterol redovno konvertuje u holesterol i u druge steroide. Farmakolo{ka inhibicija 14 reduktaze kod kumulus - oocit kompleksa u hipoksantinskom zastoju je izazvala akumulisanje endogenog FF-MAS - folicular fluid meiosis activating sterol-a i nastavak mejoze oocita. Isti efekat nije prime}en kod oocita bez kumulusa, {to je navelo na zakljucak da se biosinteza MAS - meiosis activating sterol-a odvija u kumulusnim }elijama, a ne u oocitu. Blokiranje metabolizma FF-MAS - folicular fluid meiosis activating sterol-a je stimulisalo GVBD - germinal vesicle breakdown protein kod oocita okru`enih kumulusnim }elijama, ali ne i kod slobodnih oocita. Zato je predlo`ena alternativna interpretacija, po kojoj podsticanje mejotskog sazrevanja inhibitorima enzima, koji se nalaze ni`e od FF-MAS folicular fluid meiosis activating sterola u biosintezi sterola, deluje spre~avanjem akumulisanja inhibitornih metabolita kao {to je holesterol. Ovo je mogu}e obja{njenje po{to kori{}eni inhibitor ima dodatno mesto delovanja na 7-reduktazi koje proizvodi holesterol iz 7- dehidroholesterola. Pokazalo se da holestreol poja~ava inhibitorni uticaj dbcAMP - dibutyryl cyclic adenosine monophosphate, na na~in koji zavisi od veli~ine doze i kod oocita okru`enih kumulusnim }elijama i kod slobodnih oocita.
Katokonazol inhibira citohromni P450 14DM enzim koji konvertuje lanosterol u FF-MAS - folicular fluid meiosis activating sterol in vitro. Utvr|eno je da nema uticaja katokonazola koji je potentni inhibitor sinteze sterola na sazrevanje oocita, kako kod in vivo oocita stimulisanih gonadotropinom, tako i kod spontano sazrevaju}ih oocita in vitro. Stimulisanje P450 - 14DM, pomo}u gonadotropina, se suprotstavlja inhibitornom dejstvu katokonazola na ovaj enzim, pa se ravnote`a aktivnosti enzima, lokalno u kumulusu, ne mo`e kvantifikovati. Signalne putanje za FF-MAS - folicular fluid meiosis activating sterol tokom nastavka mejoze oocita, su nepoznate. Sinteza proteina je neophodna za odr`avanje sposobnosti odgovora oocita na MAS meiosis activating sterol, ali transkripcija nije potrebna. MAS - meiosis activating sterol receptor nije identifikovan, iako je otkriveno da specifi~no spajanje FF-MAS folicular fluid meiosis activating sterola preovla|uje u oolemi slobodnih oocita. Kontrola sazrevanja oocita na molekularnom nivou nije do kraja razja{njena kao i brojnih drugih lokalnih aktivnih faktora. Folikularni milje je bogata i slo`ena me{avina hormona, faktora rasta, makromolekula i vezivnih proteina i predstavlja sredinu koja je usavr{ena evolucijom. Prema tome, nije iznena|uju}e da dodavanje razli~itih faktora medijumu za kultivaciju ne premo{}uje gubitak kompetentnosti ili nesposobnosti sticanja kompetentnosti in vitro. IVM - in vitro maturation bi mogla postati alternativa ili dopuna trenutnim protokolima stimulacije koji se koriste u IVF - in vitro fertilisation. IVM - in vitro maturation omogu}uje kori{}enje 10 - 15% nezrelih oocita dobijenih nakon ovarijalne stimulacije, smanjuju}i na taj na~in ukupan gubitak oocita. Ovo bi koristilo pacijentima sa nesinhrovanizovanom kohortom folikula kod kojih je veliki broj nezrelih oocita
233
dobijenih nakon stimulacije. Dok }e neki od ovih oocita spontano sazreti in vitro, {to se de{ava, ako kumulus ostane netaknut, podr{ka pomo}u odgovaraju}e in vitro sredine, u koju mogu biti uklju~eni gonadotropin ili drugi dodaci, mo`e biti korisna za krajnji ishod. IVM - in vitro maturation bi smanjila potrebu za stimulacijom gonadotropinom. Ovo se mo`e predvideti, jer je istra`ivanje pokazalo da se nezreli oociti, prikupljeni iz follikula pre~nika 5 - 14 mm, mogu upotrebiti, ali trenutno ne sa optimalnom efikasno{}u. Glavni kriterijum za odre|ivanje vremena punkcije je da folikul nije pre{ao inicijalne etape atrezije, tj. dominacija folikula nije ~vrsto uspostavljena i da su folikul i oocit dostigli prag razvojne kompetentnosti. IVM - in vitro maturation naro~ito koristi pacijentima koji imaju PCO - polycystic ovarian, radi smanjenja rizika nastajanja hiperstimulacionog sindroma stimulacijom gonadotropinima i HCG - human chorionic gonadotropinom u programu IVF - in vitro fertilisation. Dok je blagi oblik OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma od malog klini~kog zna~aja, te`ak oblik OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma, koji karakteri{e veliko uve}anje jajnika i skupljanje ektravaskularne te~nosti, je izuzetno rizi~an za pacijenta, o ~emu }e biti re~i u poglavlju o OHSS - ovarian hyperstimultion syndromu. Za razliku od zrelih, nezreli oociti u antralnim folikulima u kasnoj folikularnoj fazi mogu biti dobijeni lak{e od pacijenata koji bi se podvrgli ooforektomiji, ako se pa`ljivo odredi trenutak intervencije. IVM - in vitro maturation pru`a {ansu za o~uvanje plodnosti kod `ena sa kancerom, ili drugim malignim stanjima, ili kod `ena sa kontraindikacijom za ovarijalnu stimulaciju. Kao alat za istra`ivanje, IVM - in vitro maturation mo`e pru`iti vredan model za ispitivanje uzroka mejotskih aberacija i
aneuploidnosti, kao i drugih anomalija koje su uobi~ajene kod zrelih oocita. Pre nego {to se IVM - in vitro maturation mo`e posmatrati kao rutinski tretman neplodnosti, potrebni su validni i efikasni sistemi sazrevanja, oplodnje i razvoja embriona. Bez obzira na sada{nja, jo{ uvek postoje}a ograni~enja IVM - in vitro maturation metode, nagove{teno je da potencijalne koristi IVM - in vitro maturation, u pore|enju sa konvencionalnom IVF - in vitro fertilisation i uz razvijaju}e znanje o mehanizmima kontrole rasta folikula i oocita i ranu embriologiju, pru`aju povoljan trenutak za ozbiljno razmatranje kori{}enja IVM - in vitro maturation metode u svakodnevnoj praksi. U nekim radovima je utvr|eno da davanje HCG - human chorionic gonadotropin-a pre uzimanja oocita pove}ava razvojnu kompetentnost prikupljenih nezrelih oocita. U radovima se pokazalo da je oko 50% oocita ve} sazrelo kod pacijenata kojima je dat HCG - human chorionic gonadotropin i oni su zavr{ili mejozu 12 -24 ~asa pre oocita pacijenata kojima nije dat HCG - human chorionic gonadotropin. Nije prona|ena zna~ajna razlika izme|u ukupne oplodnje, razvoja embriona i broja trudno}a kod pacijenata kojima je dat HCG - human chorionic gonadotropin u odnosu na pacijente kojima nije dat HCG - human chorionic gonadotropin. Primena metode sazrevanja oocita u in vitro uslovima je potencijalno odgovaraju}a dopuna hirurgiji ili dijatermiji jajnika radi ostvarivanja trudno}e kod neplodnih `ena sa PCOS - polycystic ovarian syndrome-om, dok je uspeh koji se mo`e o~ekivati promenljiv, sude}i prema objavljenim izve{tajima iz raznih centara. Moraju se pobolj{ati uslovi sazrevanja oocita radi zadr`avanja potencijalne razvojne kompetentnosti nezrelih oocita, {to treba da bude prioritet u buducim istra`ivanjima. Procenat trudno}a nakon IVM - in vitro maturation je oko 10%.
234
6. GENETIKA MU[KE NEPLODNOSTI, EVOLUCIJA X I Y HROMOZOMA I MOGU]NOST PRENOSA NEPLODNOSTI NA BUDU]E GENERACIJE
Od uvo|enja metode intracitoplazmati~ne injekcije spermatozoida, 1992. godine, do{lo je do promena u razmi{ljanju o mu{koj neplodnosti. Najte`i slu~ajevi mu{ke neplodnosti, sa abnormalnom morfologijom ili sa niskim brojem spermatozoida u ejakulatu, danas mogu ostvariti broj trudno}a i poro|aja koji se ne razlikuje od konvencionalne IVF - in vitro fertilisation sa normalnim spermatozoidima. Slede}e, 1993. godine uvedene su nove metode, testikularna ekstrakcija sperme TESE - testicular sperm extraction i mikrohirur{ka epididimalna aspiracija sperme MESA - microsurgical epidydimal sperm aspiration, sa primenom u tretmanu opstruktivne azoospermije u kombinaciji sa ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnikom oplodnje. Ove tehnike su kori{}ene i kod neopstruktivne azoospermije, jer kod mnogih azoospermi~nih mu{karaca postoji jako mala produkcija sperme u testisu koja nije kvantitativno dovoljna da se prelije u ejakulat, ali je adekvatna za ICSI - tehniku oplodnje. Upravo su kod ovih slu~ajeva neopstruktivne azoospermije i te{kih slu~ajeva oligospermije zna~ajna genetska istra`ivanja, jer ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnika oplodnje stvara potencijalni problem progresije mu{ke neplodnosti. Zbog toga su sve va`nija molekularna ispitivanja i dobijeni podaci o spermatogenezi Y hromozomskih gena i njihovog prenosa na potomke dobijene ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnikom oplodnje.
Posebna vaznost sa aspekta evolucije Y hromozoma je i razja{njenje postojanja velikog broja gena spermatogeneze koji se prostiru {irom genoma, a koji tako|e mogu
235
Pretpostavljalo se da postoji genetska etiologija u velikom broju slu~ajeva mu{ke neplodnosti. Ova sumnja je potekla iz istra`ivanja od pre 25 godina kada se do{lo do citogenetskog dokaza da kod 0,2% azoospermi~nih mu{karaca, koji su ina~e bili fenotipski normal-
ni, postoje terminalne delecije Y hromozoma. Odre|ivanje kariotipa neplodnih mu{karaca je pove}alo mogu}nosti povezivanja neplodnosti sa translokacijama autozoma. Sumirani rezultati odre|ivanja kariotipa kod novoro|enih populacija su otkrili pove}anje relativne u~estalosti uravnote`enih translokacija autozoma kod normalne novoro|ene populacije u odnosu na neplodne mu{karace od 0,25% na 1,3%. Odre|ivanjem kariotipa oligospermi~nih mu{karaca dokazana je incidencija od 3% prisustva nekih tipova autozomskih anomalija, i to, uravnote`ene Robertsonove translokacije, uravnote`ene recipro~ne translokacije, uravnote`ene inverzije. Ove translokacije bi mogle da se prenesu na potomke kori{}enjem ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnike oplodnje. Mogu}nost da je porast i sve ve}i broj slu~ajeva mu{ke neplodnosti, genetskog porekla, podr`ana je neuspehom klini~kih terapija kod slu~ajeva nepotpune spermatogeneze. Prva molekularna istra`ivanja Y hromozoma su dovela do istra`ivanja gena koji kontroli{u spermatogenezu, a koji mogu biti defektni kod mnogih ili ve}ine neplodnih mu{karaca. Nedavno je genetska etiologija mu{ke neplodnosti, koja je u vezi sa defektima u spermatogenezi, postala priznata uvo|enjem molekularne metodologije. Samom tom ~injenicom, da mu{ka neplodnost ima genetsko poreklo, mogu} je prenos na potomke u slu~ajevima uspe{no tretiranih neplodnih mu{karaca.
Tabela 4-7: Hromozomske abnormalnosti kod azospermi~nih i oligospermi~nih mu{karaca u pore|enju sa normalnom novoro|enom populacijom
BROJ UKUPNO NOVORO\EN^AD POLNI HROMOZOMI AUTOZOMI UKUPNO
7 876 94 465
236
Slede}i korak daljeg istra`ivanja je bilo mapiranje Y hromozoma neplodnih mu{karaca. Kod odre|ivanja kariotipa je poznato da veoma mali broj od 0,2 % azoospermi~nih mu{karaca ima velike defekte vidljive na dugom kraku Y hromozoma koji nisu prisutni kod njihovih o~eva. Iz ovoga proizilazi postojanje azoospermi~nog faktora na dugom kraku Y hromozom, Yq . Manji defekti se ne mogu dijagnostikovati citogenetskim metodama, pa su ovi defekti na Yq smatrani retkim, ~ak i kod azoospermi~nih mu{karaca. Godine 1992. formirane su mape Y hromozoma pomo}u ve{ta~kih hromozoma YCS - yeast artificial chromosomes i sekvenciranih obele`enih pozicija STS - sequenced tagged sites, {to je stvorilo mogu}nost detaljnog prou~avanja Y hromozoma neplodnih mu{karaca. Pomo}u polimerazne lan~ane reakcije PCR - polymerase chain reaction definisanje izgubljenih delova Y hromozoma bi moglo biti dostignuto testiranjem i do 52 DNK - deoksiribonukleinska kiselina obele`ja STS - sequenced tagged sites na ~itavom Y hromozomu. Svi upotrebljeni Y-DNK markeri su sme{teni na fizi~ku mapu hromozoma predstavljaju}i sve familije gena u nerekombinuju}oj regiji Y-hromozoma. Kori{}enjem ovih tehnika molekularnog mapiranja, koje imaju mnogo ve}u rezoluciju od citogeneti~ke, ura|ena su ispitivanja na velikom broju neplodnih mu{karaca sa jasno identifikovanim fenotipom. Tako je otkriveno prisustvo delecija kod 13% azoospermi~nih mu{karaca. Kod oligospermi~nih mu{karaca je utvr|eno prisustvo 7 % delecija. Naj~e{}a regija sa pojavom delecije je locirana u distalnom delu intervala 6, kasnije nazivanim AZFc - azoospermia factors.
Ve}a rezolucija mapiranja Y-hromozoma tokom odre|ivanja kariotipa je pokazala da vi{e od 0,2% azoospermi~nih mu{karaca ima defekte Y hromozoma. Zbog visoko polimorfne prirode nerekombinuju}e regije Y hromozoma NRY - non recombining segment Y chromosome gen, postoje brojne delecije koje ne izazivaju nikakve posledice. Za o~eve neplodnih mu{karaca se pokazalo da imaju netaknute Y-hromozome {to zna~i da su se delecije pojavile de novo. DAZ - deleted in azoospermia homolog genski cluster je identifikovan u naj~e{}oj regiji delecije AZFc - azoospermia factors. Pokazalo sa da su DAZ - deleted in azoospermia homolog geni prepisani u spermatogonijama i ranim primarnim spermatocitima. Otkriveno je da je kod ~oveka DAZ - deleted in azoospermia homolog gen Y hromozoma, lociran u AZFc azoospermia factors regionu, u sredini podru~ja sa vi{estrukim ponavljanjem niza nukleotida. Kasnije je otkriveno da je DAZ - deleted in azoospermia homolog gen prisutan u ~etiri, skoro identi~ne kopije u AZFc - azoospermia factors regiji. Prisustvo DAZLA - deleted in azoospermia like aut homolog gena na hromozomu 3 koji je homolog DAZ - deleted in azoospermia
237
homolog genu na Y hromozomu je ono {to dozvoljava da nizak stepen spermatogeneze ostaje kod mu{karaca sa delecijom ve}ine AZFc - azoospermia factors. Kod delecije izvan AZFc - azoospermia factors ne dolazi do spermatogeneze. Pokazalo se da manje delecije koje zauzimaju samo dve kopije DAZ - deleted in azoospermia homolog gen-a rezultiraju umerenijim spermatogenim defektima u odnosu na klasi~ne AZFc - azoospermia factors delecije sve ~etiri kopije DAZ - deleted in azoospermia homolog gen-a. Ovo ukazuje na postojanje poligenih efekata vi{estrukih doza gena koji bi mogli kontrolisati spermatogenezu. Nekoliko gena u razli~itim oblastima Y hromozoma igraju va`nu ulogu u spermatogenezi. Iako postoje brojne kopije i pseudogeni RBM - RNK binding motif gena na Y hromozomu, od kojih je ve}ina nefunkcionalna, postoji i funkcionalna kopija u regiji, u blizini AZFc - azoospermia factors. Ispitivanja su podr`avala koncept prema kome brojni geni Y hromozoma, pored onih iz AZFc - azoospermia factors regije, tako|e uti~u na spermatogenezu. Multipli geni sprematogeneze doprinose i modifikuju stepen spermatogenih defekata kod mu{karaca sa delecijom na Y hromozomu. Delecije na Y hromozomu koje se citogenetski nisu mogle dijagnostikovati nazvane su mikrodelecije. Ta~na je bila pretpostavka da manje delecije ili ta~kaste mutacije mogu biti prisutne, kako u AZFc - azoospermia factors-u, tako i na drugim mestima. Sekvence nukleotida koje se ponavljaju i koje karakteri{u ve}i deo Y hromozoma ote`avaju standardnim STS - sequenced tagged sites markerima da defini{u manje delecije.
Neobi~na struktura ponavljaju}ih sekvenci AZFc - azoospermia factors regije Yhromozoma je ote`avala prve poku{aje konstruisanja fizi~ke mape pomo}u YAC yeast artifitial chromosome, jer ponavljaju}i STS - sequenced tagged sites nisu mogli biti precizno postavljeni u deletiranim intervalima 6D6F. Napori za nala`enjem ta~kastih mutacija du` Y-hromozoma su bili ote`ani prisustvom vi{estrukih kopija gena u ovim regijama sa brojnim ponavljanjima, specifi~nim za Y hromozom. AZFa - azoospermia factors sekcija Yhromozoma je odabrana da bude detaljno prou~ena zbog odsustva vi{estrukih kopija gena ili specifi~nih ponavljanja Y-hromozoma u toj regiji. AZFa - azoospermia factors ima potpuno druga~iju, konvencionalnu i neponavljaju}u strukturu, za razliku od AZFb - azoospermia factors-a i AZFc azoospermia factors-a. Sekvenciranjem AZFa - azoospermia factors regija Y hromozoma su identifikovana dva funkcionalna gena USP9Y - ubiquitin specific protease 9 Y chromosome gen i DBY - dead box Y chromosome gen. Dalje sekvenciranje ova dva gena je otkrilo nekoliko varijacija sekvenci od kojih je ve}ina nesle|ena od oca i nema funkcionalne posledice. U jednom slu~aju je prona|ena de novo delecija ~etiri nukleotidna para USP9Y - ubiquitin specific protease 9 Y chromosome gena na spoju introna i egzona, {to je uslovilo nepravilan "splajsing", odnosno, pogre{no isecanje introna i nastanak i -RNK koja }e se translatovati u skra}eni protein. Ova mutacija nije bila prisutna kod plodnih ro|aka i predstavljala je prvi slu~aj mutacije koja je prouzrokovala genski defekat koji je u vezi sa spermatogenim neuspehom. Prou~avanje AZFa- azoospermia factors-a je, tako|e, pru`ilo dobar model za interakciju i preklapanje funkcija vi{estrukih gena,
238
koji razja{njava poligenu prirodu genetske kontrole spermatogeneze. Kada se cela AZFa - azoospermia factors regija deletira, uzimaju}i DBY - dead box Y chromosome gen i USP9Y - ubiquitin specific protease 9 Y chromosome gene, dolazi do pojave ozbiljnijeg spermatogenog defekta i pacijent je azoospermi~an. Me|utim, kada postoji samo specifi~na ta~kasta mutacija USP9Y - ubiquitin specific protease 9 Y chromosome gena dolazi do zastoja u sazrevanju sa nekoliko pahitenskih spermatocita koji se razvijaju u zrelu spermu. Tako gubitak DBY - dead box Y chromosome gena jedinog preostalog gena u
AZFa - azoospermia factors regiji pogor{ava spermatogene posledice gubitka USP9Y - ubiquitin specific protease 9 Y chromosome gena. Ovaj nalaz u AZFa azoospermia factors regiji je paralelan sa prethodnim zapa`anjima prema kojima su ve}e delecije na Y-hromozomu povezane sa manjom verovatno}om pronala`enja spermatozoida. Razvojem metode ICSI - intra citoplasmatic sperm injection sa testikularnim i epididimalnim dobijanjem sperme, mu{karci sa najte`im spermatogenim defektima, koji prouzrokuju azoospermiju u ejakulatu, su sada mogli da imaju decu.
Tabela 4-8: Rezultati ICSI - intra citoplasmatic sperm injection kod mu{karaca sa deletiranim i normalnim Y hromozomom sa te{kom oligospermijom < 2x10 6 i neopstruktivnom azoospermijom
Y-brisani (< 2 x106 ) Y-nebrisani (<2x106 ) Broj pacijenata sa spermatozoidima Broj ciklusa sa spermatozoidima Broj jaja{aca Broj ZPN Broj trudno}a Broj poro|aja Broj beba Broj de~aka Broj devoj~ica 23 45 508 (289) 57% (17) 38% (13) 29% 18 10 8 205 312 3291 (1849) 56% (112) 36% (81) 26% 9943 43 56
Tabela 4-9: Detekcija Y delecija u limfocitima periferne krvi kod 884 neplodna mu{karca S/A < 5 x10 6
239
Odgovor na pitanje za{to su se inicijalni molekularni napori za definisanje genetskih uzroka mu{ke neplodnosti koncentrisali na Y hromozom le`i u istoriji evolucije X i Y hromozoma. Tokom poslednjih 240 do 320 miliona godina evolucije sisara, X i Y hromozomi su evoluirali iz onoga {to je originalno bilo, par obi~nih autozoma. Za vreme te evolucije, dok se ve}ina nasle|enih X gena raspadala zbog nedostataka mejotske rekombinacije X i Y hromozoma, pojavili su se geni koji kontroli{u spermatogenezu transpozicijom ili retropozicijom od autozoma na Y hromozom. Kada su stigli u razvoju do Y hromozoma, ovi biv{i autozomski geni su se umno`ili u vi{e kopija. Ostali geni spermatogeneze na Y hromozomu su istrajali na njihovim originalnim pozicijama na X hromozomu i razvili su specifi~nu spermatogenu funkciju na Y hromozomu. Iako je DAZ - deleted in azoospermia homolog gen veoma star, dobro o~uvan gen nalazi se na Y hromozomu ljudi. Kod sisara je ina~e potpuno autozoman RBM - RNK binding motif gen i nalazi se na Y hromozomu jo{ od nastanka novog hromozoma, {to je dokazano njegovim prisustvom na Y hromozomu torbara pre razila`enja euterijskih od neeuterijskih sisara. Tako je RBM - RNK binding motif bio gen spermatogeneze koji je zapo~eo na autozomima predaka koji su evoluirali u X i Y hromozome sisara. RBM - RNK binding motif gen koji je ostao na X hromozomu RBMX - RNK binding motif X chromosome gene je zadr`ao svoju rasprostranjenu funkciju, dok je RBMY - RNK binding motif Y chromosome gene, koji je istrajao na Y hromozomu koji uzmi~e, evoluirao u specifi~no mu{ku funkciju u spermatogenezi. SRY - sex determining region gen, lokus koji odre|uje mu{ki pol, verovatno je originalno bio SOX3 - sulfur oxidation 3
gen na X hromozomu pre diferencijacije u SRY - sex determining region mu{ki gen koji odre|uje pol. Zapravo je evolucija nerekombinuju}eg mu{kog gena SRY - sex determining region zapo~ela ceo proces evolucije Y hromozoma. SOX3 - sulfur oxidation 3 je gen na X hromozomu koji inhibira SOX9 - sulfur oxidation 9 gen koji je, tako|e, na X hromozomu. SOX9 - sulfur oxidation 9 gen na X hromozomu je gen koji aktivira odre|ivanje mu{kog pola. SOX3 - sulfur oxidation 3 gen je evoluirao u SRY - sex determining region na Y hromozomu. SRY - sex determining region inhibira SOX3 - sulfur oxidation 3 gen omogu}avaju}i aktivnost SOX9 - sulfur oxidation 9 gena i tako odre|uje da li }e se desiti kaskada doga|aja koja vodi do formiranja testisa. Tako se obja{njava po~etak transformacije obi~nog para autozoma u sada{nje X i Y hromozome. Geni koji su u vezi sa nerekombinuju}om regijom SRY - sex determining region, a koji su bili naro~ito korisni kod mu{ke funkcije, su se razvijali na evoluiraju}em Y hromozomu bez {tetnog dejstva mejotske rekombinacije. Na ovaj na~in, mu{ki korisni geni su stigli i akumulirali se na evoluiraju}em Y-hromozomu tokom mnogo miliona godina pomo}u tri mehanizma: - transpozicijom od autozoma preko translokacije, - retropozicijom od autozoma preko reverzne transkripcije, i - perzistencijom, tj. mu{kom modifikacijom funkcije od onog {to je originalno bio gen na X hromozomu. Ovaj proces daje Y hromozomu vrlo jedinstven tip funkcionalne povezanosti koja nije vi|ena u ljudskom genomu. Funkcionalna reproduktivna anatomija X i Y hromozoma je od posebne va`nosti. Translokacije se de{avaju relativno ~esto kod svake vrste. Tokom evolucije ovo
240
rezultira da se o~uvani, homologni geni razli~itih vrsta nalaze u potpuno razli~itim delovima genoma i u relativno pome{anom nizu gena svakog hromozoma gde strukturna blizina ima malo ili nimalo uticaja na funkciju. Me|utim, dve nasumi~ne transpozicije koje tokom vremena rezultuju haoti~nim nedostatkom organizacije genoma su dozvolile direktno pribavljanje, od strane Y-hromozoma, gena koji imaju zajedni~ku funkciju da poja~aju mu{ku plodnost. Selektivni pritisci podsti~u proces koncentrisanja gena spermatogeneze na nerekombinuju}em delu Y-hromozoma zajedno sa mu{kim genom koji odre|uje pol, SRY sex determining region genom, naro~ito ako su ovi geni od male koristi `enskom polu. Zanimljivo je da je X-hromozom, za razliku od autozoma i Y hromozoma, izuzetno o~uvan kod svih sisara, sa malo me{anja gena sa strane radi selekcije protiv ometanja razvoja procesa inaktivacije X hromozoma u evoluciji X i Y hromozoma. Geni koji su stigli na Y hromozom, ili koji su istrajali na degeneri{u}em Y genu od preda~kog X i stekli istaknuti polo`aj na Y hromozomu, pro{li su kroz paradoksne procese amplifikacije, proizvode}i vi{estruke kopije i kroz degeneraciju usled neuspeha rekombinacije. DAZ - deleted in azoospermia homolog gen, kao {to je re~eno, bio je prvi takav gen koji je identifikovan u
AZFc - azoospermia factors regiji Y hromozoma putem inicijalnog Y mapiranja kod azoospermi~nih mu{karaca. DAZ deleted in azoospermia homolog gen predstavlja prvi nedvosmislen primer transpozicije autozoma u Y hromozom gena spermatogeneze koji je predstavnik procesa koji uti~e na mnoge druge gene spermatogeneze i mo`da obja{njava relativno lo{e stanje ljudske spermatogeneze u pore|enju sa spermatogenezom kod ostalih `ivotinja. ^ini se da je transpozicija autozoma u Y hromozom gena mu{ke plodnosti proces koji se ponavlja u evoluciji Y hromozoma kod svih vrsta. Autozomski DAZ - deleted in azoospermia homolog gen, kod ~oveka nazvan DAZ-L - deleted in azoospermia homolog gen se nalazi na ljudskom hromozomu 3. U nekom trenutku tokom evolucije, pre oko 30 miliona godina, ovaj DAZ - deleted in azoospermia homolog gen je stigao transpozicijom na Y hromozom od onog {to se danas zove humani hromozom 3 i tu se umno`io i proizveo ~etiri gotovo identi~ne kopije gena. Ovaj proces je prvo opisan za DAZ-L - (deleted in azoospermia) homolog gen i DAZ - deleted in azoospermia homolog gen. Me|utim, danas se zna da postoje drugi, prethodno autozomski geni ili familije gena na Y hromozomu, ~ija se ekspresija odvija samo u testisu i koji igraju veliku ulogu u spermatogenezi.
Gen DAZ (AZFc) Ljudski Y DAZ (AZFc) Ljudski Y RBM (AZFb) Ljudski Y SRY
Gen predak DAZ (Automatski) Ljudski 3 CDYL (Automatski) Ljudski 6 RBMX Ljudski X SOX - 3
241
CDY - chromodomain protein Y chromosome gen je stigao u AZFc - azoospermia factors regiju Y hromozoma na druga~iji na~in od onog na koji je stigao DAZ - deleted in azoospermia homolog gen i to reverznom transkripcijom. Autozomski CDY - chromodomain protein Y chromosome gen, CDY1 - chromodomain protein Y chromosome 1 gen se nalazi na humanom hromozomu 6. Homologi CDY bez introna je prona{ao svoj put do humanog Y hromozoma pre dolaska DAZ (deleted in azoospermia) homolog gena, ne{to posle odvajanja prosimijske linije primata pre otprilike 50 miliona godina . To se desilo tako {to je na osnovu zrele i-RNK, nastale prepisivanjem gena sa hromozoma 6, sintetisana DNK reverznom transkripcijom koja se potom ugradila u Y-hromozom. Gen dobijen reverznom transkripcijom nije sadr`ao introne pa je stoga postojala i razlika u nukleotidnoj sekvenci izme|u istih gena na hromozomu 6, sa intronima i Zhromozomu. RBB - retinoblastoma binding gen u AZFb - azoospermia factors regiji Y hromozoma je imao svoje poreklo u pretku na{eg X hromozoma i tamo se pro{irio kao testis specifi~an gen. Pre 240 - 320 miliona godina, ubrzo nakon razila`enja sisara i ptica, X i Y geni su po~eli da se razilaze u identitetu sekvenci sa pojavom SRY - sex determining region Y chromosome gen i neuspehom rekombinacije u regiji SRYsex determining region Y chromosome gen. Sa raspadanjem evoluiraju}eg Y hromozoma, usled nedostatka rekombinacije, ovi geni koji su originalno bili X hromozomski su se razi{li u nizu sa Y hromozoma, a oni koji su imali mu{ke korisne funkcije su istrajali. Primer ovih gena je SRY - sex determining region Y chromosome gen koji je zapo~eo kao generi~ki SOX3 - sulfur
oxidation gen na X hromozomu, ali je razvio svoju specijalizovanu testis odre|uju}u funkciju onemogu}avaju}i ceo proces rekombinacije, koji je na kraju rezultovao degeneracijom Y hromozoma. Ovim istim procesom je RBM - RNK binding motif gen stigao do istaknutog polo`aja u AZFb azoospermia factors regiji Y hromozoma.
Tabela 4-11: Perzistencija RBM-X na Y hromozomu po Lahn -u i Page-u
RBN - Y RBM - X Mu{ka specifi~na Nema mu{ke funkcija specifi~ne funkcije Jedna kopija Brojne kopije Puno degenerata Isti kod svih euterijskih sisara
AZFa - azoospermia factors regija u NRY - non recombining segment Y chromosome genu je ne{to komplikovanija. Po~etak uzmicanja preda~kog Y, u pore|enju sa svojim parom X je bio u etapama tokom 320 miliona godina. X - Y homologija se smanjuje u skladu sa tim koliko rano u svojoj istoriji nisu uspeli da se rekombiniju X i Y hromozomi, sa posledicom razila`enja u strukturnom nizu. Evolutivno gledano, najranije odsustvo rekombinacije bilo je ograni~eno na distalni deo X hromozoma, da bi se u najnovijoj istoriji ono pro{irilo i na najproksimalniji deo X-hromozoma. AZFa - azoospermia factors regija Y hromozoma se razi{la od X hromozoma relativno skoro u svojoj evolucionoj istoriji i zbog toga ima konvencionalniju
242
strukturu sekvenci sa mnogo ve}om homologijom od one koju ima njen rival na X hromozomu. Dva gena u AZFa - azoospermia factors regiji: USP9 Y - ubiquitin specific protease 9 Y chromosome gen i DBY - dead box Y chromosome gen igraju va`nu ulogu u spermatogenezi. Delecija AZFa - azoospermia factors sekvence rezultuje potpunim odsustvom sperme. Bez obzira na metod dolaska gena spermatogeneze do nerekombinuju}eg dela Y hromozoma, ovaj region bi se neizbe`no suo~io, a verovatno i podlegao, sna`nim degenerativnim silama tokom evolucije koja }e uslediti. Pretpostavka je da brzina, odnosno, stepen pribavljanja gena mu{ke plodnosti uslovljava brzinu degeneracija koje slede, rezultuju}i stanjem neprekidne evolucije. Za razliku od ekstremne evolucione stabilnosti X hromozoma, individualni geni mu{ke neplodnosti nisu dugog `ivotnog veka, u evoluicionom smislu, na Y hromozomu. Isticanje Y hromozoma u lociranju gena spermatogeneze radi pomo}i u rasvetljavanju uzroka mu{ke neplodnosti ima smisla, jer je Y hromozom prikupio gene koji bi ina~e bili skriveni {irom celog genoma. Imaju}i u vidu istoriju evolucije X i Y hromozoma, mo`e se konstatovati da ima podjednako sna`nih komponenti za regulaciju spermatogeneze, lociranih tako|e na X hromozomu i na autozomima. Nestabilnost X hromozoma mo`e voditi ka padu produkcije sperme u evoluciji bilo koje vrste, osim ako postoji konkurencija u {ablonu sparivanja ili metod kontinualnog popunjavanja Y hromozoma novim genima spermatogeneze, sa pro{irenjem koje sledi, a koje se de{ava pre kona~ne degeneracije. Y hromozom je mesto od koga treba
zapo~eti molekularnu potragu za genima koji uti~u na mu{ku plodnost. Razlog za po~injanje od Y hromozoma pridaje naro~iti zna~aj verovatno}i nala`enja jo{ takvih gena koji se kriju {irom ~itavog genoma. Paralelna i nezavisna evolucija X i Y hromozoma i poreklo X-inaktivacije su od posebnog zna~aja. Polni hromozomi su nezavisno evoluirali puno puta kod razli~ith vrsta sa zajedni~kom osnovom. Hromozom sa genom koji odre|uje pol progresivno gubi sposobnost da se rekombinuje sa svojim parom, akumulira mutacije i zapo~inje sa pogor{avanjem. X i Y hromozomi su evoluirali potpuno zasebno i razli~ito kod svake vrste, ali su evoluirali preko zajedni~ke evolucione osnove. Ako Y hromozom Drosophila-e ima deleciju, Drosophila je sterilna. Ako Y hromozom mi{a ili ~oveka ima deleciju, mi{ i ~ovek su sterilni. Ako neka vrsta ima na Y hromozomu zna~ajne delecije, ta vrsta je sterilna. Me|utim, geni koji bi bili izgubljeni na Y hromozomu mi{a, nisu isti oni geni koji su deletirani na ljudskom Y hromozomu. Na primer, homologni gen humanog Y DAZ - deleted in azoospermia homolog gena kod Drosophila-e je autozoman kao {to je autozoman i kod mi{a DAZLA - deleted in azoospermia like autozomal gen, pa delecija ovog autozomskog gena kod Drosophila-e, ili kod mi{a, rezultuje sterilitetom podjednako kao i delecija Y hromozoma Drosophila-e ili Y hromozoma mi{a. Delecija DAZ - deleted in azoospermia homolog gena na Y hromozomu ~oveka ~esto ne rezultuje potpunim odsustvom spermatogeneze, verovatno zbog toga {to stari homologi autozomni DAZ - deleted in azoospermia homolog
243
gen na hromozomu 3 spa{ava spermatogenezu do nekog manjeg nivoa. Delecija AZFb - azoospermia factors gena, me|utim, obi~no rezultuje potpunim odsustvom sperme, zato {to nema autozomskih ili X homologih gena da spasu spermatogenezu kada se ovi geni izgube. Isti {ablon je prona|en kod svih prou~enih vrsta. X i Y po~inju kao par autozoma predaka gde se gen koji odre|uje mu{ki pol ne rekombinuje sa svojim homologim genom. Kod nekih Drosophila, ceo Y hromozom odsustvuje, pa je mu`jak sa takvim poreme}ajem, XO, sterilan. Iako humani Y hromozom, ili bilo koji Y hromozom sisara nema nikakvu sli~nost nukleotidne sekvence sa sekvencom Y hromozoma vo}ne mu{ice, na delu je isti mehanizam akumulacije gena spermatogeneze u raspadaju}em hromozomu koji odre|uje mu{ki pol. Tako je Y hromozom Drosophila i mi{a veoma razli~it od Y hromozoma ~oveka, ali se oni ~ine istim zbog dve zajedni~ke evolucione osnove u razvoju Y hromozoma. Jedna osnova je njegovo postepeno raspadanje od onog {to je bio njegov autozomski homolog, a sada je X hromozom, a druga osnova je njegov rast od pribavljanja i akumulacije mu{ki korisnih specifi~nih gena iz drugih delova genoma. Ovaj evolucioni mehanizam degeneracije Y hromozoma i akumulacija gena spermatogeneze mo`e objasniti relativno ~esto pojavljivanje mu{ke neplodnosti i lo{ kvalitet sperme kod vrsta koje imaju minimalnu konkurenciju sperme. Tako|e, mo`e objasniti fenomen X inaktivacije, ~esto pojavljivanje XO mrtvoro|ene dece i opstanak nekih XO za~e}a kao dece sa Turnerov-im sindromom. Autozom predak koji }e postati Yhromozom razvija proces prvo hiperaktivacijom, a potom X-inaktivacijom
da bi nadoknadio gubitak homologih alela, alelomorfa na onome {to sada postaje Y hromozom. Dok je X hromozom zadr`avao, a Y hromozom postepeno gubio ve}inu ovih gena-predaka, stvoren je mehanizam da se izbalansira genska aktivnost me|u polovima, tako {to je kod mu{karca ekspresija gena sa X-hromozoma intenzivirana, a kod `ene razvijena inaktivacija gena sa jednog od dva X hromozoma. Ovaj mehanizam je, tako|e, osigurao izuzetnu konzervaciju i sli~nost X hromozoma kod svih vrsta sisara. Razumevanje evolucije X homologih gena Y hromozoma, gubljenjem njihovih op{tih }elijskih funkcija, potrebe za pove}avanjem aktivnosti i inaktivacije X gena na jednom od dva `enska X hromozoma, poma`e razja{njavanju razli~itih etapa evolutivnog razvoja humanog Y hromozoma. RBMY - RNK binding motif Y chromosome gen je testis specifi~ni korisni mu{ki kandidatni gen spermatogeneze. Homologi gen RBM - RNK binding motif gena na Y hromozomu RBMX - RNK binding motif X chromosome gen nije razvio specifi~no mu{ku izra`ajnost, ali je zadr`ao svoje op{te }elijske funkcije odr`avanja. Zato se o~ekuje da }e se RBMX - RNK binding motif X chromosome gen pona{ati kao gen X hromozoma bez rivala u Y hromozomu i verovatno }e se podvrgnuti Xinaktivaciji. Kao srodan primer, humani ZFX - zink finger X chromosome gen i ZFY - zink finger Y chromosome gen su veoma srodni na X i Y hromozomu i oba imaju op{te }elijske funkcije odr`avanja koje su kriti~ne za njihov `ivot. Prema tome, ZFX - zink finger X chromosome gen izbegava X-inaktivaciju kod `ena, a ZFY - zink finger Y chromosome gen je jedan od gena aktivan kod Turner-ovog sindroma.
244
Y gen SRY - Odre|uje mu{ki pol ^OVEK RPS4 - Y - Odr`avanje - Svuda prisutan - Tarnerov gen - Nema RPS4 - Y - Evoluirao izvan prisutnosti ZFY - Odr`avanje - Svuda prisutan - Tarnerov gen - Specifi~na samo mu{ka funkcija - Samo dve kopije
X gen - predak SOX - 3 - Bez specifi~ne mu{ke funkcije RPS4 - X - Odr`avanje - Svuda prisutan - Nije X inaktivisan - Odr`avanje - Jeste X inaktivisan ZFX - Odr`avanje - Svuda prisutan - Nije X inaktivisan - Odr`avanje - Svuda prisutan - Jeste X inaktivisan
Od posebnog je zna~aja izu~avanje kariotipa neplodnih mu{karaca i njihovih potomaka nakon uspe{ne oplodnje ICSI intra citoplasmatic sperm injection tehnikom. Incidencija citogenski prepoznatljivih abnormalnosti hromozoma kod potomaka pacijenata podvrgnutih ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnici oplodnje je prihvatljivo veoma niska, ali je ve}a od one kod spontano novoro|ene populacije. Pra}enje stanja dece ro|ene nakon uspe{ne primene ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metode je bilo prou~avano detaljno, a rezultati su objavljivani na Briselskom Univerzitetu od 1995. godine, svake godine redovno. Rezultati kariotipa su bili slede}i: kod 0,83% su utvr|ene abnormalnosti polnog hromozoma, ulju~uju}i: 45 X Turner-ov sindrom; 47 XXY
MI[
^OVEK MI[
Sli~no tome, RPS4X - ribosomal protein S4 X chromosome gen i RPS4Y - ribosomal protein S4 Y chromosome gen su jo{ jedan homologi par gena na X i Y hromozomu i oba imaju ekvivalentne funkcije odr`avanja kod ~oveka. Prema tome, kod ~oveka RPS4X - ribosomal protein S4 X chromosome gen, sli~no ZFX - zink finger X chromosome genu, nije podlo`an X-inaktivaciji, jer postoje funkcionalni transkripti kod mu{karaca, iz X i Y hromozoma, a kod `ena iz oba X hromozoma. Ovaj kratak pregled istorije evolucije X i Y hromozoma obja{njava za{to je Y hromozom bio dobro mesto za po~etak molekularne potrage za genima spermatogeneze. Jasno je da brojni geni sa ~itavog genoma, iako manje izu~avani, tako|e uti~u na spermatogenezu, pa se tako mogu preneti na ICSI - intra citoplasmatic sperm injection potomstvo.
245
Klinefelter-ov sindrom; 47 XXX i mozaike 46 XX/ 47 XXX, kao i 47 XYY. Ovo je veoma niska frekvencija abnormalnosti polnog hromozoma, ali je ipak ~etiri puta ve}a od frekvencije abnormalnosti polnog hromozoma kod novoro|ene populacije od 0,19%. O~igledno je da }e deca sa kariotipom 45 X ili 47 XXY biti neplodna, {to je oko 0,5% od ukupnog broja sa poreme}a-
jima polnog hromozoma. Dalja ispitivanja su pokazala da se kod 0,36% dece javljaju de novo balansirane translokacije autozoma ili inverzije. Ova deca su o~evidno bila normalna, ali ova incidencija de novo balansiranih autozomnih translokacija je pet puta ve}a od one kod novoro|ene populacije 0,07% i mo`e se pretpostaviti da }e ova deca biti neplodna u oko 0,36%.
Broj 18 19
De novo hromozomne aberacije Polno hromozomske: 37 44 - 45, X 32,37 - 46, XX / 47, XXX 26,28,28,32 - 47, XXX (dvoje dece) 25 - 47, XXY (~etvoro dece) - 47, XYY 32,33,37,41,41 Autozomski: - Trisomija 21 30x (petoro dece) 30 Strukturne: 36 - 46, XXX, t (4;5) 39 - 46, XX, t (2;15) - 46, XX, t (2;13) - 46, XX, inv (1gh) Nasle|ene aberacije - Balansirane - Nebalansirane Ukupno aberacija de novo + nasle|ene
9 5 4
10 9 1 28
246
Bilo je 10 slu~ajeva sa translokacijama nasle|enih od neplodnog mu{karca 0,92% i ova deca }e verovatno biti neplodna. Devet od ovih deset su bile balansirane translokacije kod normalnih novoro|en~adi. Jedna, 0,09% nebalansirana translokacija je dijagnostikovana amniocentezom. Po{to pribli`no 2% oligospermi~nih mu{karaca ima hromozomske translokacije u pore|enju sa normalnom populacijom od 0,25%, nije iznena|uju}e da }e 0,9% ICSI - intra citoplasmatic sperm injection potomaka naslediti takvu translokaciju od svojih o~eva. Na osnovu citogenetskih nalaza za pribli`no 2% ICSI - intra citoplasmatic sperm injection potomaka se mo`e o~ekivati da }e imati o~evu neplodnost. Petostruko je pove}anje de novo balansiranih translokacija me|u ICSI potomcima 0,36% u pore|enju sa 0,07% kod spontanih za~e}a. Od toga su samo 20% balansiranih translokacija de novo, a 80% su nasle|ene. De novo balansirane translokacije poti~u od oca u 84,4% slu~ajeva. Balansirane translokacije koje su u vezi sa mu{kom neplodno{}u su prvobitno nastale de novo kod ina~e plodnog oca ili kod njegovih mu{kih predaka, u oko 0,07% kontrolne populacije. Mnogo }e{}e se de novo balansirane translokacije, mada jo{ uvek sa niskim procentom od 0,36%, pojavljuju kod neplodnih mu{karaca koji su se podvrgli ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metodi le~enja i prenose se na njihove potomke. ^ini se da kod patolo{ke spermatogeneze mogu da se, ne samo prenesu nasle|eni autozomski citogeneti~ki defekti, ve} se mo`e i proizvesti jedan broj de novo citogenetskih defekata. Incidencija kongenitalnih abnormalnosti dece dobijene primenom ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnike oplodnje od 2,3% nije ve}a od one kod ostale populacije. ^ak su i
potomci Klinefelterovih pacijenata bili hromozomski normalni. Nema ve}e incidencije autozomske aneuploidnosti od one koja se mo`e predvideti na osnovu starosti majke. Aneuploidnost polnog hromozoma od 0,83% kod ICSI - intra citoplasmatic sperm injection potomaka nema neprihvatljivo visoku incidenciju, iako je ve}a od normalne od 0,19%. Tako je utvr|eno citogenetskom analizom i pedijatriskim pra}enjem stanja dece ro|ene primenom ICSI intra citoplasmatic sperm injection tehnike potomka da je verovatno}a pojave neplodnosti i poreme}aja polnih hromozoma u malom procentu. Studija o Y hromozomu, daje dodatne podatke o povezanosti plodnosti mu{kih potomaka i u~estalosti pojave steriliteta kod njih, nakon uspe{no primenjene ICSI intra citoplasmatic sperm injection tehnike oplodnje njihovih oligospermi~nih o~eva. Mikrodelecije na du`em kraku Y hromozoma ne uti~u nepovoljno na rezultate oplodnje ili trudno}u kod izuzetno oligospermi~nih mu{karaca. Pretpostavka da }e rezultati vantelesne oplodnje ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnikom, biti lo{iji kod mu{karaca sa delecijom na Y hromozomu, nije se pokazala ta~nom. Svi mu{ki potomci koji poti~u od mu{karaca sa delecijom na Y hromozomu su imali iste delecije kao i njihovi neplodni o~evi. O~evi, bra}a i stri~evi neplodnih mu{karaca su tako|e pregledani na postojanje delecija na Y hromozomu, a ispitana je i njihova plodnost. Y delecije kod neplodnih mu{karaca su, uglavnom, bila de novo. Zapravo, plodni o~evi neplodnih pacijenata sa Y delecijama nisu imali Y delecije. Me|utim, svi mu{ki potomci iz ICSI - intra citoplasmatic sperm injection procedura u kojima su u~estvovali ovi mu{karci sa Ydelecijama su imali prenetu Y deleciju sa
247
njihovih o~eva bez pro{irivanja ili drugih promena. Tako je utvr|eno da su do sada svi ro|eni sinovi Klinefelterovih pacijenata imali normalan 46 XY kariotip. Iskustvo ukazuje da se Y delecija sterilnog oca zaista prenosi na sina, pa vi{e ne moramo da spekuli{emo sa tim. Ostaje da se utvrdi da li plodni mu{karci bez Y delecija ili neplodni mu{karci, imaju mozai~ne delecije. Ako je tako, onda bi se de novo Y delecije tako|e mogle ~e{}e na}i kod bra}e pacijenata sa Y delecijom, ili kod ICSI - intra citoplasmatic sperm injection potomaka neplodnih mu{karaca, ~ak i kod onih koji nemaju Y deleciju, nego {to bi se ina~e o~ekivalo da se desi kod ostale novoro|ene populacije. Danas znamo iz detaljnih studija AZFe azoospermia factors i AZFc - azoospermia factors regija Y hromozoma, mnogo vi{e o mehanizmima nastajanja Y delecija i preno{enja na potomstvo. Prva regija Y hromozoma koja je potpuno sekvencirana bila je AZFa - azoospermia factors, jer je to regija Y hromozoma sa veoma malo ponavljaju}ih sekvenci i relativno pristupa~na za prou~avanje. AZF - azoospermia factors regija sa velikim podru~jima ponavljaju}ih sekvenci je, tako|e, bila sekvencirana. Na|eno je da se AZFa - azoospermia factors regija rasprostire na pribli`no 800000 nukleotida, 800 KB, i da je ograni~ena sa svake strane proksimalnim podru~jem razdvajanja i distalnom ta~kom razdvajanja sa oko 10 000 nukleotida, ili 10 KB kilobaza, tako da 94% ukupne sekvence ~ine sekventni identiteti. Preciznija lokalizacija ta~aka razdvajanja uz pomo} konvencionalnog mapiranja kod ve}ine neplodnih mu{karaca sa AZFa - azoospermia factors delecijama nije bila mogu}a. Unutar ovih 10 KB regija razdvajanja, lokacija AZFa - azoospermia factors delecija
je skoro uniformno upadala unutar manjih domena, 447 BP, baznih parova ili nukleotida, do 1285 BP. Sekvenciranje kod ve}ine pacijenata sa AZFa - azoospermia factors delecijama je otkrilo, da usled rekombinacije izme|u identi~nih podru~ja provirusa i Y hromozoma na delu koji ograni~ava ceo region od 800 000 baza, mo`e do}i do gubitka celog regiona sa Y hromozoma. Podru~ja sa ponavljaju}im sekvencama proksimalno i distalno od zajedni~kog mesta delecija, nam daje predstavu o mehanizmu ovih Y - delecija. Pretpostavka je da je do umno`avanja kopija AZFa - azoospermia factors sekvenci do{lo usled insercije retrovirusa u regiju humanog Y hromozoma. Nalazi o AZFa - azoospermia factors regiji daju naznake o tome {ta se de{ava u nekim uobi~ajenim podru~jima delecija kao {to je AZFc - azoospermia factors. Sekvenca AZFc - azoospermia factors regije otkriva isti mehanizam kao i kod AZFa azoospermia factors, ali u ve}em obimu. Veliki domeni apsolutnih sekventnih identiteta postaju mesta za lako nestajanje, drop-out velikih delova DNK, po{to se granice apsolutnih sekvenci identiteta nelegitimno me|usobno rekombinuju. Usled pro{irenja i inverzija u najstarijim podru~jima razila`enja, divergencije nerekombinuju}eg Y hromozoma, ~itava situacija je pripremljena za deleciju i degeneraciju. Ponavljaju}a priroda Y hromozoma, koja je na~inila sekvenciranje i nala`enje malih delecija ili ta~kastih mutacija toliko te{kim, je uzrok njegove nestabilnosti tokom perioda evolucije kao i kod populacije neplodnih pacijenata. Y delecije, dovoljno velike da se mogu detektovati pomo}u zastarelih mapa, se pojavljuju jednom na 2000 ro|enja upravo zbog ovih ogromnih podru~ja ponavljaju}ih sekvenci.
248
AZFc - azoospermia factors regija Y hromozoma, koja je naj~e{}e mesto delecija se prostire na 3,5 miliona baza, pa je te{ko prihvatljivo da je u pitanju mikrodelecija, kako se ~esto naziva. Sastoji se od tri velika palindroma sa~injena od 6 familija amplikona, tj. duga~kih podru~ja identi~nih sekvenci. Sadr`i 19 transkripcionih jedinica sastavljenih od 7 razli~itih familija gena, od kojih je samo jedna DAZ - deleted in azoospermia homolog gen. AZFc - azoospermia factors regija od 3,5 miliona baza je ograni~ena sa svake strane sa podru~jima duga~kim 229.000, sa skoro identi~nim sekvencama, 99,9%. Za razliku od AZFa - azoospermia factors-a, ta~ke razdvajanja ponavljaju}ih sekvenci ne poti~u od drevnog retrovirusa, ve} od same prirode evolucije Y hromozoma usled odsustva rekombinacije. Postoji vi{e podru~ja na Y hromozomu, kao i u AZFc azoospermia factors-u, koja imaju ili direktna ili invertovana ponavljanja sekvenci. Sekvence sa direktnim ponavljanjem }e rezultovati obi~nom delecijom zbog homologe rekombinacije. Invertovana ponavljanja }e rezultovati izodicentri~nim translokacijama, tako|e, zbog homologne rekombinacije. Tako se mo`e o~ekivati da }e se na}i mnogo drugih, manjih delecija, koje su ranije izbegle detekciju nedovr{enim, nesekventno baziranim STS - sequenced tagged sites mapiranjem. Mo`e biti da se manje delecije, koje zauzimaju manje gena, ili ta~kaste mutacije kod samo jedne ili dve kopije identi~nih gena, koje se pojavljuju kod vi{estrukih kopija, mogu pripisati izvesnom broju slu~ajeva mu{ke neplodnosti ili mo`da umerenijim stepenima neuspeha spermatogeneze, kod slu~ajeva sa >2 X 106 do 20 X 106 spermatozoida po cm3. Velike mikrodelecije, koje su do sada opisane u literaturi,
su uglavnom de novo, ali je sigurno da neki mu{karci sa ozbiljnom oligospermijom mogu, na prirodan na~in, imati decu. Mu{karci sa umerenijim stepenima oligospermije mogu jo{ lak{e postati o~evi, pa tako manje Y delecije, koje uzrokuju mu{ku neplodnost, ne moraju toliko ~esto biti de novo. Kako se sve vi{e genetskih uzroka neuspeha spermatogeneze pojavljuje, postoja}e pove}ana svesnost mogu}eg prenosa ove neplodnosti na budu}e generacije. Mu{ka neplodnost je u odre|enoj korelaciji i sa X hromozom. Bilo je teorija po kojima Y hromozom nije jedini polni hromozom koji akumulira gene koji poma`u spermatogenezu tokom vremena evolucije. Sa diferenciranjem X i Y hromozoma, pre 240 do 320 miliona godina, teorije o polno antagonisti~kom genu daju prednost pojavi gena na X hromozomu koji, tako|e, poma`e heterogametskom polu, XY mu{kom, a koji nanose {tetu homogametskom polu, XX `enskom, ako su ovi geni recesivni. Retka recesivna evoluciona mutacija na X hromozomu, koja poma`e spermatogenezu, bi sa predno{}u bila predata mu{kom potomku, koji bi pomo}u ve}eg broja spermatozoida nastavio da dalje predaje ovu mutaciju svojim potomcima. Takva recesivna mutacija, koja podr`ava spermatogenezu, bi u autozomu bila izgubljena za budu}e generacije. Zato se o~ekuje akumulacija na X hromozomu, kao i na Y hromozomu, recesivnih gena koji su korisni za mu{ki pol. Studije RT-PCR - polymerase chain reaction metodom kod spermatogonija pokazale su da ve}ina gena koji su aktivni iskulju~ivo u premejotskim }elijama mu{kog zametka, zaista ima X hromozomsko poreklo. Jedanaest od 36 aktivnih gena poti~e sa X hromozoma. Po{to je X hromozom tako dobro o~uvan kod svih sisara , {to
249
je ranije obja{njeno univerzalnim razvojem X inaktivacije u evoluciji sisara, ~ini se veoma verovatnim da je evolucija, tako|e, dodelila humanom X hromozomu veliki deo tereta spermatogeneze. Neuspeh da se identifikuje Y delecija nimalo ne uverava da genetski uzrok neplodnosti ne}e biti prenesen na ICSI - intra citoplasmatic sperm injection potomke putem X hromozoma ili, ~ak, putem autozoma. Prisustvo delecije na Y hromozomu ne smanjuje broj oplodnji i broj trudno}a u kojima su u~estvovali azoospermi~ni i izuzetno oligospermi~ni mu{karci, <2 x 106. Za sada je odnos polova ro|ene dece jednak i deca su kariotipski normalna. Me|utim, delecija na Y hromozomu, a i neplodnost se prenosi na mu{ko potomstvo. Iako se prema standardnom STS sequenced tagged sites mapiranju, Y delecije pojavljuju kod samo 10% azoospermi~nih mu{karaca, mapiranje bazirano na sekvenciranju, koje je sada na raspolaganju, mo`e zna~ajno pove}ati taj procenat. Verovatno ima mnogo gena spermatogeneze koji u~estvuju u mu{koj neplodnosti i istra`ivanja do danas daju samo manji
broj odgovora na ovaj problem. Mikrodelecije do sada istra`ene i opisane u literaturi, prona|ene kod neplodnih mu{kih pacijenta, ne uklanjaju mogu}nost postojanja genetskog uzroka azoospermije ili oligospermije. Ako se defektni gen, ili geni, nalaze na njegovom Y hromozomu, tada }e njegov mu{ki potomak naslediti njegov problem. Postoje, tako|e, geni na X hromozomu, i {irom genoma, koji uti~u na spermatogenezu, a koji do sada nisu identifikovani na{im trenutnim procedurama mapiranja. Ovi geni, tako|e, mogu biti odgovorni za brojne slu~ajeve mu{ke neplodnosti. Prema tome, sinovi, pa ~ak i }erke, mogu naslediti defekte, ili ih mogu samo prenositi. Prema tome, odre|ivanje kariotipa sigurno treba rutinski obavljati kod neplodnih pacijenata i zbog rizika od poba~aja i abnormalnosti potomka koji mogu biti rezultat abnormalnosti polnog hromozoma ili nebalansiranih translokacija. Testiranje na Y delecije za sada nije obavezno, jer jo{ uvek nije usavr{eno, pa negativni rezultati ne isklju~uju sigurno patologiju. Osim toga, neke delecije mogu biti samo rezultat polimorfizma i nisu od klini~kog zna~aja.
250
251
re~eno, takvi markeri bi imali potencijal da identifikuju neuspe{ne cikluse i dozvole prekid programa pre aspiracije oocita. Folikularni markeri implantacije bi mogli olak{ati modifikovanje stimulacionih re`ima, daju}i podatak o fiziolo{kom statusu folikula i oocita i bolje odre|ivanje trenutka za aspiraciju oocita. U isto vreme bi pru`ili objektivno merilo sposobnosti embriona za normalan rast i razvoj. Potraga za biohemijskim prediktorima ishoda IVF - in vitro fertilisation je po~ela od onih molekula za koje se zna da u~estvuju u endokrinoj i parakrinoj kontroli folikularnog razvoja, sazrevanju oocita i ovulaciji kao {to su: estradiol, progesteron, LH - luteinizing hormone, FSH - follicle stimulating hormone, prolaktin i faktori rasta.
Estradiol
Koncentracije estradiola su merene u razli~ito vreme: pre, za vreme i posle primene HCG - human chorionic gonadotropin-a. Jedna grupa istra`iva~a je utvrdila da je ve}i procenat trudno}a u programu kada su koncentracije estradiola niske tokom ili pre tre}eg dana IVF - in vitro fertilisation ciklusa i na dan primene HCG - human chorionic gonadotropin-a. Druga grupa istra`iva~a je utvrdila da su u tretmanu IVF - in vitro fertilisation trudno}e bile u proporcionalnoj srazmeri sa ve}im koncentracijama estradiola pre ili uvreme primene HCG - human chorionic gonadotropin-a. Nasuprot ovim, dijametralno razli~itim rezultatima, u nekoliko drugih studija je objavljeno da nije prona|ena nikakva zna~ajna veza izme|u procenta za~e}a i koncentracije serumskog estradiola bilo kog dana pre primene HCG - human chorionic gonadotropin-a. U jednoj studiji je prona|eno da niske koncentracije estradiola na dan primene
HCG - human chorionic gonadotropin-a predvi|aju uspe{nost programa kod pacijenata sa lo{im odgovorom kod kojih je bilo manje od 4 oocita posle kontrolisane ovarijalne hiperstimulacije. Smatraju}i da izbor trenutka merenja estradiola procene funkcije ovarijuma ~ini nepouzdanim, nekoliko studija je ispitivalo vrednosti koncentracija serumskog estradiola tokom dva ili vi{e dana, bilo pre ili posle primene HCG - human chorionic gonadotropin-a. Iako su inicijalne studije izvestile da su brzina i na~in pove}avanja koncentracija estradiola tokom prve nedelje hiperstimulacije mogle predvideti uspe{nost programa, kasnije studije nisu na{le nikakvu vezu izme|u vrednosti serumskog estradiola i ishoda IVF - in vitro fertilisation. O~ito je da su koncentracije serumskog estradiola odre|ene steroidnom aktivno{}u vi{e ovarijalnih folikula, uklju~uju}i i one koji mogu biti atreti~ni, ili one koji sadr`e nezrele oocite. Moglo bi se o~ekivati da koncentracija estradiola u folikularnoj te~nosti bude bolji biohemijski marker folikularnog razvoja i potencijala oocita koji je s njim u vezi, nego koncentracije serumskog estradiola. Podaci koji se odnose na koncentracije folikularnog estrogena su, tako|e, kontraverzni kao i podaci o serumu koji su ve} izneti. U nekim radovima je utvr|ena ni`a folikularna koncentracija estradiola kod IVF - in vitro fertilisation ciklusa koji su rezultirali trudno}om, a u drugima da slobodne i ukupne koncentracije estradiola u folikularnoj te~nosti nisu u vezi sa ishodom IVF - in vitro fertilisation. Tako|e, kada je izve{tavano da je za~e}e putem IVF - in vitro fertilisation u direktnoj vezi sa povi{enim folikularnim odnosom estradiol - testosteron, drugi autori su otkrili smanjenje folikularnog odnosa estradiol-androstenedion
252
Progesteron
Podaci vezani za serumske i folikularne koncentracije progesterona su podjednako sporni. U nekoliko studija podizanje koncentracije serumskog progesterona iznad 0.9 ng/ml, 2.68 nM, pre primene HCG human chorionic gonadotropin-a je dovedeno u vezu sa neuspehom IVF - in vitro fertilisation. U drugim objavljenim studijama nisu prona|ene korelacije izme|u ishoda, procedura asistirane reproduktivne tehnologije i koncentracije progesterona, pre ili za vreme primene HCG - human chorionic gonadotropin-a. Neke studije su utvrdile da je kod pacijenata sa povi{enim vrednostima serumskog progesterona pre primene HCG - human chorionic gonadotropin-a bio pove}an procenat trudno}a. Dokazivano je da je veza izme|u prevremenog pove}anja koncentracije serumskog progesterona i neuspeha IVF - in vitro fertilisation posledica nepovoljnog delovanja progesterona na potencijal embriona da se razvija posle ~etvoro}elijskog stadijuma. Visoke koncentracije serumskog progesterona pre primene HCG - human chorionic gonadotropin-a odra`avaju adrenalnu hiperaktivnost, po{to serumski progesteron mo`e u nekim slu~ajevima da bude normalizovan primenom sinteti~kog kortikosteroida, deksametazona radi suprimiranja adrenalne funkcije, olak{avaju}i za~e}e. Primena HCG - human chorionic gonadotropin-a u roku od 24 ~asa dovedi do zna~ajnog osloba|anja progesterona iz luteiniziraju}ih granuloznih }elija in vivo. Smatralo se da ovo va`i samo u slu~aju da se koristi relativno niska doza HCG human chorionic gonadotropin-a od 5000 mIU radi podsticanja finalnog folikularnog
sazrevanja i ne va`i ako se doza HCG human chorionic gonadotropin-a pove}a na 10000 mIU. Unutar folikula ve}e koncentracije progesterona u vreme aspiracije jajnih }elija se ~ine biohemijskim prediktorom oplodnje oocita i deobe koja sledi. Me|utim, pomalo paradoksalno, visoke koncentracije folikularnog progesterona su, tako|e, dovedene u nekim istra`ivanjima u vezu sa neuspehom za~e}a putem IVF- in vitro fertilisation.
LH -luteinizing hormone
Sli~ni razli~iti podaci su dobijeni za koncentracije serumskog LH -luteinizing hormona. Dok je u novijim studijama prijavljen manji broj implantacija i trudno}a kod pacijenata sa niskim koncentracijama LH - luteinizing hormone-a i visokim odnosom FSH - follicle stimulating hormona i LH - luteinizing hormona, ranije studije su tvrdile da je smanjen broj trudno}a posledica pove}anja koncentracija serumskog LH - luteinizing hormona pre primene HCG human chorionic gonadotropin-a i pove}anim urinarnim izlu~ivanjem LH -luteinizing hormone-a. Ostale objavljene studije nisu prona{le korelaciju izme|u koncentracije serumskog LH - luteinizing hormona i bilo kog parametra IVF - in vitro fertilisation, uklju~uju}i broj oocita, procenta fertilizacija i procenta trudno}a.
253
Prolaktin
Prolaktin i njegova uloga kao mogu}eg biohemijskog prediktora IVF - in vitro fertilisation ispitivani od po~etka klini~ke primene metode. Prvi radovi su potvrdili vezu izme|u broja IVF - in vitro fertilisation trudno}a i pove}anja koncentracije prolaktina posle primene HCG-human chorionic gonadotropin-a.
prediktivnu vrednost u koncentracijama prolaktina u serumu merenih u raznim etapama kontrolisane ovarijalne hiperstimulacije.
Dve godine kasnije, 1991. godine Oda je objavio da su koncentracije prolaktina u serumu ve}e od 10 ng/ml pre primene HCG - human chorionic gonadotropin-a, u vezi sa pobolj{anom oplodnjom i brzinom deobe embriona in vitro.
Osim TGF - transforming growth factor-a, dalje su istra`ivani faktor rasta sli~an insulinu IGF - insulin like growth factor, faktor rasta koji poti~e od trombocita i epidermalni faktor rasta EGF - epidermal growth factor. Koncentracije ovih factora rasta nezavisne su od ishoda IVF- in vitro fertilisation. U nekim istra`ivanjima utvr|eno je da su pove}ane koncentracije TGF - transforming growth factor-a povezane sa procentom trudno}a.
Inhibin
Rezultati u kojima je zaklju~eno da su koncentracije inhibina u serumu pre primene HCG - human chorionic gonadotropin-a, biohemijski prediktor za~e}a u IVF - in vitro fertilisation programima
Suprotno ovome nekoliko studija sprovedenih u isto vreme nisu prona{le nikakvu
254
naru{ena su od strane nekoliko drugih studija. Nedavno je objavljeno da su povi{ene koncentracije inhibina povezane sa rezultatima samo kod onih pacijenata koji su imali relativno niske koncentracije FSH - follicle stimulating hormona. Poja~ana sinteza inhibina in vitro uzgajanih granuloza - luteinskih }elija je bila povezana sa niskim koncentracijama serumskog FSH - follicle stimulating hormona in vivo kod pacijenata od kojih su }elije izolovane. S obzirom na endokrinu ulogu inhibina u supresiji sekrecije FSH follicle stimulating hormona iz hipofize, verovatno se veze izme|u uspe{nog ishoda IVF - in vitro fertilisation i niskih koncentracija FSH - follicle stimulating hormone-a odra`ava ovarijalnom sekrecijom inhibina, {to mo`e imati lokalnu ulogu nezavisnu od gonadotropina na razvoj kompetencije oocita.
Perifolikularni vaskularitet
Sredinom 1990-ih godina, istra`iva~i su utvrdili da preovulatorni folikul koji kontroli{e nekoliko slojeva avaskularnih granuloznih }elija, mora da se pripremi za period angiogeneze da bi mogao generisati visoko vaskularizovani corpus luteum potreban za podr`avanje trudno}e. ^ui je 1997. godine izvestio o korelaciji izme|u perifolikularnog protoka krvi i trudno}e dobijenih putem IVF - in vitro fertilisation. Razvio je sistem kvantifikacije protoka krvi na periferiji folikula u vreme aspiracije oocita, koji se bazirao na merenju veli~ine periferije folikula koji je davao signal na power dopler angiogramu. Pomo}u ovog sistema merenja opisana su ~etiri stepena protoka krvi folikula, i to: prvi stepen sa najlo{ijim protokom, manjim
od 25%, dok ~etvrti stepen ima najbolji protok krvi, kada je preko 75% periferije folikula vaskularizovano. Ova prva zapa`anja su pokazala veoma zna~ajnu povezanost izme|u neuspeha za~e}a i lo{e vaskularizovanih folikula. Kod pacijenata kod kojih ni jedan od folikula nije imao bolji stepen protoka krvi od prvog i drugog stadijuma, zna~i do maksimalno 50% vaskularizacije, nije bilo trudno}a. Rezultati su pokazali procente trudno}a od 12,5% u grupi u kojoj je protok krvi bio tre}eg stepena do 61,5% u grupi u kojoj je protok krvi bio ~etvrtog stepena. Analiza podataka o embrionima iz ovih serija je podr`ala zapa`anja koja je napravio Nergund 1996. godine o vezi izme|u vaskularizacije folikula i verovatno}e oplodnje oocita. Stepen fertilizacije oocita je bio 58% iz folikula sa najlo{ijim prvim stepenom protoka krvi i 71 - 80% za folikule sa boljom vaskularizacijom. Interesantno je da najbolja fertilizacija oocita nije postignuta u grupi ~etvrtog stepena vaskularizovanosti folikula, iako razlike nisu bile zna~ajne za folikule od drugog do ~etvrtog stepena. Zna~ajno vi{e triploidnih embriona se razvilo iz oocita koji su poticali od prvog i drugog stepena vaskularizovanosti. Ova korelacija izme|u slabijeg perifolikularnog vaskulariteta i lo{eg ishoda IVF - in vitro fertilisation je potvr|ena u kasnijim studijama drugih autora. U interesantnoj Bhal-ovoj studiji su merene karakteristike protoka krvi folikula pri aspiraciji oocita. Podaci su bili analizirani u odnosu na vaskularitet folikula: dobar protok krvi tri i ~etiri ili lo{ protok krvi jedan i dva. Rezultati ove studije su potvrdili heterogenost folikula u istom
255
cohort-u kao i da perifolikularni protok krvi nije u vezi sa ostalim parametrima ciklusa kao {to su: starost pacijenta, trajanje neplodnosti, trajanje stimulacije ili doze FSH - follicle stimulating hormona. Kada se analizirao broj trudno}a na temelju vaskularnosti folikula od kojih su poticali izabrani embrioni za transfer, pokazao je zna~ajno ve}i broj trudno}a od 34,7% iz grupe dobro vaskularizovanih folikula, u pore|enju sa ciklusima u kojima su embrioni poticali od folikula sa srednjim vaskularitetom od 23,5% i od folikula sa lo{ijim vaskularitetom od 7,3%. U jednoj od studija smanjivanje pituitarne osetljivosti je ostvareno kratkom regulacijom pomo}u GnRH - gonadotropin releasing hormon analoga i ovarijskom stimulacijom pomo}u rFSH - rekombinantni folikul stimuliraju}i hormona ili HMG human menopausal gonadotrophin-a. Egzogeni HCG - human chorionic gonadotropin je dat da inicira folikularno sazrevanje kada su jedan ili dva folikula imali srednji pre~nik ve}i ili jednak 16 mm, a perifolikularni vaskularitet je meren u vreme aspiracije, 34 - 37 ~asova posle davanja HCG - human
chorionic gonadotropin-a. Ciklusi su bili grupisani prema vaskularnim karakteristikama folikula. Grupu A su ~inili folikuli sa dobrim protokom krvi, grupa B su bili heterogeni folikuli sa dobrim i lo{im protokom krvi, grupu C su ~inili folikuli sa lo{im protokom krvi. Rezultati su ponovo pokazali zna~ajnu korelaciju izme|u perifolikularnog protoka krvi i trudno}a. Najve}i broj trudno}a od 57% je bio u grupi u kojoj su svi folikuli imali dobar protok krvi, dok je zna~ajno manje trudno}a bilo u grupi folikula sa pome{anim protokom krvi 32%, a 11% gde su svi folikuli imali lo{ protok krvi. Ova studija je kasnije pokazala na zna~ajnu vezu izme|u perifolikularnog protoka krvi i vi{estruke trudno}e. Zna~ajno vi{e vi{estrukih trudno}a je bio u slu~ajevima kod kojih su folikuli imali dobar protok krvi u trenutku aspiracije. Veza izme|u protoka krvi i vi{estruke trudno}e je kasnije potvr|ena podacima iz istog centra analizom trudno}a iz programa ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. U svojoj studiji je Gregory prikazala slede}e rezultate:
Perifolikularni vaskularitet Protok krvi 3- 4 Protok krvi 1-2 Protok krvi nije zabele`en
256
U ovoj seriji uzastopnih ICSI - intra citoplasmatic sperm injection ciklusa su primenjeni standardni protokoli ovarijalne stimulacije i tehnike kultivacije embriona. U pribli`no 50% ciklusa nisu zabele`ene karakteristike protoka krvi. Ovi ciklusi su pokazali broj trudno}a od 32% i broj vi{estrukih trudno}a od 15%. Me|utim, u slu~ajevima u kojima su informacije o perifolikularnom protoku krvi kori{}ene za selekciju embriona za transfer, otkriveno je da je broj trudno}a bio zna~ajno ve}i kod ciklusa u kojima su embrioni poticali od folikula sa dobrim protokom krvi, i to, 47%, sa brojem vi{estrukih trudno}a koji je, tako|e, bio zna~ajno ve}i od 42%. Tamo gde su selektirani embrioni za transfer poticali od folikula sa lo{im protokom krvi, broj trudno}a je bio zna~ajno manji, 26%, dok vi{estrukih trudno}a nije bilo. Ovi podaci potvr|uju potencijal koji perifolikularni protok krvi mo`e da pru`i kao objektivni marker za kvalitet embriona. Perifolikularni vaskularitet nije uniformno izra`en u cohort-u folikula, {to vodi ka zaklju~ku da se razvoj perifolikularnog vaskulariteta reguli{e doga|ajima u folikulu. Ovo dalje sugeri{e da merenje karakteristika protoka krvi ovarijalnih krvnih sudova, verovatno, nije prognosti~ki indikator za~e}a, jer merenje protoka ovarijalne arterije i stromalni protok ne dozvoljavaju identifikaciju folikularne heterogenosti. Pokazalo se da je perifolikularni vaskularitet povezan sa koncentracijom rastvorenog kiseonika u folikularnoj te~nosti FF follicle fluid-a i sa aneuploidno{}u oocita. Ultrazvu~nom sonografijom kolor doplerom merene su karakteristike protoka krvi folikula pre aspiracije, a potom je odre|ivan rastvoreni kiseonik u FF - follicle fluid-u. Tamo gde je bilo neophodno FF - follicle fluid je centrifugiran da bi se uklonila crvena krvna zrnca.
257
Sl. 4.67- VEGF - vascular endothelial growth factor receptori u }elijama zeleno prebojeni
U nekim studijama nije potvr|ena veza izme|u folikularnih nivoa VEGF - vascular endothelial growth factor-a i ishoda IVF in vitro fertilisation, dok je u drugima utvr|eno da su visoki folikularni nivoi VEGF - vascular endothelial growth factor-a u direktnom odnosu sa niskim brojem trudno}a. Visoki nivoi u serumu VEGF - vascular endothelial growth factor-a mogu predvideti pojavu sindroma ovarijalne hiperstimulacije po nekim autorima. Statisti~ki zna~ajna veza izme|u koncentracija rastvorenog kiseonika i abnormalne morfologije oocita je, tako|e, povezana sa slabijom deobom. Meren je VEGF - vascular endothelial growth factor u FF follicle fluid-u u svakoj od tri grupe folikula i utvr|ena koncentracija u opsegu od 130 - 180 pM. Koncentracija VEGF - vascular
endothelial growth factor-a nije bila u vezi sa lokalizacijom folikula, veli~inom ili volumenom fluida. Kod folikula sa rastvorenim kiseonikom do 3%, koncentracije VEGF - vascular endothelial growth factor-a su bile ve}e od 270 pM. Koncentracije VEGF - vascular endothelial growth factor-a su bile promenljivije kod folikula sa manjim koncentracijama rastvorenog kiseonika i bile su stalno niske kod folikula sa oocitima izmenjene gra|e. Koncentracije VEGF - vascular endothelial growth factor-a u FF- follicle fluid-u pokazuju uzajamnu vezu sa nalazima perifolikularnog protoka krvi. Oociti koji se nisu fertilisali, dobijeni iz folikula sa niskim koncentracijama rastvorenog kiseonika, pokazivali su rasipanje hromozoma ili abnormalno svrstavanje hromozoma na deobnom vretenu. Utvr|eno je da 92% oocita koji ispoljavaju hromozomske abnormalnosti poti~u od folikula sa koncentracijom rastvorenog kiseonika do 3%. Analizirana je uloga kumulusa merenjem ekspresije VEGF - vascular endothelial growth factor-a u intervalima tokom 14 dana. Ova studija je pokazala da su }elije kumulusa, razbacane in vitro delovanjem spermatozoida, imale kapacitet da proizvedu VEGF - vascular endothelial growth factor u kulturi tokom produ`enog perioda, kao {to je prikazano u slede}oj tabeli.
Tabela 4-15: Koncentracije VEGF - vascular endothelial growth factor u medijumu kulture kumulusa po Gregory - u
Dan uzimanja uzorka Uzimanje jaja{ca + 1 dan Uzimanje jaja{ca + 7 dana Uzimanje jaja{ca + 14 dana
Koncentraceje VEGF 250 - 2000 pg/ml 108 - 3300 pg/ml 150 - 2000 pg/ml
258
Tabla 4-16: Serijsko merenje VEGF - vascular endothelial growth factor -a u medijumu individualnih kultura kumulus kompleksa koji su u vezi sa odabranim embrionima za transfer u IVF - in vitro fertilisation programu (Georgy 2001.)
Perifolik- Morfologija ularni embriona protok pri transferu krvi GRADE 1 GRADE 2 GRADE 3 4 }elije C+ 4 }elije B/C 4 }elije C+
Otkriveno je da su se koncentracije razlikovale me|u uzorcima iz razli~itih kultura. Uzrok je bio delom zbog razlika u broju }elija prisutnih u svakoj kapljici, po{to se broj }elija menjao od jednog do drugog slu~aja. Zna~ajnija je bila promena vezana za vreme produkcije VEGF - vascular endothelial growth factor-a u }elijama kumulusa individualnih kompleksa, {to je prikazano u Tabeli br 4-16. Kada su vr{ena merenja koncentracija VEGF - vascular endothelial growth factor- a u medijumu pojedina~nih kompleksa kumulusa iz istog cohort-a, zapa`ene su zna~ajne razlike u aktivnosti }elija razvijenih u istoj hormonalnoj sredini. Podaci u gornjoj tabeli se odnose na komplekse kumulusa koji su u vezi sa tri embriona odabrana za transfer u jednom ciklusu, a koji su rezultirali trudno}om. Ovo pokazuje da je jedan kompleks CC2 - cumuluc complex bio povezan sa oocitom dobijenim iz folikula sa dobrim protokom krvi, stepen 3, dok su druga dva dobijena iz folikula sa lo{im protokom krvi, stepen 2. Merenja
VEGF - vascular endothelial growth factor-a, posle jednog dana od punkcije oocita, se nisu zna~ajno razlikovala izme|u tri }elijska sistema. Me|utim, }elije CC2 - cumuluc complex-a, dobijene iz folikula sa najboljim protokom krvi, su proizvele mnogo ve}e koncentracije VEGF - vascular endothelial growth factor-a, tokom perioda od 10 dana pod identi~nim uslovima kultivisanja, u odnosu na ostale sisteme. ]elije iz CC2 cumuluc complex-a su imale kapacitet da odr`e visoke koncentracije VEGF - vascular endothelial growth factor-a in vitro i do 10 dana. ]elije iz CC1 - cumuluc complex-a i CC3 - cumuluc complex-a, koje su inicijalno pokazale rast produkcije VEGF - vascular endothelial growth factor-a do 3. dana, ispoljile su pad VEGF vascular endothelial growth factor-a do 10. dana. Kapacitet }elija kumulusa da proizvdi VEGF - vascular endothelial growth factor nije prekinut pri ovulaciji. Embrioni ovih }elijskih sistema su se razvili do ~etvoro}elijskog stadijuma, do trenutka transfera na drugi dan i zapa`eno je da su imali veoma sli~nu morfologiju.
259
Svi su pokazali minimalnu fragmentaciju, zabele`enu kao C/C+ kod jednog iz CC2 cumuluc complex-a koji je imao malu razliku u relativnoj veli~ini jedne blastomere, pa je zato zable`en kao B. Karakteristike protoka krvi i produkcija VEGF - vascular endothelial growth factor-a nisu se odrazile na stepen deobe i morfologiju embriona posle dva dana kultivacije. Ova zapa`anja su potvrdila ranije izve{taje da folikularni markeri nisu u korelaciji sa stepenom fertilizacije, niti sa morfologijom embriona na drugi dan. Postoji negativna korelacija izme|u folukularnog protoka krvi i deobe embriona na tre}i dan. Pri procenjivanju dinami~kog sistema, kao {to je folikul ili embrion koji je u razvoju, zapa`anja istog doga|aja napravljena u razli~itim trenucima mogu dati o~igledno kontradiktorne rezultate. Vrednosti perifolukularnog protoka krvi merene power doplerom menjaju se sa pribli`avanjem folikula ovulaciji kao i sa raspadom tekalnog sloja. Prema tome, u zavisnosti od trenutka merenja perifolikularnog protoka krvi u odnosu na ovulaciju, mogu}a je pogre{na interpretacija nalaza. Najbolji dokaz za perifolikularni vaskularitet je dobijen kada je obavljeno dopler skeniranje posle, ne vi{e od 34 ~asa od davanja HCG - human chorionic gonadotropin-a. Promene u tekalnom sloju pribli`avanjem ovulacije, naro~ito na apex-u folikula, rezultuju raskidanjem kapilarnog sistema i promenama protoka krvi. Progresivne promene folikula koji sazreva, od rane antralne do ovulatorne faze, pra}ene promenama u aktivnosti folikularnih }elija granuloze i kumulusa uti~u na sastav FF- follicle fluid-a. Promene perifolikularnog vaskulariteta se de{avaju u veoma kratkom vremenskom intervalu.
Postoji folikularna heterogenost u odnosu na karakteristike perifolikulrnog protoka krvi, kao i u odnosu na kapacitet }elija kumulusa, da proizvedu VEGF - vascular endothelial growth factor tokom kultivacije. Kapacitet postovulatornih }elija kumulusa da proizvedu VEGF - vascular endothelial growth factor u kulturi je u korelaciji sa perifolikularnim vaskularitetom, ali nije bio u vezi sa razlikama u kvalitetu embriona. Jedno od najzna~ajnijih zapa`anja koja su proiza{la iz studija je dokaz za heterogenu ekspresiju protoka krvi izme|u susednih folikula u jednom jajniku. Ovo je jasna potvrda da je svaki folikul jedinstven biosistem koji oocitu pru`a specifi~nu mikrosredinu tokom njegovog razvoja. Ovaj biosistem funkcioni{e nezavisno od spolja{njih faktora, kao {to je primena egzogenih gonadotropina. Neovaskularizacija CL - corpus luteum-a je pod kontrolom heparinskih faktora, naro~ito VEGF-vascular endothelial growth factor-a i faktora rasta fibroblasta koje proizvode }elije koje poti~u od granuloze corpus luteuma. Angiogeneza u corpus luteumu je bila predmet posebnog izu~avanja. Inhibicija bioaktivnosti VEGF- vascular endothelial growth factor-a je rezultat supresije angiogeneze CL- corpus luteum-a i osloba|anja progesterona. VEGF - vascular endothelial growth factor je }elijski endotelijalni specifi~ni mitogen za koji se zna da je medijator fetalne i tumorne angiogeneze i pokazalo se da je ekspresija VEGF - vascular endothelial growth factor-a mRNK - messenger ribonucleic acid-a u vezi sa proliferacijom krvnih sudova. VEGF - vascular endothelial growth factor nije jedini faktor za inicijaciju angiogeneze u antralnom folikulu i CL - corpus luteum-u.
260
Leptin, za koji se pokazalo da potpoma`e angiogenezu in vitro je prisutan u folikularnoj te~nosti i ima angiogensku ulogu u folikulu. Perifolikularni protok krvi je u vezi sa formiranjem corpus luteuma i razvojem njegove vaskularizacije. Programi donacije oocita u kojima su recipijenti doniranih oocita ili embriona pripremljeni za transfer embriona kombinacijom egzogenog estradiola i progesterona pokazuju da corpus luteum nije neophodan za odr`avanje trudno}e U ciklusima transfera zamrznutog embriona u kome se pacijenti pripremaju za transfer upotrebom pituitarne regulacije pomo}u analoga GnRH - gonadotropin releasing hormon-a i endometrijuma pripremljenog kombinacijom egzogenog estradiola i progesterona, pokazuje da funkcionalni CL -corpus luteum nije neophodan za implantaciju. Zapa`anje da }elije kumulusa u in vitro uslovima proizvede VEGF - vascular endothelial growth factor tokom 14 dana, mo`e biti od zna~aja. Cikli~na progresija angiogeneze u jajniku ka angiogenezi u endometrijumu, na mestu implantacije je neophodna. ]elije kumulusa mogu da imaju ulogu u inicijaciji angiogenskih doga|aja u uterusu koji prate implantaciju. Opisana je subpopulacija }elija kumulusa koje blokiraju faktore rasta. Na ovaj na~in }elije kumulusa mogu da koncentri{u faktore rasta radi tempiranog osloba|anja kada to bude potrebno. Tako bi }elije kumulusa, koje poti~u od dobro vaskularizovanih folikula mogle potpomo}i implantaciju osloba|anjem ovih faktora koji iniciraju rane angiogene promene u endometrijumu.
Uloga endometrijalnog i subendometrijalnog protoka krvi merenog pomo}u trodimenzionalnog power dopler ultrazvuka u predvi|anju trudno}e tokom IVF - in vitro fertilisation tretmana u jednom od istra`ivanja, odre|ivala se merenjem na sam dan aspiracije oocita. Merena je debljina endometrijuma, endometrijalnog indeksa pulsiranja, PI pulsatility index, indeksa otpora RI - resistance index krvnih sudova uterusa, volumena endometrijuma, indeksa vaskularizacije VI - vascularization index, indeksa protoka FI - flow index i VFI - vaskularnog indeksa protoka endometrijalnih i subendometrijalnih regija. Rezultati su pokazali da su uterini RI resistance index, endometrijalni VI - vascularization index i VFI - vascularization index protoka zna~ajno ni`i kod grupe gravidnih `ena u odnosu na grupu `ena koje nisu ostale trudne. Broj transferisanih embriona i endometrijalni VI - vascularization index su bili jedina dva faktora predikcije trudno}e. Analiza krive ROC - reciever operator characteristic je otkrila da je povr{ina ispod krive bila pribli`na 0,5 za sve parametre endometrijalne receptivnosti. Pokazalo se da endometrijalni i subendometrijalni protok krvi, meren power dopler ultrazvukom, nisu dobri prediktori trudno}e.
Citokini
Citokini su polipeptidi ili glikopeptidi koji prenose informacije izme|u }elija. Ishod IVF - in vitro fertilisation nije u vezi sa folikularnim koncentracijama IL - interleucin-a; IL-6, IL-8, IL-10, IL-11 ili granulocitno makrofagnog faktora stimulacije kolonija GM-CSF - granulocyte macrophage colony stimulating factor.
261
Pove}ana folikularna koncentracija proinflamantornog citokina IL-13 je povezana sa uspe{nom oplodnjom oocita, deobom embriona i trudno}om.
modulatora ovarijalne funkcije kao prediktora ishoda IVF - in vitro fertilisation, potencijalni kandidat za biohemijskog prediktora je adrenalni steroidni hormon, kortizol.
Kortizol
Kortizol, ~iji je klini~ki naziv hidrokortizon, sinteti{e se u adrenalnom korteksu. Adrenalne `lezde sinteti{u dve klase steroidnih hormona, mineralokortikoide i glukokortikoide. Kortizol se sinteti{e od progesterona sekvencijalnim dodavanjem 3-hidroksilne grupe na pozicije ugljenika 17, 21 i 11, {to je prikazano na slede}oj slici. Zbog njihovih sli~nih hidrofobnih struktura, kortizol i progesteron se transportuju u serumu vezani za globularni protein, kortizol vezuju}i globulin CBG - corticosteroid binding globulin.
262
Kortizol, kao svi steroidni hormoni, vr{i svoj uticaj preko intracelularnog receptora koji deluje na transkripciju i stabilnost mRNK - messenger ribonucleic acid-a, kodirane ciljnim genima. Sli~nost molekularne strukture kortizola i progesterona se odra`ava u sli~nosti njihovih receptora. Ova dva receptora se vezuju za identi~ne DNK - deoksiribonukleinska kiselina sekvence za regulisanje transkripcije ciljnih gena, pa su kortizol i progesteron sposobni da izvr{e izvestan broj zajedni~kih akcija na }elijskom i molekularnom nivou. U istra`ivanjima je utvr|eno da kortizol u~estvuje u lokalnoj kontroli ovarijalne funkcije. Kod `ena koje su se podvrgle asistiranom za~e}u, koncentracije folikularnog kortizola pove}avale su se sa pribli`avanjem rupture folikula. Zna~aj ovog fenomena jo{ je uvek nejasan.
Neke studije su utvrdile prisustvo ve}ih koncentracija kortizola u folikulima koji sadr`e zrele oocite, dok drugi nisu prona{li nikakvu vezu izme|u ovog glukokortikoida i zrelosti oocita. ^ini se da koncentracije folikularnog kortizola ne predvi|aju uspe{nu oplodnju oocita.
263
dostupnost kortizola, ugro`avaju}i sposobnost kortizola da u|e u ciljne }elije i interreaguje sa glukokortikoidnim receptorima. Ova situacija se komplikuje ~injenicom da CBG - corticosteroid binding globulin vezuje i kortizol i progesteron. Zbog visokih koncentracija progesterona u folikularnom fluidu, samo mali deo kortizola unutar ovarijalnog folikula ostaje zadr`an od strane CBG - corticosteroid binding globulin-a, tako da umereno pove}anje koncentracije CBG - corticosteroid binding globulin-a mo`e imati malo ili nimalo uticaja na slobodnu bioaktivnu koncentraciju kortizola. Kao {to je ve} pomenuto, steroidni hormoni deluju vezivanjem za intracelularne receptore koji mogu da interreaguju sa DNK - deoksiribonukleinskom kiselinom i i-RNK, informacionom RNK, stimuli{u}i sintezu proteina kod ciljnih }elija. Iako struktura steroidno vezivnog domena svakog receptora postavlja izvesna ograni~enja za tipove steroida koji se mogu vezivati za receptor i aktivirati ga, ovaj sistem specifi~nosti receptora je sklon neuspehu. Na primer, in vitro mineralokortikoidni receptor nije sposoban da napravi razliku izme|u strukture fiziolo{kog mineralokortikoida aldosterona, bitnog za kontrolu
ravnote`e vode i elektrolita i glukokortikoida kortizola. U ovakvim slu~ajevima je potreban dodatni mehanizam za pove}anje specificnosti interakcije izme|u receptora i kandidatnih liganda. Ovo obi~no uzima formu jednog ili vi{e intracelularnih enzima koji modifikuju strukturu steroida i tim putem pove}avaju ili smajuju njegov afinitet ka vezivnom domenu receptora. Ako su enzimi koji {tite receptore steroida ugro`eni na bilo koji na~in, postoji pove}ano vezivanje steroida ~ak i za neodgovaraju}e receptore i poja~ano dejstvo na ekspresiju ciljnih gena.
Sl. 4.72- Me|ukonverzija kortizol - kortizon putem kloniranih izoformi 11 HSD - 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze
264
Ovi enzimi katali{u reverzibilno uklanjanje dva jona vodonika konvertuju}i aktivni steroidni kortizol sa njegovim inertnim metabolitom kortizonom kao {to je prikazano na prethodnoj slici. Po~etkom 90-ih godina enzimska oksidacija kortizola u kortizon je prvi put otkrivena kod humanih granuloza - luteinskih }elija aspiriranih iz folikula `ena koje su se podvrgle IVF - in vitro fertilisation.
Sl. 4.73- 11 HSD - 11-hydroxysteroid dehydrogenaze mRNK - messenger ribonucleic acid ovarijuma in situ hibridizacija: T - tekalne ovarijalne }elije; G - granulozne }elije
Ubrzo nakon toga pojavio se rad o potencijalno prediktivnoj vezi izme|u stepena oksidacije kortizola u kojoj posreduje 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze i ishoda IVF - in vitro fertilisation. U studijama o aktivnosti enzima 11 HSD - 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze su odre|ivane, in vitro kvantifikacijom, neto oksidacije 3H-kortizola u 3H kortizon tokom 4 ~asa. Dok su }elije kod 2/3 pacijenata ispoljavale umerene i visoke nivoe aktivnosti 11 HSD -11 -hydroxysteroid dehydrogenaze enzima, kod 1/3 pacijenata }elije su imale veoma niske nivoe aktivnosti 11 HSD - 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze, ispod granice detekcije. S obzirom na to, da kod nijednog od pacijenata, sa ovarijalnom aktivno{}u 11 HSD -11 -hydroxysteroid dehydrogenaze
koja se mo`e detektovati, nije kasnije do{lo do za~e}a, niski nivoi aktivnosti enzima 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze su dovedeni u vezu sa procentom trudno}e od 64%. Posle objavljivanja ovih ohrabruju}ih podataka, dve nezavisne istra`iva~ke grupe su ispitivale ovu potencijalno prediktivnu vezu. Iako ni jedna od ovih grupa nije na{la zna~ajnu korelaciju izme|u ovarijalne aktivnosti 11 HSD - 11 hydroxysteroid dehydrogenaze i ishoda IVF - in vitro fertilisation, prethodna studija je pokazala da su srednje vrednosti metabolizma kortizola najmanje u onim ciklusima koji su rezultovali trudno}om, a najvi{i u ciklusima sa neuspe{nom fertilizacijom. Umerene vrednosti aktivnosti enzima su bile u ciklusima u kojima nije bilo za~e}a. Razlike u metodama kori{}enim za procenu ovarijalne aktivnosti 11 HS - D11 hydroxysteroid dehydrogenaze su imale uticaj na rezultate ove korelacije. Na primer, u jednoj studiji granulozne }elije su bile zamrznute u vreme folikularne aspiracije, a aktivnost enzima je kasnije ispitivana kod odmrznutih }elija. Podaci jednog broja laboratorija ukazuju da su 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze enzimi osetljivi na proceduru krioprezervacije, pa je ovo moglo ugroziti merenja ovarijalnih aktivnosti 11 HSD 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze. U inicijalnim studijama ovarijalne aktivnosti 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze medijum je ~uvan pri temperaturi od 4 C tokom tri dana pre upotrebe. Posle separacije u Percoll-u granulozne }elije su kultivisane tokom tri dana u medijumu sa dodatnim serumom radi olak{avanja ponovnog formiranja luteiniziranog fenotipa pre procene aktivnosti 11 HSD 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze, koja je ra|ena ~etvrtog dana kultivacije.
265
Kada je ra|ena procena ovarijalne aktivnosti 11 HSD - 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze kod sve`e izolovanih granuloznih }elija i bez prethodne kultivacije }elija radi olak{avanja luteinizacije, nije prona|ena nikakva veza izme|u aktivnosti enzima i uspeha IVF - in vitro fertilisation. Kultivacija granuloznih }elija u prisustvu seruma tokom tri dana pre procene enzima primetno smanjuje stepen oksidacije kortizola u kojoj posreduje 11 HSD - 11 hydroxysteroid dehydrogenaza. Smatra se da se pad ovarijalne aktivnosti 11 HSD - 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze sa prihranjivanjem ili uzgajanjem granuloznih }elija ~ini neophodnim za otkrivanje veze izme|u in vitro merenja aktivnosti 11 HSD - 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze i ishoda IVF - in vitro fertilisation. Krajem 1990-ih godina, posle kloniranja dva odre|ena izoforma enzima 11 HSD -11 - hydroxysteroid dehydrogenaze ~oveka jedan broj molekularnih studija je doprineo debati koja se ti~e potencijalne prediktivne uloge enzima 11 HSD -11 hydroxysteroid dehydrogenaze u IVF - in vitro fertilisation programu. Istra`ivanja su utvrdila da se kod granuloznih }elija dominantni izoform enzima menja. Pre izlaganja LH - luteinizing hormone / HCG - human chorionic gonadotropin, granulozne }elije izbacuju mRNK - messenger ribonucleic acid enkodiranjem izoforma 11 HSD2 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze 2, koji je veoma sli~an 11 HSD - 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze i koji, tako se~eni, deluje samo kao oksidazni enzim putem NAD - nikotinamide adenine dinukleiotide kao enzimskog kofaktora. Posle izlaganja HCG - human chorionic gonadotropin-u, luteiniziraju}e granulozne }elije vi{e ne izbacuju 11 HSD2 - 11 -hydroxysteroid
dehydrogenaze 2, ve} izbacuju gene enkodiraju}i 11 HSD1 - 11 - hydroxysteroid dehydrogenazu, relativno niske sli~nosti sa 11 HSD -11 -hydroxysteroid dehydrogenazom. ^ini se da ovaj izoform deluje nadmo}no kao reduktazni enzim sa predno{}u u odnosu na NADP - nikotinamide adenine dinucleotide phosphate, kao kofaktora. Podaci iz drugih laboratorija podupiru osloba|anje 11 HSD1 - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze 1 kod luteiniziraju}ih granuloznih }elija, ali ukazuju na postojanje novog, biohemijski osobenog izoforma 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze kod granuloznih luteinskih }elija. Molekularnom zamenom izoforma enzima 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze, dok se granulozne }elije luteiniziraju u preovulatornim folikulima, mo`e se objasniti zapa`anje potencijalne prediktivne veze izme|u oksidativne aktivnosti 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze i ishoda IVF - in vitro fertilisation. Po{to su inicijalna ispitivanja aktivnosti 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze merila neto oksidacije kortizola u kortizon, za nivoe metabolizma kortizola bi se o~ekivalo da budu najvi{i kod granuloznih }elija nezrelih folikula, osloba|aju}i oksidativni 11 HSD2 - 11 hydroxysteroid dehydrogenaze 2 izoform sa samo ograni~enim osloba|anjem 11 HSD1 - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze enzima i supresijom 11 HSD2 - 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze 2. Istovremeno pove}anje redukcije kortizona, pra}eno smanjenjem u oksidaciji kortizola, koje se odrazilo kao ukupno smanjenje neto oksidacije kortizola u kortizon, pokazuje biohemijski marker folikularne zrelosti. Godine 1996. istra`iva~i iz Edinburga su izvestili o produkciji transgenskih mi{eva koji nemaju 11 HSD1 - 11 - hydroxysteroid
266
dehydrogenazu. Bez obzira na odsustvo ovog enzima, ovi mi{evi su pokazali normalan fertilitet, pa su neki istra`iva~i po~eli da ispituju reproduktivni zna~aj 11 HSD 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze u jajniku. Jedan od bitnih problema ciljnog brisanja gena je da jedan, ili vi{e proteina koji su povezani sa brisanjem, mogu prisvojiti ulogu produkta obrisanog gena i tako kompenzovati hroni~no odsustvo obrisanog proteina. U ovom specifi~nom primeru 11 HSD2 - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze 2 i za sada neklonirani izoformi 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze su mo`da preuzeli biohemijsku funkciju obrisanog proteina 11 HSD1 -11 hydroxysteroid dehydrogenaze 1. O~igledno da bi mi{evi sa oba obrisana klonirana izoforma 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze u~estvovali u ovom razmatranju, ali svi dosada{nji poku{aji da se proizvedu ovakve `ivotinje nisu bili uspe{ni, {to pokazuje da dvostruki nokaut mo`e biti embrionski smrtonosan. Drugi problem le`i u pretpostavci da bi hroni~no genomsko brisanje proteina 11 HSD - 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze u jajniku, moglo modelirati prirodne okolnosti pod kojima su ovarijalne aktivnosti 11 HSD 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze niske. Niske aktivnosti enzima merenih kod ljudskih granuloza - luteinskih }elija, odra`avaju prisustvo lokalnih enzimskih inhibitora koji uti~u na ishod IVF - in vitro fertilisation koji je nezavistan od supresije metabolizma glukokortikoida u kome posreduje 11 HSD - 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze. Sa dobijanjem novih podataka, ~ini se sve verovatnijim da je u inicijalnim studijama oksidacija kortizola u kortizon bila
surogatni marker drugih ovarijalnih doga|aja koji ne bi bili reprodukovani transgenskim nokautom jednog izoforma 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze. Zbog velikih razlika u reproduktivnoj biologiji izme|u glodora i primata, isklju~ivanje uloge 11 HSD1 - 11 hydroxysteroid dehydrogenaze 1 u fertilitetu mi{eva ne isklju~uje i ulogu kod ~oveka. Povratkom na istra`ivanja humane IVF - in vitro fertilisation, kasnije studije su otkrile da su nivoi osloba|anja mRNK messenger ribonucleic acid enkodiraju}i 11 HSD1 - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze1 kod granuloznih }elija u korelaciji sa verovatno}om za~e}a kod `ena koje su se podvrgle IVF - in vitro fertilisation. Nivoi mRNA - messenger ribonucleic acid se ne moraju obavezno poravnati sa nivoima enkodiranog enzimskog proteina i aktivnostima enzima. Sumirani podaci podr`avaju hipotezu da potencijalno prediktivna veza ovarijalne kortizol - kortizon me|ukonverzije i ishoda IVF - in vitro fertilisation, samo zapa`ene pod definisanim uslovima, odra`ava ovarijalne doga|aje koji kontroli{u aktivnost enzima 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze, verovatno na posttranslacionom nivou. Unutar Leydig-ovih }elija testisa, enzim 11 HSD1 - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze 1 obavlja klju~nu ulogu u prevenciji inhibicije biosinteze testosterona pomo}u glukokortikoida. Kao {to je spomenuto u ovom poglavlju, }elije testisa sekretuju sli~an izoform 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenazi, srodan biohemijskoj aktivnosti zapa`enoj kod granuloza luteinskih }elija. Metabolizam kortizola, u kome posreduje 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze je dokazan kod spermatozoida i drugih }elijskih komponenti semene tecnosti.
267
Kod oksidativne aktivnosti 11 HSD 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze u spermi sa niskim brojem spermatozoida i visokim procentom morfolo{ki abnormalnih formi otkriveno je da su deset puta ve}e nego kod onih uzoraka sa ve}im brojem spermatozoida i dobrom morfologijom. Niska neto konverzija kortizola u kortizon u gonadalnim }elijama, bilo u germinativnim ili somatskim }elijama, mo`e indicirati bolji ishod IVF - in vitro fertilisation. U drugim studijama o ovarijalnim aktivnostima 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze in vitro, poku{ano je da se proceni aktivnost in vivo merenjem koncentracija kortizola i kortizona u folikularnoj te~nosti. In vivo ovarijalna aktivnost 11 HSD - 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze trebalo bi da se odra`ava folikularnim odnosom kortizol - kortizon. Pretpostavljaju}i da je kortizol nadmo}ni enzim supstrat, a da je kortizon glavni enzim produkt, visok odnos kortizol - kortizon bi pokazivao nisku ovarijalnu aktivnost 11 HSD 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze, dok nizak odnos kortizol - kortizon bi trebao da odra`ava velike brzine oksidacija kortizola ovarijalnim enzimom 11 HSD - 11 hydroxysteroid dehydrogenaze. Neke studije su pokazale da su folikularni odnosi kortizol - kortozon zna~ajno ve}i kod folikularne aspiracije u uspe{nim ciklusima IVF - in vitro fertilisation, nego kod onih uzoraka folikularne te~nosti dobijenih iz ciklusa bez trudno}e, srednji odnosi 9,7, naspram 6,9. U proceni ishoda IVF - in vitro fertilisation, folikularni odnos kortizol - kortizon ve}i od 7 je dobijen u grupi `ena sa trudno}ama od skoro 50%, a ovarijalni odnos manji od 7,7 u grupi `ena sa trudno}ama od samo 7,6%. Ovi podaci podupiru potencijalno prediktivnu, inverznu korelaciju izme|u
metabolizma kortizola u kome posreduje 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze i verovatno}e za~e}a putem IVF in vitro fertilisation. Do danas su sve sprovedene studije koristile uzorke dobijene iz ciklusa IVF stimulisanih gonadotropinom. Kako se pokazalo da LH - luteinizing hormone i HCG - human chorionic gonadotropin pove}avaju ekspresiju 11 HSD1 - 11 hydroxysteroid dehydrogenaze 1, na odnos kortizol - kortizon su uticali dati lekovi. Sli~ni podaci su nedavno dobijeni u studijama o folikularnom odnosu kortizol kortizon kod `ena koje su se podvrgle prirodnom ciklusu IVF - in vitro fertilisation. Navedeni odnosi su bili ve}i kod onih IVF - in vitro fertilisation ciklusa koji su rezultovali trudno}om, a najni`i kod onih kod kojih nije uspela fertilizacija oocita. Folikuli sa odnosima kortizol - kortizon ve}im od srednje vrednosti od 5,9 su dovedeni u vezu sa brojem trudno}a od 58%, nasuprot samo 13% trudno}a kod onih folikula sa manjim odnosima kortizol - kortizon. Nasuprot gore navedenim studijama, u drugim studijama nije prona|ena zna~ajna veza izme|u folikularnih odnosa kortizol kortizon i ishoda IVF - in vitro fertilisation. Ovaj nalaz stvara mogu}nosti da na vezu izme|u in vivo indeksa aktivnosti 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze i ishoda IVF - in vitro fertilisation, mogu uticati male razlike u klini~kom tretmanu, ili protokolima {to je slu~aj kod direktnih merenja ovarijalnih aktivnosti 11 HSD 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze in vitro. [to se ti~e pitanja vezanih za prediktivnu vrednost folikularnih odnosa kortizol - kortizon i ishoda IVF - in vitro fertilisation, gornja grani~na vrednost folikularnog odnosa kortizol - kortizon za sve uzorke, bez obzira na ishod IVF - in vitro fertilisation
268
je iznosila 11,2. Upadljivo je da je kod onih uzoraka u odnosima kortizol - kortizon ve}im od 11,2 bilo trudno}a, dok su kod svih uzoraka folikularne te~nosti sa odnosima kortizol - kortizon manjim od 11,2 bili neuspe{ni poku{aji. Ovi podaci daju zna~ajnu podr{ku hipotezi prema kojoj ovarijalna kortizol kortizon me|ukonverzija, posredovana u folikulu putem jednog ili vi{e izoforma 11 HSD - 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze, mo`e predvideti ishod IVF - in vitro fertilisation, samo pod definisanim okolnostima. Na kraju se postavlja pitanje za{to na direktna merenja ovarijalne aktivnosti 11 H SD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze in vitro mogu uticati:
kultivacija granuloznih }elija u medijumu dopunjenim serumom tokom tri dana pre ispitivanja enzima, ~uvanje aspirisanih }elija do 3 dana na temperaturi od 4 C u folikularnoj te~nosti ili medijumu pre izolacije i kultivacije }elija.
Poznato je da granulozne luteinske }elije sinteti{u i lu~e parakrine inhibitore metabolizma kortizola. Kandidat za lokalnu inhibiciju ovarijalne aktivnosti 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze bi bio progesteron koji je glavni produkt lu~enja luteiniziraju}ih granuloznih }elija i koji je provereni inhibitor kloniranih izoforma 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze, naro~ito 11 HSD2 - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze 2. Po{to se sinteza ovog steroida progresivno pove}ava dok se granulozne }elije luteiniziraju tokom 3 dana u medijumu sa serumom, serum-supplemented medium, rastu}a produkcija progesterona se mo`e pripisati smanjenju brzine metabolizma kortizola utvr|enog kod granuloznih }elija tokom prva tri dana kultivacije.
Ova hipoteza je proverena suprimiranjem bazalne sekrecije progesterona iz kultivisanih granuloznih }elija pomo}u citohromnog P450 enzimskog inhibitora aminoglutethimida. S jedne strane blokiranje sinteze progesterona podi`e ovarijalnu aktivnost 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze potvr|uju}i da progesteron deluje kao lokalni inhibitor kortizol - kortizon me|ukonverzije kod kultivisanih granuloznih luteinskih }elija. S druge strane, ~ak i granulozne }elije kontinuirano inkubirane sa aminoglutethimidom izazivaju progresivan pad nivoa aktivnosti 11 HSD -11 - hydroxysteroid dehydrogenaze s obzirom na pove}anje ekspresije proteina 11 HSD 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze, {to pokazuje da te }elije sigurno proizvode jo{ neki enzimski inhibitor, osim progesterona. Granuloza luteinske }elije proizvode parakrine inhibitore aktivnosti 11 HSD 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze za vreme kultivacije. Trenutno se ispituje da li su ovi modulatori enzima prisutni u folikularnoj te~nosti u kojoj su granuloza luteinske }elije ~uvane tokom tri dane pre separacije. Da bi obogatili bilo koji inhibitor enzima prisutan u folikularnoj te~nosti, usvojen je metod da se rastvore endogeni inhibitori 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze iz urina. Uzorci folikularne te~nosti su stavljeni u C18 Seppak homatografske kertrid`e, iz kojih se jedinjenja rastu}e hidrofobnosti, jedno za drugim, ispiraju rastvorom sa rastu}om koncentracijom metanola. Svaki deo se potom testira da bi se videlo da li ima sposobnost da moduli{e bilo NADP+ nicotinamide adenine dinucleotide phosphate ili NADP- - nicotinamide adenine dinucleotide phosphate zavisnu oksidaciju kortizola pomo}u homogenata iz bubrega
269 zavisne aktivnosti 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze ~ak do 2,7 puta u roku od 1 ~asa. Kako je otkriveno da folikularna te~nost sadr`i endogene stimulanse i inhibitore aktivnosti 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze, teku}a istra`ivanja se okre}u pitanju da li nivoi ovih jedinjenja odre|uju folikularni odnos kortizol - kortizon, ili slu`e kao novi biohemijski prediktor ishoda IVF - in vitro fertilisation. Odnos kortizol - kortizon u folikularnoj te~nosti, za koji se pretpostavlja da je inverzno proporcionalan oksidativnoj aktivnosti ovarijalnih enzima 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze je najve}i kada folikul sadr`i maksimalne koli~ine hidrofobnih 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze inhibitora, minimalne koli~ine hidrofilnih 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze stimulansa. Obrnuto, ovaj odnos je najmanji kod onih folikula koje sadr`e zanemarljive nivoe hidrofobnih 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze inhibitora ili visoke nivoe hidrofilnih 11 HSD - 11 hydroxysteroid dehydrogenaze stimulansa, tako da se folikularni odnosi kortizol - kortizon mogu utvrditi nivoima 11 HSD 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze modulatora prisutnih u folikularnoj te~nosti. Zato se postavlja pitanje, da li mogu nivoi 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze modulatora u pojedina~nim uzorcima folikularne te~nosti predvideti ishod IVF - in vitro fertilisation. Nezavisno od ishoda IVF - in vitro fertilisation, sastavni delovi folikularne te~nosti ispirani su sa 80% metanolom. Oni su inhibirali NADP+ - nicotinamide adenine dinucleotide phosphate zavisnu oksidaciju kortizola srednjom vredno{}u od 61%
Upotrebom ovakvog pristupa, potvr|eno je da uzorci humane folikularne te~nosti sadr`e hidrofobne molekule ispirane koncentracijama metanola u opsegu od 50 do 90% vol. koje su u stanju da zna~ajno inhibiraju NADP+ - nicotinamide adenine dinucleotide phosphate zavisnu aktivnost 11 HSD - 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze, ali ne NADP+ - nicotinamide adenine dinucleotide phosphate zavisnu oksidaciju kortizola u roku od jednog ~asa. Jedinjenja ispirana 80% metanolom posti`u maksimalnu inhibiciju enzima, suprimiraju}i NADP+ - nicotinamide adenine dinucleotide phosphate zavisnu aktivnost 11 HSD11 - hydroxysteroid dehydrogenaze i do 88% u odnosu na kontrolu aktivnosti enzima, mereno samo u prisustvu odgovaraju}e koncentracije metanola. Ova tehnika je, tako|e, otkrila da folikularna te~nost sadr`i hidrofilna jedinjenja, ispirana 0% i 10% metanolom, koja mogu stimulisati i NADP+ nicotinamide adenine dinucleotide phosphate zavisne i NAD+ nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
270
tokom jednog ~asa, a hidrofilna jedinjenja ispirana 0% metanolom su stimulisala srednje pove}anje NADP+ - nicotinamide adenine dinucleotide phosphate zavisne 11 HSD - 11 hydroxysteroid dehydrogenaze aktivnosti od 56%. Ciklusi karakterisani ni`im nivoima folikularnih 11 HSD -11 - hydroxysteroid dehydrogenaze inhibitora su povezani sa brojem trudno}a od 17%, u pore|enju sa brojem trudno}a od 46% kod onih ciklusa sa folikularnim nivoima ovarijalnih 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze inhibitora iznad prose~nog nivoa nezavisnog od ishoda. Osim toga, folikuli sa visokim nivoima hidrofilnih 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze stimulansa su povezani sa brojem trudno}a od samo 10%, dok je broj trudno}a bio 59% kod ciklusa u kojima su nivoi ovarijalnih 11 HSD - 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze stimulansa bili ispod proseka. Iz ovoga proizlazi da se rezultat u programu IVF - in vitro fertilisation stimulisanom gonadotropinom, mo`e predvideti visokim nivoima hidrofobnih ovarijalnih inhibitora 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze, ili niskim nivoima hidrofilnih ovarijalnih stimulansa aktivnosti ovog enzima. Novi podaci dozvoljavaju da se razvije upotrebljiva hipoteza, predstavljena na donjoj slici, koja mo`e objasniti za{to direktna i indirektna merenja ovarijalne aktivnosti 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze mogu, pod definisanim okolnostima, predvideti ishod IVF - in vitro fertilisation . Ovaj model mo`e re{iti pitanja koja se postavljaju u biohemijskom sistemu od strane nekih negativnih studija sumiranih u ovom poglavlju.
Sl. 4.75- Funkcionalna hipoteza dualne regulacije aktivnosti: 11 HSD - 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze i razvojna sudbina oocita u funkciji parakrinih ovarijalnh modulatora enzima: ODS - ovarijalni dehidrogenazni stimulus; ODI - ovarijalni dehidrogenazni inhibitor; (+) - pozitivno dejstvo koje pove}ava razvojni potencijal oocita i neto oksidaciju kortizola u kortizon (-) - negativno dejstvo koje smeta razvojnom potencijalu oocita ili inhibira neto oksidaciju kortizola u kortizon
Da se povezani razvojni potencijal oocita i ovarijalne aktivnosti 11 HSD - 11 hydroxysteroid dehydrogenaze mo`e kontrolisati, ili nezavisno jednim jedinjenjem, ili grupom biohemijskih jedinjenja, podr`ano je razmatranjem slu~aja gliciretinske kiseline i njenog hemisuksinatnog estrakarbenoksolona. Utvr|eno je da su ovi molekuli inhibitori 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze i dobijaju se od likorisa, liquorice koji tako|e uti~u na sazrevanje oocita raskidanjem gap spojeva izme|u oocita i okolnih kumulusnih }elija. Nema dokaza koji bi naveli na sumnju da je sposobnost gliciretinske kiseline i karbenoksolona da zatvore gap spojeve na bilo koji na~in povezano sa njihovim dejstvom inhibitora 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze. Osobina funkcionalnog modela, kod kojeg bi ovarijalna aktivnost 11 HSD 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze slu`ila kao surogat biohemijskog markera drugih
271
komponenti zrelog folikula, moglo bi da objasni za{to ciljano brisanje gena koji enkodiraju klonirane izoforme 11 HSD 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze, ne}e pove}ati broj trudno}a. Ako su u pitanju nivoi modulatora enzima u jajniku, umesto nivoa ekspresije 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze koji utvr|uje ili odra`ava razvojnu kompetenciju oocita, smanjivanjem ovarijalnih aktivnosti 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze putem transgenskog pristupa, ne bi stvaralo biohemijsku okolinu potrebnu u folikulu radi optimalnog razvoja oocita. Trenutni model, tako|e, pru`a obja{njenje za{to je ~uvanje granuloznih }elija u folikularnoj te~nosti u mediju sa serumom, bilo neophodno za direktna in vitro merenja ovarijalne aktivnosti 11 HSD - 11 hydroxysteroid dehydrogenaze, radi korelacije za verovatno}om za~e}a. Klju~ za ovu prediktivnu vezu le`i u stepenu do kog ispitivanje aktivnosti 11 HSD - 11 hydroxysteroid dehydrogenaze u granuloznim }eljama odra`ava nivoe ovarijalnih modulatora enzima, sekretovanih u folikulu razvojem oocita i granuloznih }elija. U ovom slu~aju, veza izme|u aktivnosti enzima i ishoda IVF - in vitro fertilisation, mo`e biti oja~ana ~uvanjem }elija u folikularnoj te~nosti i kultivacijom granuloznih }elija, tako da one mogu nastaviti da proizvode autokrine i parakrine modulatore enzima, pre procene metabolizma kortizola. Prisustvo modulatora ovarijalnog metabolizma steroida u folikularnoj te~nosti, kod IVF - in vitro fertilisation pacijenata, nije bez presedana. Poznato je da folikularna
te~nost sadr`i jedinjenje koje mo`e da inhibira konverziju androgena u estrogene putem aromataze. Povi{eni nivoi ovog jedinjenja, ili vi{e njih, predvi|aju smanjenu verovatno}u za~e}a putem IVF - in vitro fertilisation. Folikularna te~nost, tako|e, sadr`i jedinjenja koja mogu poja~ati ili inhibirati sintezu progesterona pomo}u enzima 3 - hidroksisteroid 3 HSD - 3 - hydroxysteroid dehydrogenaze. Inhibicija 3 HSD - 3 - hydroxysteroid dehydrogenaze, od strane folikularne te~nosti je posredovana pomo}u folikularnog regulatornog peptida FRP follicle regulatory peptide i to nivoima koji su bili dovedeni u vezu sa uspe{nom oplodnjom oocita i deobom u in vitro uslovima. Prema tome, ona jedinjenja koja se trenutno ispituju, u kontekstu veze 11 HSD - 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze i IVF in vitro fertilisation, zapravo pripadaju familiji biohemijskih prediktora koje mogu modulisati aktivnosti jednog ili vi{e enzima metabolizma steroida. Ako se ovo doka`e, smanjena ovarijalna aktivnost 11 HSD - 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze mo`e jednostavno slu`iti kao odraz folikularnih nivoa modulatora enzima koji uti~u na fertilitet stvaraju}i obrasce metabolizma steroida koji se razlikuju od oksidacije glukokortikoida. Perspektive daljeg razvoja biohemijskog prediktora kao farmaceutskog agensa ishoda IVF - in vitro fertilisation su od posebnog zna~aja da bi se pru`io jedan pouzdan prediktor koji se mo`e upotrebiti za selekciju oocita i embriona i utvr|ivanje ishoda odre|enog IVF - in vitro fertilisation ciklusa.
272
8. KRIOPREZERVACIJA SPERMATOZOIDA
Krioprezervacija je rutinska procedura kod ve}ine programa ART - assisted reproductive technology. Godine 1938. je prvi put bila primenjena ova metoda kod humanog semena. Promene sperme u postupku krioprezervacije su slede}e: pogor{anje pokretljivosti, smanjenje sposobnosti za normalan rast i razvoj, i promena na molekularnim i }elijskim nivoima koje mogu pogor{ati potencijal za oplodnju. Kod IUI - intra uterina insemination, ili konvencionalne IVF - in vitro fertilisation je obi~no dovoljan uzorak koji sadr`i koncentraciju pokretnih spermatozoida ve}u od 5 miliona, sa preko 4 % normalne morfologije. Kada je u uzorku broj pokretnih spermatozoida manji od 5 miliona i kada je broj normalno formiranih spermatozoida manji od 4%, primenjuje se ICSI - ntra citoplasmatic sperm injection tehnika oplodnje. U slede}oj tabeli je dat prikaz indikacija za krioprezervaciju semena.
O~uvanje plodnosti Ljudski spermatozoidi iz ejakulata za upotrebu IUI/IVF/ICSI pre hemoterapije i radioterapije, ili orhidektomije pre vazektomije Testikularno tkivo pre hemoterapije i zra~ne terapije Donorski uzorci spermatozoida Konzervacija za budu}i tretman Spermatozoidi iz ejakulata za budu}u upotrebu IUI/IVF psiholoki razlozi tokom IVF/ICSI tretmana fizi~ko odsustvo tokom IUI/IVF/ICSI tretmana rezervna krioprezervacija Epididimalni ili testikularni spermatozoidi, spermatidi ili testikularno tkivo dijagnosti~ko prikupljanje epididimalnih ili testikularnih spermatozoida viak epididimalnih ili testikularnih spermatozoida tokom ICSI ciklusa
273
Permeabilni agensi, kao glicerol, se koriste, radi dehidratacije citoplazme }elije. Nepermeabilni agensi, kao {to je saharoza, dodaju se da pove}aju osmolaritet radi spre~avanja o{te}enja nekontrolisanim }elijskim oticanjem tokom procesa dehidratacije. Proteini, amino kiseline i drugi permeabilni molekuli mogu stabilizovati organele, ali se obi~no uklanjaju tokom procesa krioprezervacije. Sertifikovani krioprezervacioni rastvori, koji su na raspolaganju, nude stabilan izvor krioprotektivnih sredstava, pa treba izbegavati laboratorijski pripremljene rastvore, poput onih koji sadr`e `umance. Uspe{na krioprezervacija spermatozoida zavisi od optimalnih brzina hla|enja. Sporo hla|enje je kada se temperatura spusta brzinom manjom od 100 C/min, dok je kod brzog hlad|nja brzina 400 C/min. Stepen pre`ivljavanja spermatozoida je oko 90%. Indukovanje nukleacije leda, koje se obavlja pri krioprezervaciji embriona, tako|e pobolj{ava ishod i kod spermatozoida . Ranije primenjivanu krioprezervaciju u pari te~nog azota treba izbe}i i zameniti automatizovanom, sporom krioprezervacijom u opsegu od 2 C /min do 7 C / min, kada se uradi indukcija nukleacije leda. Na temperaturi od minus 30 C sledi uranjanje u te~ni azot. Metoda brzog zamrzavanja humanih materijala, pa i sperme, se naziva vitrifikacija. Pokazuje najbolje rezultate sa swim-up pripremljenim spermatozoidima bez krioprotektanata. U pore|enju sa konvencionalnim zamrzavanjem sa krioprotektantima, vitrifikacija spermatozoida bez krioprotektanata pokazuje bolje o~uvanje motiliteta i fertilnosti. U slede}em poglavlju }e biti vi{e re~i o vitrifikaciji.
Tokom ovih osmotskih procesa koncentracija krioza{titnih agenasa unutar citoplazme se jako pove}ava i ako se ne obrati pa`nja tokom procesa krioprezervacije, ovi agensi mogu dosti}i toksi~ne nivoe. Optimalna brzina hla|enja i zagrevanja se posebno odre|uje za svaki tip }elije da bi se izbegla potencijalna fizi~ka o{te}enja i toksi~nost. Brzine hla|enja i zagrevanja su povezane sa volumenom }elije, njenom povr{inom, permeabilno{}u, energijom aktivacije
274
Krioprezervacija testikularnog materijala trebala bi da elimini{e potrebu za ponavljanjem hirur{kih biopsija. Testikularni spermatozoidi mogu biti krioprezervirani za vi{e poku{aja ICSI - intra citoplasmatic sperm injection, ali prvo moraju da se o~iste od testikularnog tkiva i ostataka. Krioprezervaciju spermatozoida u suspenziji treba izbegavati, jer produkti lize, posle otapanja, mogu biti toksi~ni. Iako je broj klini~kih studija sa krioprotektiranim testikularnim spermatozoidima ograni~en, potvr|eno je da su rezultati slabiji u pore|enju sa rezultatima ciklusa ICSI - intra citoplasmatic sperm injection u kojima su kori{}eni sve`i uzorci testikularnih spermatozoida. Trudno}e sa krioprotektiranim testikularnim spermatozoidima, uklju~uju}i i one koji su sazreli in vitro nakon krioprezervacije, su registrovane.
275
i procuriti u tankove sa te~nim azotom. Jonomerske paljete od smole su najprakti~nije, jer ostaju savitljive i mogu se topiti na vrhu radi osiguravanja protiv curenja. Sistem obele`avanja radi identifikacije paljeta bi trebao biti otporan na niske temperature i lociran unutar cev~ice, po{to uobi~ajeni na~in obele`avanja nije trajan. Mesto skladi{tenja uzorka bi trebalo biti nadgledano periodi~no, uz kontrolu nivoa te~nog azota.
Kori{}enjem testa mogu}e je identifikovati vitalne spermatozoide i u najte`im slu~ajevima asthenozoospermije i selektirati ih za kori{}enje u programu vantelesne oplodnje ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnikom. Izlaganje pentoksifilinu, tako|e, mo`e inicirati i pobolj{ati pokretljivost. Me|utim, ova tehnika je slo`ena i sa ograni~enim pozitivnim ishodom.
Morfologija sperme
Morfologija spermatozoida je va`na, ali nije apsolutni parametar za odabir zdravog spermatozoida. Neke abnormalnosti glave, repa i srednjeg dela se mogu povezati sa genetskim poreme}ajem spermatozoida, pa prema tome igraju va`nu ulogu u selekciji spermatozoida pre ICSI - intra citoplasmatic sperm injection oplodnje. Postoji jasna korelacija morfologije spermatozoida sa njegovim genetskim sadr`ajem. Oko 26% spermatozoida sa amorfnim, okruglim i izdu`enim glavama imaju strukturne hromozomske anomalije. Ve}ina spermatozoida sa velikim glavama su diploidni. Spermatozoidi sa okruglim glavama imaju promenljiv nedostatak u komponentama odgovornim za aktiviranje oocita nakon oplodnje. Tako|e, postoji korelacija promenjene morfologije spermatozoida sa labavo raspore|enim hromatinom. S druge strane je dokazano postojanje aneuploidnosti polnog hromozoma kod morfolo{ki normalnih spermatozoida kod pacijenata koji su bili u programu ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. Utvr|eno je prisustvo aneuploidnosti od 2 - 5% za X, Y ili hromozom 18, kod morfolo{ki normalnih spermatozoida. Ovi rezultati pokazuju da normalna morfologija nije apsolutni indikator za odabir genetski normalnih spermatozoida.
HOS - hipoosmotic swelling test je razvijen kao metoda za procenjivanje funkcionalnog integriteta membrane humanog spermatozoida. Spermatozoid se inkubira u hipoosmotskom medijumu. Kod spermatozoida koji imaju funkcionalnu membranu pro{iruje se citoplazmatski prostor, dok se vlakna repa uvijaju. Ove promene se vide uz pomo} svetlosnog mikroskopa. Spermatozoidi sa inaktivnom }elijskom membranom ne uve}avaju cistplazmatski prostor i njihov rep ostaje nepromenjen. Spermatozoidi koji pokazuju pozitivan hipoosmotski swelling test su vitalni.
276
Prema tome, negativan rezultat kod ICSI - intra citoplasmatic sperm injection pacijenata mo`e delimi~no biti rezultat odabira aneuploidnih spermatozoida.
Sazrevanje
Nezrele }elije spermatozoida dobijene iz suspenzija testikularnih }elija se koriste za metodu ICSI - intra citoplasmatic sperm injection, kao {to je ve} re~eno. Njihova kompetencija je odre|ena stadijumom razvoja u kojoj se nalaze. Kada se za oplodnju koriste okrugli spermatidi i spermatociti, procenat oplo|enih oocita je 20%, a procenat trudno}a manji od 4%. Razvoj do stadijuma blastociste se odvija mnogo sporije kod embriona dobijenih od okruglih testikularnih spermatida. Ukupan kvalitet ovih blastocisti je lo{iji i nije prime}en spontani hatching in vitro.
Fertilizacija spermatidama je tako|e dovedena u korelaciju sa ~estim pojavljivanjem velikih malformacija u ICSI - intra citoplasmatic sperm injection ciklusima. U ovom trenutku nema jasnih parametara za identifikaciju normalnih spermatida i njihovu selekciju. Kod nezrelih testikularnih spermatozoida morfolo{ke osobine, kao {to je zadr`avanje citoplazme, indiciraju nezrelost i ve}i rizik za dizomiju. Za uspe{nost IVF - in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection neophodne su detaljne analize sperme i odgovaraju}e metode krioprezervacije radi dobijanja kompetentnih spermatozoida u dovoljnom broju. Po{to je krajnji cilj svih metoda asistirane reproduktivne tehnike zdravo potomstvo, neophodna je stroga procedura u ovoj fazi rada.
Pokretljivost Nepokretni spermatozoidi: -- Potpuno nepokretni: HOS test ili tretman sa PVP radi provere pozitivan kod testikularnih spermatozoida: dobar ishod pozitivan kod ejakuliranih ili epididimalnih spermatozoida: lo ishod --Prvobitno nepokretni spermatozoidi koji su stekli pokretnost posle kultivacije :dobar ishod Morfologija - Normalna morfologija: 2-5% aneuploidnosti kod X,Y i 18 - Amorfna glava: 26% ima strukturne hromozomske anomalije - Okrugla glava: 26% strukturnih hromozomskih anomalija, ve}ini nedostaju faktori aktivacije oocita - Izdu`ena glava: 26% strukturnih hromozomskih anomalija - Velika glava: 90% je diploidno Zrelost: - Okrugao spermatid: broj oplodnji < 20%, usporeno formiranje balstociste, broj trudno}a < 4% - Izdu`eni spermatid: normalan broj oplodnji i trudno}a, veliki broj anomalija kod potomaka - Nezreli testikularni spermatozoid: normalan broj oplodnji i trudno}a - Nezreli ejakulirani spermtatozoid sa zadr`avanjem citoplazme: rizik za aneuploidnost, dizomiju i nezrelost hromatina
277
Osmotske promene izazvane dehidratacijom imaju za posledicu pove}anje unutra{nje koncentracije soli koja negativno uti~e na vitalne procese u }eliji. Pad temperature u toku krioprezervacije ima direktan efekat na biohemiju }elije. Na svakih 10 stepeni smanjenja temperature, registruje se 50% smanjenja biohemijske aktivnosti }elije. Na nivou }elije, ovaj temperaturni fenomen primarno deluje na }elijski metabolizam i proteine u citoplazmi, koja je okru`ena plazma membranom i sastavljena od bioaktivnih proteina izme|u lipidnih slojeva. Tako odre|ene enzimske reakcije za koje je na temperaturi od 27 stepeni potrebna 1 sec, na temperaturi te~nog azota od - 196 stepeni traju 2 miliona godina. Protokoli krioprezervacije sastoje se u laganom eliminisanju frizibilne vode.
278
Va`no je ista}i da odre|ena koli~ina vode ostaje vezana za molekularne strukture i da se ne elimini{e u toku procesa dehidratacije. Isto tako, smanjenjem temperature ekstracelularni rastvor trpi fizi~ke i hemijske promene, a osmolarnost raste. Pove}anje koncentracije ekstracelularne soli rezultira daljim osmotskim izvla~enjem vode iz }elije, {to ima za posledicu pasivnu dehidrataciju. Ekscesivna i nekontrolisana redukcija }elijskog volumena mo`e da dovede do ireverzibilnog o{te}enja }elijskog citoskeleta. Drugi va`an problem u vezi sa krioprezervacijom je formiranje kristala leda. Imaju}i u vidu da jedan deo vode ostaje u }eliji, postoji opasnost da }e smanjenjem temperature i formiranjem kristala leda oni o{tetiti prvenstveno plasma membranu i druge membranozne elemente. Nije definitivno odre|eno koliko dugo humani oocit, odnosno embrion, mo`e da bude zamrznut. Pre`ivljavanje nakon krioprezervacije je zavisno od kvaliteta promena u toku procesa zamrzavanja, odnosno odmrzavanja, dok je sam period deponovanja od sekundarnog zna~aja. Najdu`i period ~uvanja humanog embriona, objavljen u literaturi, koji je rezultirao ro|enjem zdrave bebe nakon transfera odmrznutog embriona iznosio je 12 godina.
Problem u vezi sa o{te}enjem deobnog vretena mo`e se zaobi}i pode{avanjem intervala izme|u odmrzavanja oocita i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection postupka, ~ime se omogu}ava citoskeletu oocita da se remodelira i obnovi deobno vreteno. Pove}ana osteljivost oocita mo`e se objasniti smanjenom permeabilno{}u citoplazmatske membrane, kao pove}anom osetljivo{}u na osmotske promene. Zamrzavanje oocita u GV - germinal vesicle stadijumu gde je DNK - deoksiribonukleinska kiselina okru`ena nuklearnom mebranom, otkriva nove probleme u smislu IVM - in vitro maturation. Tucker je 1998. godine objavio prvu trudno}u iz krioprezervisanih GV - germinal vesicle faze oocita. Bilo je krioprezervisano ukupno 29 oocita, ali je samo tri oocita u GV- germinal vesicle fazi pre`ivelo. Nakon 30 ~asova kultivacije, dva oocita su sazrela i bili su oplo|eni ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnikom. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection koja se koristi u postupku fertilizacije oocita nakon odmrzavanja, premo{}uje problem o~vr{}avanja zone nakon procesa krioprezervacije. I pored opisanih trudno}a, procenat uspe{ne fertilizacije i formiranja blastociste je samo oko 5,6%, a procenat trudno}e je manji od 10%. Ipak, sve bolji rezultati ukazuju da zamrzavanje oocita mo`e da bude alternativna metoda zamrzavanju embriona, posebno ako se imaju u vidu slu~ajevi oocit donor programa, oboljenja pra}ena gubitkom ovarijalnog tkiva, ili u slu~ajevima kada je nemogu}e zamrznuti embrione.
279
endometrijalnog razvoja, potencijalno izazivaju}i te{ko}e u endometrijalnoj receptivnosti u istom ciklusu. Oociti iz GV - germinal vesicle stimulisanih IVF - in vitro fertilisation ciklusa mogu pre`iveti krioprezervaciju i nastaviti mejozu do ostvarivanja
punog nuklearnog sazrevanja, zadr`avaju}i smanjeni kapacitet za oplodnju i razvoj. U tabeli je dat pregled rezultata nekih autora u programima asistirane reproduktivne tehnologije gde su kori{}eni krioprotektirani nezreli oociti.
Tabela 4-19: Rezultati studija krioprezervacije nezlelih oocita u programima asistirane reprodukcije
Studije Chen, 1986 Van Unmet al., 1987 Al-Hasanietal., 1987 Siebzehnrubl et al 1989 Tucker et al, 1996 Porcuetal., 1997 Tucker et al, 1998 Borini et al. 1998 Porcuetal, 1998 Young et al, 1998 Polak de Fried et al, 1998 Donaldson et al, 2000 Porcu et al, 2000 Winslow et al..2001 Chen et al, 2002 Porcu et al, 2002 Yang et al, 2002 Quintans et al, 2002 Fosas et al, 2003 Boldtetal, 2003
Metoda IVF IVF IVF IVF ICSI ICSI ICSI ICSI ICSI ICSI ICSI ICSI ICSI ICSI ICSI ICSI ICSI ICSI ICSI ICSI
Broj oocita 40 28 182 38 81 12 13 129 709 9 10 18 1840 324 8 124 158 109 88 90
280
Zamrzavanje embriona
Zamrzavanje embriona je danas rutinska metoda u programu vantelesne oplodnje. Postupkom ovarijalne stimulacije omogu}ava se dobijanje velikog broja oocita koji mogu da se oplode. Da bi se smanjio broj multiplih trudno}a, praksa je u ve}ini zemalja da je broj transferiranih embriona limitiran. Prekobrojni embrioni mogu biti zamrznuti i transferirani u nekom od slede}ih ciklusa, ~ime se pove}ava ukupan procenat ostvarenih trudno}a iz jednom stimulisanog ciklusa. Istovremeno se umanjuje broj stimulisanih ciklusa sa smanjenjem posledica ovarijalne stimulacije. Zamrzavanje doniranih embriona omogu}ava izbegavanje sinhronizacije ciklusa izme|u donora i recipienta u programima donacija. Embrioni se ~uvaju dok god se ne elimini{e rizik od eventualne transmisije virusom izazvanih oboljenja. Postoje dve osnovne tehnike zamrzavanja humanih embriona.
Prva podrazumeva zamrzavanje u stadijumu 2 PN sa odre|enim prednostima, jer je }elija u interfazi mitoti~ke deobe i nema anuklearnih fragmenata koji negativno uti~u na proces krioprezervacije. U ovom slu~aju je te`e izabrati embrione za tzv. fresh embrio transfer, {to ima za posledicu neoptimalan embriotransfer.
Krioprezervacija blastociste
Blastocistu je mogu}e zamrznuti isto kao i dvo ili osmo}eliske embrione. Prednosti ovog izbora su da je embriotransfer optimiziran i da se biopotencijal embriona predvi|enih za zamrzavanje mo`e pratiti. Najbolja selekcija se vr{i ukoliko zamrzavamo embrione u stadijumu blastociste. Blastocista mo`e da izgubi ne{to trofoektodermnih }elija bez gubitka vitalnosti. Postoji i bolja sinhronizacija izme|u embriona i razvoja endometrijuma. Dosada{nja ispitivanja ne pokazuju razlike izme|u dece ro|ene nakon fresh ET embryo transfer i ET - embryo transfer-a krioprezerviranih embriona.
281
Prilikom dobijanja ovarijalnog tkiva, pregledom se mogu dobiti nezreli oociti koji tako|e mogu da se zamrznu pre ili posle IVM - in vitro maturation procedure. Ovarijalno tkivo mo`e da bude auto i ksenotransplantirano. Sve do 1990. godine posve}ivano je malo pa`nje ovoj metodi prvenstveno zbog malog procenta pre`ivljavanja osnovne bolesti, a potom i zbog neadekvatne reproduktivne tehnike neophodne za kori{}enje ove tehnologije. Ovo se menja uvo|enjem novih krioprotektanata kao i modifikovanog protokola zamrzavanja. Mnoge studije izve{tavaju o upotrebi 1,5 M DMSO - dimethyl sulfoxide sa slow freezing protokolom 0,3 do 0,5 stepena/min i transferom u te~ni azot izme|u -55 i -140 stepeni Celzijusa. Pokazano je da tkivo jajnika mo`e da se transportuje na ledu u toku 4 sata bez signifikatnog gubitka folikula. Isto tako, sugerisano je da se ovarijalna krioprezervacija za transplantaciju vr{i samo kod `ena mla|ih od 40 godina. Prednost ortotopi~ne autotransplantacije je mogu}nost spontanog za~e}a. Posebno treba ista}i ograni~eno vreme pre`ivljavanja transplantiranog ovarijalnog tkiva. Godine 2001. opisana je prva ortotopi~na autotransplantacija ovarijalnog tkiva kod pacijentkinje sa Hodgkin-ovom bolesti. U periodu od 7 meseci registrovana je folikularna maturacija, porast nivoa estradiola kao i menstruacija. Medjutim, nakon dva meseca do{lo je do pojave ovarijalne insuficijencije. Schmidt je translpantirao prethodno zamrznuto ovarijalno tkivo ispod korteksa preostalog nefunkcionalnog ovarijuma. U periodu od 7 meseci do{lo je do pove}anja nivoa estradiola kao i pojave menstruacije. Nakon ovarijalne stimulacije dobijeni su
282
oociti, ali nije do~lo do fertilizacije nakon ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. U slede}em ciklusu poku{ano je sa inseminacijom, ali bez rezultata. Nedavno, 2004. godine publikovan je rad o prvom ro|enu bebe nakon krioprezervacije/odmrzavanja i ortotopi~ne autotransplantacije. Pacijentkinja je zatrudnela spontano bez ovarijalne stimulacije. Slede}i korak u razvijanju ove metode predstavljala bi krioprezervacija/autotransplantacija celog ovarijuma zajedno sa vaskularnom petljom. Prve heterotopi~ne autotransplantacije su izvedene transplantovanjem ovarijalnog tkiva subkutano na ruci, ispod seroze
uterusa i subkutano ispod abdominalnog zida. Bilo je potrebno 3 - 4 meseca da bi transplantovano tkivo uspostavilo hormonsku aktivnost. Nakon ovarijalne stimulacije dobijeni oociti nisu se fertlisali. Ograni~avaju}i faktor i u ovom slu~aju je vremenski ograni~ena funkcija transplantata. Opisane su transplantacije tkiva jajnika u abdominalni zid. Nakon transfera ~etvoro}elijskog embriona nije do{lo do trudno}e. Sa ovakvim rezultatima izgleda da je uspeh ove tehnike samo pitanje vremena. Ksenotransplantacija humanog ovarijalnog tkiva je pogodan model za nala`enje odgovora za mnoga nau~na pitanja.
283
Krioprotektanti
Krioprotektanti su neophodni za krioprezervaciju }elija. Toksi~nost ovih agenasa je odlu~uju}i limitiraju}i faktor u kriobiologiji. Stoga, glavni cilj bilo kog protokola vitrifikacije mora da bude supresija toksi~nosti bez gubitka efikasnosti krioprotektivnog agenta. Postoje dva osnovna tipa krioprorektanata: permeabilni i nepermeabilni krioprotektanti. Naj~e{}e kori{}eni krioprotektanti su DMSO - dimethyl sulfoxide, glicerol i 1,2-propanediol. Naj~e{}i i najprihva}eniji krioprotektant za vitrifikaciju su acetamid i EG - ethylene glycol. Pokazalo se da ima zna~ajan toksi~ni efekat kao i veliku brzinu difuzije sa brzom ekvilibracijom unutar }elija kroz zonu pellucidu i }elijsku membranu. Uobi~ajena praksa u cilju redukovanja toksi~nosti, ali ne i efikasnosti krioprotektanta je da se }elija prvo izlo`i ni`im koncentracijama, a potom vi{im koncentracija krioprotektanata. Oni su obi~no viskozni, rastvorljivi u
284
vodi i koriste se u visokim koncentracijama. Stepen penetracije zavisi od temperature i razlikova}e se zavisno od specifi~ne hemijske strukture i tipa }elije.
Intracelularni lipidi
Nedavno su objavljeni rezultati o novoj metodi koja se sastoji u polarizaciji i uklanjanju citoplazmatskih lipida iz oocita i embriona pre vitrifikacije, ~ime se izbegava negativni efekat uzrokovan hla|enjem intracelularnih lipida. Bez obzira na prve objavljene rezultate, ne mo`e se a ne uzeti u obzir uloga intracelularnih lipida kao izvora energije za oocite, odnosno, kao gradivni materijal za }elijske membrane, mitohondrije i endoplazmatski retikulum. U obilju istra`ivanja koja se bave efektima rashla|ivanja, negativan kriouticaj je obja{njen i efektima na elemente citoskeleta. Negativni efekat rashla|ivanja se tako|e obja{njava depolimerizacijom mikrotubula i mikrofilamenata kod humanih oocita. Zamrzavanje i odmrzavanje oocita indukuje promene u fizi~ko-hemijskim svojstvima intracelularnih lipida. Poznato je da su oociti u drugoj metafazi rezistentniji na o{te}enja izazvana zamrzavanjem od oocita u GV germinal vesicle stadijumu. To je verovatno uslovljeno razlikama u svojstvima citoskeletnih elemenata. Jedan od va`nih elemenata je razlika u konfiguraciji mikrotubula i mikrofilamenata u toku maturacije oocita. Elementi citoskeleta GV - germinal vesicle oocita su rigidni i pravi, dok su mikrofilamenti i mikrotubuli kod oocita u drugoj fazi mejoze fleksibilni i talasasti. Imaju}i u vidu hipotezu da je interakcija izme|u lipidne faze }elije i elemenata citoskeleta kompleksna, menjanje strukture lipida mo`e da uzrokuje deformaciju i prekid elemenata citoskeleta. U slu~ajevima rigidnog citoskeleta GV - germinal vesicle oocita o{te}enja su trajna.
Disaharidi
Dodavanje {e}era: saharoze, fruktoze, glukoze, sorbitola, trehaloze ili rafimoze, krioprotektantu EG-ethylene glycol, baznom rastvoru za vitrifikaciju, menjaju se karakteristike ovog rastvora. Aditivi sa velikom molekularnom te`inom, kao {to su disaharidi, saharoza ili trehaloza, ne penetriraju }elijsku membranu, ali zna~ajno redukuju koli~inu neophodnog krioprotektanta kao i njegovu toksi~nost. Dodavanje nepermeabilne komponente soluciji za vitrifikaciju i inkubaciju }elije u ovom rastvoru, pre vitrifikacije, poma`e da se povu~e vi{e vode iz }elije i tako smanjuje vreme eksponiranja }elija toksi~nom efektu krioprotektanta. Nepermeabilna saharoza tako|e deluje i kao osmotski pufer u smislu redukovanja osmotskog soka.
Makromolekuli
]elije prirodno sadr`e visoke koncentracije proteina koji su od pomo}i u procesu vitrifikacije. Vi{e koncentracije krioprotektanata su potrebnije za ekstracelularnu nego za intracelularnu vitrifikaciju. Dodavanje polimera visoke molekularne te`ine kao {to je PVP - polyvinylpyrolidone, PEG - polyethylene glycol ili fricoli je dovoljno za vitrifikaciju ekstracelularnog dela sa koncentracijom krioprotektanta koji je dovoljan za intracelularnu vitrifikaciju. Pokazano je da u odre|enim uslovima polimeri mogu da redukuju Cv za 7% u proseku do 24% u kombinaciji sa pove}anim hidrostatskim pritiskom. [ta vi{e, polimeri mogu da stvore viskozni matriks za inkapsulaciju oocita/embriona i
285
Faktori koji uti~u na efikasnost procesa vitrifikacije su slede}i: - tip i koncentracija krioprotektanta, jer su gotovo svi krioprotektanti toksi~ni, - medijum koji se koristi kao bazni medijum, - temperatura vitrifikacionog rastvora, - vreme za koje su }elije/tkivo izlo`ene finalnoj koncentraciji krioprotektanta pre potapanja u te~ni azot, - volumen rastvora krioprotektanta koji okru`uje }elije/tkivo, - tehni~ka obu~enost embriologa, - kvalitet i stepen razvoja }elija/tkiva, - direktni kontakt te~nog azota i vitrifikacionog rastvora koji sadr`i biolo{ki materijal mo`e biti izvor kontaminacije. Protokoli vitrifikacije su jednostavni, brzi, i relativno jeftini, imaju}i u vidu da nije potrebna skupa oprema.
Na kraju da rezimiramo podatke o krioprezervaciji humanih materijala. Prednosti vitrifikacije u odnosu na krioprezervaciju bi bile slede}e: - direktni kontakt izme|u humanog materijala i te~nog azota, - nema kristalizacije, - kori{}enje visokih koncentracija krioprotektanta koje omogu}avaju kratko izlaganje, - brza procedura vitrifikacije i zagrevanja, - mali volumen vitrifikacionog rastvora, - cooling rates od 15000 - 30000 stepeni/min, - minimiziranje osmotskog o{te}enja, - redukovano vreme krio procedure na 2 - 10 min., - jednostavan protokol, - nepotrebna skupa oprema.
Sistem nosa~a
Treba naglasiti da postoji posebni sistem nosa~a za vitrifikacione rastvore, i to:
Open
pulled straws Flexipet-denuding pipette Cryoloop Njihov zadatak je da smanje zapreminu vitrifikacionog rastvora da bi se brzina rashla|ivanja zadr`ala na {to je mogu}e vi{em nivou i da uzorak koji se vitrifikuje bude okru`en te~no{}u, a ne gasom. Vitrifikacija se ne koristi rutinski u ve}ini IVF - in vitro fertilisation laboratorija. Jo{ uvek postoji mnogo razlika i varijabila u vitrifikacionim protokolima, pa su i rezultati u skladu sa tim. Ova metoda je jo{ uvek u povoju, a poslednjih godina dobija na zna~aju i njen pravi zamah se mo`e o~ekivati u slede}ih nekoliko godina.
286
Studije Kuleshova et al., 1999 Yoon et al., 2000 Katayama et al., 2003 Yoon et al.,2003
Trudno}e 1 3 2
Vitrifikacija embriona
Embryo - vitrifikacija
Vitrifikacija u stadijumu pronukleusa ima prednosti u smislu izbegavanja zna~ajnih hromozomskih promena. Post -thaw procenat pre`ivljavanja kre}e se preko 60%, sa procentom trudno}a po transferu od 17% - 30%. Uspe{no pre`ivljavanje zigota nakon fertilizacije obja{njava se time {to procesi u toku i nakon fertilizacije, kao {to je kortikalna reakcija i sledstvena zona hardening omogu}uju ooplazmatskoj membrani bolju toleranciju niskih temperatura i osmotskih promena. Od kvaliteta embriona uveliko zavisi procenat pre`ivljavanja. Embrion sa adekvatnim brojem blastomera zavisno od dana kultivacije, ne sadr`i multinuklearne blastomere, a stepen fragmentacije je ispod 15%. Implantacioni potencijal je direktno proporcionalan broju intaktnih blastomera. Procenat pre`ivljavanja je preko 60% (1193%), sa procentom trudno}a od 20%.
Vitrifikacija blastociste
Glavna karakteristika blastociste je te~no{}u ispunjena {upljina poznata kao blastocela. Smanjenje uspeha vitrifikacije prime}en je u slu~ajevima pove}ane blastocele. Razlog ovome treba tra`iti u nedovoljnom
prelasku krioprotektanta u blastocelu, pri ~emu rezidualna voda pove}ava mogu}nost stvaranja kristala leda u toku hla|enja, smanjuju}i pre`ivljavanje nakon zagrevanja. Procenat pre`ivljavanja nakon krioprezervacije raste u slu~ajevima prethodne redukcije {upljine blastociste. Pore|enjem rezultata pre`ivljavanja blastociste kod rezus majmuna nakon slow cooling krioprezervacije i vitrifikacije pokazalo se da je post thaw survival rate 36% sa 5% hatching-a posle konvencionalnog zamrzavanja, odnosno 85% sa 71% hatching-a nakon vitrifikacije. Vitrifikacijom humane blastociste kori{}enjem cryoloop-a kao nosa~a, procenat pre`ivljavanja se kretao izme|u 72 i
287
90%, procenat klini~kih trudno}a od 3748%, a implantacija od 22 - 29%. Kultivacija embriona do stadijuma blastociste zna~ajna je iz jo{ jednog razloga. Poznat je negativan uticaj ICSI - intra citoplasmatic sperm injection na rezultat krioprezervacije. Izgleda da nekompletno zatvaranje oocitne citoplazmatske membrane i zone pelucide mo`e da dovede do defekta koji perzistiraju i u vreme krioprezervacije. Stoga krioprezervacija u fazi morule, ili blastociste obezbe|uje du`e vreme za reparaciju.
Za sada, konvencionalna krioprezervacija tkiva jajnika je metoda izbora zbog nesumnjivo ve}eg iskustva koje prati ovu metodu. Vitrifikacija kao i u ostalim slu~ajevima u budu}nosti mo`e da postane alterntaivna metoda u ovoj oblasti. Teoretska mogu}nost retransplantacije tumorskih }elija ostaje problem koji jo{ nije re{en. Odluka izme|u rizika i onoga {to se dobija mora da se donosi individualno. Poznato je da je rizik za pacijente sa Hodgkin-ovom bolesti mali, ali umeren kod pacijenata sa karcinomom dojke, odnosno vrlo visok u slu~ajevima leukemije. Vitrifikacija kao metod krioprezervacije ima prednosti, a najva`nija je odsustvo formirannja kristala leda kroz pove}anje brzine hla|enja. Da rezimiramo u donjoj tabeli razlike metoda krioprezervacije i vitrifikacije.
Dostupnost i regulacija Mo`e da se posmatra Mo`e da se analizira Interakcija sa oocitom ili embrionom Kontrola penetracije rastvora Kontrola stepena dehidratacije Odr`avanje fizioloke temperature u toku procesa ekvilibracije Vreme van inkubatora Prolongirani temperaturni ok Interferenca sa oocitom ili embrionom O{te}enje zone pelucide Pojava kristala leda
288
289
Ve}ina uticaja koji poti~u od starenja u odnosu na uterus, mogu biti prevazi|eni optimalnim doziranjem hormona. Za sada nema efikasnog tretmana efekata poznog materinstva kod smanjenog broja oocita, njihovog kvaliteta i kompetentnosti. Starost ima uticaj na kvalitet oocita kao i na plodnost tokom reproduktivnog `ivota `ene i danas je o~igledno da umanjena plodnost, koja je povezana sa staro{}u, po~inje ve} u kasnim dvadesetim godinama, ali je najdramati~nija posle ~etrdesete godine kada vi{e od 50% parova ima te{ko}e u ostvarivanju trudno}e. Pad fertilnosti po~inje u periodu reproduktivnog `ivota mnogo pre pojave neregularnosti menstrualnog ciklusa i ovulatorne disfunkcije, dok jo{ uvek u jajniku postoji dovoljan broj primordijalnih folikula. Period plodnosti tokom perimenopauze je pra}en pove}anom brzinom atrezijom folikula u jajniku, {to nagove{tava korelaciju izme|u kriti~no male veli~ine grupe folikula, pove}ane folikularne atrezije i prate}im smanjenjem kvaliteta oocita. Populacije oocita dobijene od jednog pacijenta se mogu zna~ajno razlikovati u razvojnoj kompetentnosti. Kao {to je ve} re~eno, aneuploidnost oocita je jedan od glavnih faktora koji doprinose subplodnosti starijih `ena, pre i postimplantacionom neuspehu, spontanom abortusu i za~e}u trizomi~nog deteta, naro~ito kod `ena starijih od 40 godina. Ovo je podr`ano podacima iz programa donacije oocita koji pokazuju da se rizik od spontanog abortusa pove}ava sa staro{}u donora. Smatra se da je 15 - 20% embriona kod ovih `ena hromozomno neuravnote`eno sa posledicom visokog stepena gubitka fetusa. Broj aneuploidnosti izra~unat iz incidencije trizomije 21 se pove}ava eksponencijalno kod `ena koje imaju vi{e
od 35 godina starosti, sa dramati~no pove}anim rizikom nerazdvajanja hromozoma oocita u mejozi kod `ena starijih od 40 godina. Pored hromozomske neravnote`e mogu postojati i dodatni faktori koji doprinose ni`em razvojnom potencijalu starijih oocita, po{to je frekventnost spontanih abortusa, sa ili bez hromozomske neravnote`e, ve}a kod starijih `ena. Mogu}i etiolo{ki faktori, koji bi mogli biti u vezi sa pove}anim poreme}ajima hromozomske segregacije pri oogenezi i smanjenom kompetentno{}u oocita, su kratko pomenuti u ovom poglavlju kao i neke trenutne i budu}e opcije za predvi|anje, prevenciju i tretmane subplodnosti koja se dovodi u vezu sa staro{}u.
Prema konceptu uticaja starosti na oogenezu, umesto na spermatogenezu, analiza odvajanja i distribucije polimorfnih markera u hromozomima kod trizomija je pokazala da je ve}ina dodatnih hromozoma materinskog mejotskog porekla. Oko 90% trizomija 13, 15, 21 i 22 poseduje dodatni materinski hromozom i oko 80% svih slu~ajeva rezultuje iz gre{ke u segregaciji ~itavih hromozoma, nerazdvajanja homologih hromozoma u mejozi I.
290
Trizomija 16 je isklju~ivo materinskog porekla sa gre{kom u prvoj mejozi kod 100% svih klini~ki poznatih slu~ajeva. Trizomija 18, tako|e, uglavnom poti~e od majke, ali se naj~e{}e dovodi u vezu sa neuspehom pravilnog hromatidnog odvajanja u drugoj mejozi. Jedini izuzetak je dodatni X hromozom kod 47 XXX i 47 XXY slu~ajeva, koji poti~e od oca u 50% slu~ajeva. Na slici br. 4.85 je prikaz kariotipa kod Klinefelter-ovog sindroma.
291
Ovo nagove{tava da postoji hromozom specifi~ni mehanizam koji uti~e na pravilno odvajanje, segregaciju specifi~nih homologa ili sestrinskih hromatida u `enskoj mejozi. Broj nerazdvajanja hromozoma kod trizomi~nih trudno}a odra`ava razlike u osetljivosti pojedina~nih hromozoma na nondisjunkciju, ali zavisi i od relativnih {ansi za pre`ivljavanje hromozomno neuravnote`enog embriona. Podaci o trizomiji iz trudno}a i hromozomnih studija doniranih oocita iz asistirane reprodukcije, pokazuju da je nondisjunkcija trizomije 16 jedan od naj~e{}ih poreme}aja. Ona se pove}ava skoro linearno, tokom kasnijeg materinstva, dok su trizomija 21 i trizomije drugih malih akrocentri~nih hromozoma niske tokom ranog reproduktivnog doba i pove}avaju se eksponencijalno od 35. godine `ivota. Rizik od vi{estrukih trizomija se pove}ava i prevazilazi broj trizomija 21 kod `ena starijih od 40 godina. Veliki hromozomi iz grupa A i B se retko upli}u u genezu trizomije. Razlozi za razli~ite osetljivosti pojedina~nih hromozoma dop-
rinose heterogenosti u razvojnoj kompetentnosti izme|u kohorta oocita mla|ih i starijih pacijenata, ali tako|e i individualno kod pojedina~nih pacijenata. Hromozomna analiza neoplo|enih oocita iz stimulisanih ciklusa nije utvrdila pove}anje aneuploidnosti vezanih za starost. Me|utim, konvencionalna analiza kariotipa je te{ka kod ljudskih oocita, jer metode koje koriste in situ hibridizaciju su svojstveno sklone gre{kama. Nedavne studije koje su koristile biopsiju polarnog tela ili donirane oocite i spektralno odre|ivanje kariotipa, koje identifikuje sve hromozome, podr`avaju koncept koji tvrdi da postoji veza izme|u starosti i pove}ane osetljivosti na nondisjunkciju tokom oogeneze. Veliki broj aneuploidnosti, mozai~nost, ili haoti~no hromozomsko uvo|enje perimplantacionih embriona nagove{tava da primarne, kao i sekundarne, nondisjunkcije doprinose smanjenoj razvojnoj kompetentnosti starih oocita i embriona. U skladu sa tim matemati~ko modeliranje bazirano na retrospektivnim i prospektivnim eksperimentalnim zapa`anjima apoptoze kod preimplantacionih embriona, predvi|a da je ve}ina embriona
292
ve} razvojno programirana u jedno}elijskoj etapi. Na primer, aneuploidnost, manjak faktora koji reguli{u zigotsku ekspresiju gena tokom, ili nakon kompakcije, ili druge unutra{nje smetnje, umesto uslova uzgajanja, mogu uticati na sudbinu preimplantacionog embriona i postimplantacioni opstanak. Visoka ta~nost odvajanja hromozoma generalno zavisi od rekombinacije izme|u dvaju roditeljskih homologa koji poti~u od oca i majke. Rane etape uparivanja i rekombinacije se odvijaju u embrionalnom jajniku pri progresiji oocita kroz profazu prve mejoze. Univalentni hromozomi nisu fizi~ki zaka~eni, pa prema tome poseduju veliki rizik za nasumi~nu orijentaciju i segregaciju tokom prve mejoze. Transgenski `ivotinjski modeli pokazuju da neuspeh istiskivanja produkata gena potrebnih za upravljanje, rekombinaciju i popravku DNK deoksiribonukleinske kiseline, mo`e rezultovati sterilitetom usled mejotskog zastoja i smrti }elije zametka tokom profaze prve mejoze, ili kao posledica velikog broja aneuploidnosti, naro~ito kod oocita. Povratni mehanizmi, check points koji vode ka mejotskom zastoju u prvoj profazi, kada
postoje smetnje u upravljaju ili rekombinaciji, se ~ine prili~no dopustivim u oogenezi. Kao posledica mutirane mu{ke jedinke `ivotinjskih modela su sterilne i ne proizvode spermu, dok novi oociti sa univalentima i gre{kama u segregaciji hromozoma pre`ivljavaju do ovulacije kod `enskih jedinki sa istim genetskim defektom. Ovaj deformizam doprinosi polno specifi~noj susceptibilnosti na mejotske gre{ke vi|ena kod ~oveka kao i starosno smanjenje kompetentnosti oocita. @ivotinjski modeli otkrivaju da ~ak i fine zabune u rekombinaciji i genetskoj razmeni u profazi prve oogeneze, unutar jajnika embriona uti~u na ta~nost odvajanja hromozoma tokom oogeneze. Mejotsko poreklo, prva ili druga mejoza, o~insko ili maj~insko poreklo, du`ina rekombinacione mape i relativni brojevi i pozicija genetskih razmena, su retrospektivno analizirani kod trizomija radi testiranja na mogu}e korelacije izme|u poreme}ene rekombinacije u ranim etapama mejoze i aneuploidnosti kod oplo|enih oocita starijih pacijenata. Rekombinaciona mapa je potom analizirana. Trizomija 21 koja poti~e od materinske
293
prve mejotske gre{ke, uglavnom sadr`i ahiasmati~ne hromozome, bez obzira na starost majke. Hromozomi 21 koji imaju umanjenu rekombinaciju u blizini centromera, kratku rekombinacionu mapu u proksimalnim delovima hromozoma, imaju visok rizik za nondisjunkciju u prvoj mejozi, iako distalna chiazma mo`e jo{ uvek biti prisutna. Hromozomi 21 sa vi{kom rekombinacije u blizini centromera se ~ine predodre|enim za gre{ke u odvajanju hromatida u drugoj anafazi, a ne u prvoj anafazi, kao {to bi se moglo o~ekivati . Po{to su se chiazmate ve} raspale u prvoj mejozi, gre{ke u segregaciji hromatida hromozoma 21 sa vi{kom proksimalne rekombinacije su posledica smetnje u prvoj mejozi. Smanjena rekombinacija u proksimalnim regijama dodatnog hromozoma u trizomiji 16, ali normalna, ili ~ak pove}ana rekombinacija u distalnim delovima hromozoma, predodre|uje pogre{no odvajanje ovog hromozoma u prvoj mejozi. Suprotno ovome, trizomija 15 i uniparentalna materinska dizomija 15, dve kopije hromozoma 15 od majke i nulisomija za o~ev hromozom, ~esto sadr`e hromozome sa ukupno smanjenom rekombinacionom mapom i odgovaraju}e tome, smanjenim razmerama.
Hromozomi 15, bez ili sa jednom chiazmom, su izlo`eni riziku nondisjunkcije kod mladih `ena. [anse da se hromozomi sa dve ili vi{e chiazmate nepravilno odvoje jedan od drugog tokom prve mejoze oogeneze se pove}avaju sa pove}anjem starosti majke. Ovi podaci podr`avaju zapa`anje da hromozomi sa odre|enom hromozomnom istorijom i {ablonom rekombinacije, koji poti~e od genetskih razmena u profazi prve mejoze u jajniku embriona, imaju naro~ito visoke {anse da ne uspeju da se pravilno transformi{u tokom poslednjih etapa oogeneze pre oplodnje kod starije `ene. Globalno niski stepeni rekombinacije su dodatni faktor rizika u trizomiji 21, iako nivoi razmene mogu jo{ uvek biti unutar normalnog opsega. Po{to nema dokaza za generalno smanjenje broja, ili pozicije razmene na hromozomima sa staro{}u, ovo nagove{tava da nema proizvodne linije koja bi prouzrokovala da oociti sa nesavr{enom rekombinacijom ostanu u jajniku sve do poznog materinskog doba. Umesto toga, predlo`en je dvostruki model two-hit model koji pretpostavlja da su hromozomi sa osetljivom konfiguracijom prisutni u oocitima u svim starosnim dobima majke. Takvi hromozomi se odvajaju sa velikom ta~no{}u u citoplazmi mladog oocita, ali ne uspevaju da se pravilno odvoje unutar ooplazme starije `ene. Smanjena kompetentnost oocita da odvoje hromozome u mejozi nije bazirana na opstanku specifi~ne grupe oocita sa predodre|enim {ablonom devijantne rekombinacije. Transfer citoplazme u oocite kori{}en za IVF - in vitro fertilisation, nije imao nepovoljan uticaj na potomstvo, ali je jo{ uvek kontroverzan. Transfer citoplazme sa mitohondrijama je kori{}en za spre~avanje apoptoze kod oocita i smatra se da mo`e da
294
pomogne razvojnoj kompetentnosti. Uzimaju}i u obzir posledice heteroplazmije mitohondrijske DNK - deoksiribonukleinske kiseline i smetnje transkripcije na razvoj i jo{ uvek nepoznatih posledica starenja po sklop hromozoma, potrebno je jo{ istra`ivanja pre nego {to se nuklearni, ili citoplazmati~ni transfer mo`e razmatrati u rutinskoj klini~koj primeni.
u profazi, oociti ne sadr`e parove centriolarnih MTOC - microtubule organizing center-a, ve} imaju vi{estruke acentriolarne MTOC - microtubule organizing center.
Hromozomi regrutuju ove MTOC microtubule organizing center nakon GVBD - germinal vesicle breakdown radi uspostavljanja cilindri~nih anastralnih niti deobnog vretena.
Od posebnog je zna~aja regulacija niti deobnog vretena i aktivnosti kinaze pri starenju oocita. Osim od rekombinacije, odvajanje hromozoma zavisi i od prisustva funkcionalnih citoplazmati~nih niti deobnog vretena i spaciotemporalne kontrole odvajanja hromozoma u prvoj i drugoj mejozi. Formiranje citoplazmati~nih niti deobnog vretena zahteva polimerizaciju tubulina, kao aktivnost pokretnih mikrotubularnih proteina iz familije dineina i kinezina i zavisno od ciklusa }elijske aktivnosti kinaze, fosfataze i odgovaraju}e jonske homeostaze. Za razliku od ve}ine mitotski deljivih somatskih }elija i spermatocita, koji poseduju dva polarna mikrotubularna organizaciona centra, MTOC - microtubule organizing center, parove centriola koje u~estvuju u formiranju bipolarnih niti deobnog vretena
Vi{estruki MTOC - microtubule organizing center se sastavlja na ravnim, plo~astim polovima niti deobnog vretena. Mikrotubule kod citoplazmati~nih niti deobnog vretena oocita su veoma dinami~ne sa brzom kinetikom depolimerizacije i repolimerizacije. In vitro studije koje su koristile M - fazu ooplazme `abe xenopus, ili ooplazmati~ne fragmente mi{a koji su
295
sadr`ali faktor unapre|enja sazrevanja, MPF - maturation promoting factor i mitogenske proteinske kinaze, MAP - mitogen activated protein kinaze, su pokazale da ooplazma ki~menjaka sadr`i sve komponente za formiranje bipolarne niti deobnog vretena, ~ak i u odsustvu MTOC - microtubule organizing center-a, pa i u odsustvu hromozoma. Pokreta~ki proteini i visoko energetski supstrati kao ATP - adenosine triphosphate i GTP - guanosine triphosphate su neophodni za polimerizaciju i za sortiranje, uvezivanje i organizovanje vlakana niti deobnog vretena.
a koja pripadaju mikrotubulskim pokreta~kim proteinima iz familije sli~ne kinazi, ne uti~u na formiranje niti deobnog vretena, poravnavanje hromozoma i odvajanje u somatskim }elijama.
Sl. 4.95- Lokalizacija kinezin HSET (crven) proteina u metafazi, hromozomi su plave boje
Lokalna dostupnost visoko energetskih supstrata za aktivnost mejoti~ke kinaze i pokreta~kih proteina je tako|e od va`nosti, jer poreme}aji u broju mitohondrija, njihovoj aktivnosti, raspodeli i membranskom potencijalu mogu imati veliki uticaj na regulaciju odvajanja hromozoma. Ekspresija MOS - serine / threonine protein kinaze i MAP - mitogen activated protein kinaze su potrebni za odr`avanje odgovaraju}e dinamike i morfologije niti deobnog vretena kao i za formiranje polarnog tela kod oocita. Integritet niti deobnog vretena u drugoj mejozi zahteva izbacivanje MISS - meiotic spindle stability protein -a (AMH - anti Mullerian hormone), interakcije MAP - mitogen activated protein kinaze i stabilizacije niti deobnog vretena, MAP - mitogen activated protein kinase interacting and spindle stabilizing protein-a. Ovo nagove{tava da oociti mogu biti jedinstveno osetljivi na ugro`eno funkcionisanje, ili ekspresiju takvih regulatornih molekula i genskih produkata koji su
296
potrebni za formiranje i stabilnost anastralnih niti deobnog vretena. Smanjene kompetentnosti oocita pokazuje se i neuspehom kongresije. Poja~ana polarizaciona mikroskopija, polscope, o ~emu }e detaljno biti re~i kasnije, pru`a na~in za neinvazivnu analizu morfologije niti deobnog vretena kod `ivih oocita pomo}u svojih birefrigentnih osobina, baziranih na prisustvu ure|enih parakristalnih snopova mikrotubula. Oociti koji ne sadr`e birefrigentne niti deobnog vretena, usled odsustva niti deobnog vretena ili neure|enih vlakana niti deobnog vretena, imaju ni`i razvojni potencijal u odnosu na one sa vidljivom strukturom. Polscop se mo`e upotrebiti za procenu razvojne kompetentnosti ljudskih oocita kod `ena koje se pribli`avaju perimenopauzi i za izbor najboljih oocita iz kohorta oocita dobijenih od starijeg pacijenta. Pored karakteristi~nih poreme}aja koji se mogu videti sa polscopom, imuno tubulinska analiza ljudskih oocita koji poti~u od starijih `ena je tako|e otkrila ~est neuspeh hromozoma da se okupe u procesu poravnavanja hromozoma na ekvatoru. Poravnavanje hromozoma se ne mo`e videti kod `ivih oocita. Smetnje u poravnavanju hromozoma i odvajanju povezane su sa iscrpljivanjem folikularnog pool-a, a ne sa hronolo{kom staro{}u `ene. Saglasno ovom konceptu, neuspeh kongresije i aneuploidnosti su uobi~ajeni kod oocita sa poreme}enom folikulogenezom i rastom. Smatra se da su ugro`ena folikulogeneza i poreme}ene veze izme|u kompetentnosti nukleusa, citoplazme i aberacija niti deobnog vretena, posledica neporavnatih hromozoma i gre{aka u odvajanju hromozoma u oocitima. Poreme}eni }elijski ciklus i trenutak odvajanja hromozoma u genezi aneuploidnosti su od posebnog zna~aja.
Zapa`anja vezana za ure|enje hromozoma neoplo|enih ili doniranih in vivo ili in vitro sazrelih oocita i analiza kinetike sazrevanja starih oocita, nagove{tavaju da postoji korelacija izme|u devijantne mejotske progresije i smanjene razvojne kompetentnosti. Stariji oociti ~esto poseduju jedan hromatid ili parove hromatida u drugoj metafazi zbog preranog odvajanja sestrinskih hromatida u prvoj anafazi, ili preuranjenog gubitka kohezije centromera pre druge anafaze. Neuravnote`ena ili uravnote`ena pred-deoba predstavlja visok rizik za gre{ke u drugoj mejozi i aneuploidnosti, pa se smatra da je preuranjen gubitak kohezije hromozoma glavni mehanizam koji je odgovoran za starosne gre{ke u odvajanju hromozoma. Studije koje su koristile fluorescentnu in situ hibridizaciju, FISH - fluorescence in situ hybridization metodu sa hromozom specifi~nim sondama kod analize prvog i drugog polarnog tela, ili kod hromozomne analize neoplo|enih ili doniranih ljudskih oocita, potvr|uju ideju o dva mehanizma nepravilnog odvajanja, ali tako|e pokazuju da nondisjunkcija ~itavog hromozoma zna~ajno doprinosi aneuploidnosti kod ~oveka. Ispravno odvajanje hromozoma u prvoj mejozi zahteva da sestrinske hromatide rekombinovanih homolognih roditeljskih hromozoma ostanu zaka~ene jedna za drugu, ili du` ose hromozoma, naro~ito distalno u odnosu na hiazmate, sve do prve anafaze. Rastvaranje hiazmate u prvoj anafazi zavisi od gubitka kohezije me|u sestrinskim hromatidama distalno od mesta razmene, osim kod centromera. Tokom normalne mejoze, kohezija me|u centromerama sestrinskih hromatida se gubi u drugoj anafazi, {to je sli~no mejozi. Kompleks visoko o~uvanih kohezionih proteina, koji se mogu na}i kod somatskih i mejotskih }elija, posreduju u spajanju me|u hromozomima.
297
Proteoliza drugih proteina, koji zapo~inju anafazu, zavisi od aktivnosti APC -anaphase promoting complex-a, kompleksa unapre|enja anafaze, ubikvitinske ligaze koja, tako|e, inicira degradaciju ciklina B, {to dovodi do inaktivacije MPF maturation promoting factor-a.
APC - anaphase promoting complex se reguli{e i blokira kaskadom doga|aja pokrenutih neporavnatim hromozomima, koji nisu pod tenzijom spoja, niti deobnog vretena sa suprotnim polovima. Kontrola u prolaznim ta~kama, checkpoint control, bitna je za redukciono odvajanje hromozoma
298
u prvoj anafazi. Odlaganje prve anafaze polaznim ta~kama niti deobnog vretena se ispoljava kasnije tokom sazrevanja oocita i zavisi od stabilnosti spoja vlakna niti deobnog vretena sa hromozomima. Po{to oociti mogu napredovati do prve anafaze, bez obzira na prisustvo univalenata i neuspeha kongresije, mogu}e je da imaju relativno propusnu prolaznu ta~ku, naro~ito pod uslovima kada oociti ne uspeju da steknu punu mejotsku i razvojnu kompetentnost u ovarijumu starije `ene. Ovo predstavlja rizik za gre{ke u odvajanju hromozoma, po{to su prolazne ta~ke, koje deluju kao ~uvari, permisivne. Predaja, stabilnost, izbacivanje i ekspresija produkata gena, kao {to su hrec 8 human rec8 gen, ili proteini, koji su ume{ani u monopolarnu orijentaciju centromera sestrinskih hromatida kod homologa u prvoj mejozi, na primer monopolina, nisu utvr|eni sve do danas. Ne zna se da li produ`en zastoj u razvoju oocita u diktatnoj etapi mo`e na kraju dovesti do gubitka kohezije, inicirati preventivno odvajanje hromozoma i na taj na~in,
u odsustvu kontrole prolaznih ta~aka, doprineti visokim {ansama za nasumi~no odvajanje hromozoma kod starih oocita. Prevremena separacija homologa je otkrivena kod oocita, koju su ostvarili nakon ovulacije, ili su oociti zadr`avani u prvoj mejozi izlaganjem specifi~nim hemikalijama. Oociti starijih `ena sazrevaju sporije in vitro. Naro~ito kratki hromozomi iz grupe E i G prolaze kroz pred-deobu kod humanih oocita. U ovom trenutku je potrebno jo{ informacija o statusu hromozoma kod humanih oocita u prvoj metafazi radi utvr|ivanja da li stariji oociti nose funkcionalne univalente. Pre poku{aja sa zamenom citoplazme kod starijih oocita sa citoplazmom mladih donora, va`no je znati da li su originalno hiazmati~ni, prerano odvojeni univalenti prisutni i da li predstavljaju rizik za gre{ke u segregaciji, koje se ne mogu kompenzovati donacijom komponenata citoplazme. Za razliku od drugih tipova }elija, oociti sisara ispoljavaju mejotski zastoj u drugoj metafazi. U zastoju posreduje aktivnost citostati~kog faktora CSF - cytostatic factor.
299
CSF - cytostatic factor zastoj zavisi od aktivnosti MOS - serine /threonine protein kinaze i MAP- mitogen activated protein kinaze. Ribozomna p 90 RSK - ribosomal S6 kinase, proteinska kinaza aktivira kinazu Bub1 prolazne ta~ke niti deobnog vretena sa inhibicijom APC - anaphase promoting complex-a koja je potrebna za metafaznu i anafaznu tranziciju.
Druge putanje koje u~estvuju u metafaznom zastoju verovatno obuhvataju inaktivaciju APC - anaphase promoting complex-a pomo}u proteina MAD 2 - mitotic arrest deficiency 2 protein-a, koji je zadr`an u kinetohorama centromera pogre{no poravnatih hromozoma u mitozi i koji je prisutan kod poravnatih hromozoma u oocitima sisara, koji su u zastoju druge metafaze. Stariji oociti sadr`e manje Mad 2 mitotic arrest deficiency 2 protein mRNK messenger ribonucleic acid u pore|enju sa onima kod mladih `ena. E mi1 je jo{ jedna komponenta koja inhibira APC - anaphase promoting complex kod oocita. Deregulacija ovog i drugih genetskih produkata za regulisanje }elijskog ciklusa, mo`e doprineti gubitku kontrole, putem prolaznih ta~aka, checkpoint control i prevremenog otka~injanja i nasumi~ne segregacije starijih hromozoma, {to rezultuje smanjenom
kompetentno{}u za normalan razvoj nakon oplodnje. Funkcija mitohondrija, snabdevanje kiseonikom i disgeneza niti deobnog vretena su dalji elementi za razmatranje. Mitohondrije su naro~ito oboga}ene u blizini niti deobnog vretena oocita. Sedativ diazepam se vezuje za periferni benzodiazepanski receptor mitohondrije, mPBR mitochondrial peripheral benzodiazepine receptor, koji je uklju~en u funkcionalnu strukturu odre|enu kao tranziciona pora permeabilnosti koja kontroli{e potencijal membrane i apoptozu. Diazepam podsti~e smetnje u udru`ivanju mitohondrije sa nitima deobnog vretena kod oocita i uzrokuje mejotsko zadr`avanje ili zastoj. Ovaj tretman ometa okupljanje, kongresiju hromozoma i uzrokuje aneuploidnost. Starenje Leydigovih }elija kod mu{kog pola je u vezi sa smanjenim izbacivanjem, ekspresijom mPBR - mitochondrial peripheral benzodiazepine receptor-a, koji doprinosi smanjenom kori{}enju holesterola i zamenama u steroidogenezi. Izbacivanje mPBR - mitochondrial peripheral benzodiazepine receptor-a jo{ uvek nije analizirano kod starih jajnika. Trenutno postoji polemika o u~e{}u mutacija ili brisanja mitohondrijske DNK deoksiribonukleinske kiseline i o ulozi reaktivnih tipova kiseonika ROS - reactive oxygen species, lipidnoj peroksidaciji i {teti na mitohondrijima pri smrti }elije, ili starosnoj smanjenoj kompetentnosti sazrevanja i razvoja oocita. Efikasnost mitohondrijske respiracije je kod oocita i preimplantacionih embriona u bliskoj korelaciji sa programiranom brzinom razvoja embriona, a u obrnutoj vezi sa staro{}u majke. Proces je kompleksan, jer brojevi mitohondrija variraju unutar kohorta pojedina~nih oocita
300
kod razli~itih pacijenata, ali tako|e i kod istog pojedinca. Mitohondrije sa visokom aktivno{}u i membranskim potencijalom zauzimaju odre|ena mesta unutar ooplazme i njihova raspodela tokom rane deobe mo`e uticati na razvojnu kompetentnost. Generalno se ~ini da kohorti ljudskih oocita sa uporedivo visokim nivoom ATP - adenosine triphosphate imaju bolji razvojni potencijal u pore|enju sa onima sa niskim sadr`ajem ATP - adenosine triphosphate. Smanjena vaskularizacija i snabdevanje kiseonikom su odgovorni za starosne smetnje pri formiranju niti deobnog vretena i za hromozomnu segregaciju kod oocita, pre mitohondrijske disfunkcije i smanjene produkcije ATP - adenosine triphosphate. Naro~ito somatski odeljak u folikulu zavisi od dovoljnog dovoda kiseonika za oksidativnu fosforizaciju i tereoizogenezu. Smanjenje u ravnote`i kiseonika tokom kultivisanja preantralnog folikula ozbiljno uti~e na opstanak folikula, rast oocita i sazrevanje. Smanjenje snabdevanja kiseonikom okoline oocita gajenih in vitro u kulturi preantralnog folikula, nakon obnavljanja sazrevanja podstaknutog gonadotropinom, zna~ajno smanjuje napredak ka drugoj metafazi. Ovo, tako|e, ometa kongresiju, okupljanje hromozoma na metafaznoj plo~i. Sli~no je zapa`enje kod spontano ovuliranih oocita koji su sazreli in vivo kod `ena sa iscrpljenim folikulima. Nasuprot situaciji unutar folikula, izolovani oocit druge metafaze i preimplantacioni embrioni su veoma osetljivi na povi{eni kiseonik i oksidativni stres, tako da kultura sa 5% CO2 u vazduhu mo`e izazvati mitoti~ku nondisjunkciju. Blago izlaganje peroksidu zna~ajno smanjuje razvojnu kompetentnost embriona.
S obzirom da rast oocita i folikulogeneza mogu trpeti zbog manjeg snabdevanja kiseonikom, naro~ito kod pacijenata sa iscrpljenim folikulima, selekcija najvaskularnijih folikula je naro~ito va`na u optimizaciji tretmana asistirane reprodukcije. Dodatne studije su potrebne radi procene prediktivne vrednosti niskih, ili visokih koncentracija komponenti u folikularnom fluidu koje mogu biti u vezi sa kompetentno{}u oocita, kao {to su VEGF - vaskular endothelial growth factor, faktori rasta sli~ni insulinu, inhibini, aktivini ili angiogenin. Uloga mutacija na mitohondrijama pri funkcionisanju somatske }elije, apoptoze i izmenjenog odziva i steroidogeneze kod folikula koji miruju u ovarijumu tokom du`eg perioda, nije bila analizirana, ali doprinosi pove}anom broju smrti granuloznih }elija i na taj na~in indirekto smanjuje kompetentnost oocita. ]elije koje prethode oocitima, primordijalne }elije zametka i oogonije, sadr`e relativno mali broj mtDNK - mitochondrial DNK, i ovo mo`e pomo}i u za{titi oocita od mitohondrijskih insuficijencija, budu}i da nema dokaza za selekciju protiv visokih nivoa patogenih ta~kastih mutacija mtDNA mitochondrial DNK u oogenezi, u ranom razvoju embriona, ili u razvoju fetusa.
301
Sticanje kompetentnosti, regulacija ekspresije i aneuploidnosti kod starih oocita su od posebnog zna~aja. Oociti sti~u visoku kompetentnost razvoja i sazrevanja tokom prepubertalnog i postpubertalnog `ivota i tokom folikulogeneze i rasta oocita. Rast oocita je period kada parakrine i autokrine interakcije unutar folikula sprovode ekspresiju na transkripcionom i translacionom nivou, {to snabdeva oocite sa svim faktorima neophodnim za podupiranje rane embriogeneze, sve dok ne po~ne zigotska aktivacija gena. Imprinting tokom rasta oocita je va`an za sticanje kompetentnosti po{to kontroli{e razvoj i ekspresiju gena iz imprintiranih lokacija. Niska razvojna kompetentnost oocita, sazrelih in vitro do druge metafaze je povezana sa odsustvom specifi~nih proteina u oocitu. Neadekvatno uparivanje izme|u oocita i granuloznih }elija, kod starijih jajnika, mo`e izazvati poreme}aje u ekspresiji oocita. Prate}e granulozne }elije igraju aktivnu ulogu u modulisanju kondenzacije hromatina i u transkripcionoj aktivnosti oocita, {to je potrebno za visoku razvojnu kompetentnost. Produ`ena inaktivacija transkripcije u GV - germinal vesicle fazi, pre obnavljanja sazrevanja, ometa visoku preciznost segregacije hromozoma kod oocita. Sticanje kompetentnosti sazrevanja zavisi od ekspresije i raspodele genskih produkata koji kontroli{u }elijski ciklus. Kontinuirana sinteza ciklina B je potrebna za sazrevanje i zastoj u drugoj metafazi. Zbog toga interakcije izme|u somatskih i }elija zametka, pogor{ane staro{}u, mogu ozbiljno uticati na sudbinu oocita. Permisivne prolazne ta~ke kontrole bi pove}ale uticaj manjih smetnji, na primer u slu~ajevima kada je kohezija hromozoma prerano izgubljena. Otkriveno je
da sterol aktivacije mejoze iz folikularnog fluida, FF-MAS - follicular fluid meiosis activating sterol koji proizvode folikularne }elije, smanjuje pred-deobu sestrinskih hromatida kod oocita sazrelih do druge metafaze bez kumulusa, a pod suboptimalnim uslovima uzgajanja. Retardacija starenja citoplazme supstancama kao {to je FF-MAS - follicular fluid meiosis activating sterol i optimiranje uslova kultivacije se mo`e smatrati kao nov pristup u zadr`avanju visoke razvojne kompetentnosti oocita. Kao i kod drugih metoda, neophodno je dalje istra`ivanje radi kriti~ke analize metabolizma i procene uticaja ugljenih hidrata, amino kiselina, faktora rasta i supstanci sli~nih hormonima, kao {to je FF-MAS - follicular fluid meiosis activating sterol, koje se nalaze u medijumu kulture, na sazrevanje oocita i razvojnu kompetentnost. Neke posledice starenja, kao uravnote`ena pred-deoba, se mogu prevazi}i kultivisanjem in vitro humanih oocita pod odgovaraju}im uslovima. Na sli~an na~in bi se mogli spre~iti i {tetni uticaji mikro sredine na folikulogenezu i kompetentnost oocita u kulturi folikula. Iscrpljivanje folikula, a ne hronolo{ko starenje uti~e na smanjenje broja oocita i njihovu kompetentnost, kao i sklonost ka nondisjunkciji. Veruje se da unilateralna ovariektomija smanjuje uspeh kod IVF - in vitro fertilisation. Neke statistike su pokazale da smanjenje veli~ine pool-a hirur{kim putem, mo`e pove}ati rizik za~e}a deteta sa trizomijom 21. @ene sa trizomi~nim spontanim abortusom su dostigle menopauzu ranije od onih `ena sa hromozomno normalnim poro|ajem ili abortusom. Pacijenti iz razli~itih starosnih grupa sa sli~no visokim bazalnim serumom FSH follicle stimulating hormona i visokim
302
koncentracijama estradiola, koji proizvode samo tri ili manje oocita nakon rutinske FSH - follicle stimulating hormone stimulacije, imaju veoma lo{ ishod IVF - in vitro fertilisation tretmana. Oociti i embrioni, od pacijenata sa lo{im odzivom, imaju pove}an broj aneuploidnosti. Smanjenja folikularne rezerve se obi~no dovodi u vezu sa odre|enim izmenama gonadotropina i faktora rasta u serumu i folikularnom fluidu. Nivoi FSH - follicle stimulating hormona se pove}avaju u serumu tokom tre}eg dana menstrualnog ciklusa usled parakrine funkcije folikula. U nekim radovima je utvr|eno da povi{eni FSH - follicle stimulating hormone, kada se dovede u vezu sa iscrpljenim jajnikom, mo`e biti faktor rizika za nastanak Daunov-og sindroma, dok samo povi{eni FSH - follicle stimulating hormone ima nisku prediktivnu vrednost za aneuploidnost i sni`enu kompetentnost. Sni`eni inhibin B u folikularnoj te~nosti je poslu`io kao dodatni efikasni marker folikularnog razvoja i bio je koristan u predvi|anju broja oocita i kvaliteta embriona. Nivoi bazalnog E2 (<75-80 pg/ml) su bili prediktivni u pogledu kompetentnosti oocita u IVF - in vitro fertilisation. Broj antralnih folikula u ranoj folikularnoj fazi je imao prediktivnu vrednost, naro~ito u kombinaciji sa povi{enim FSH follicle stimulating hormone. @ene sa redovnim normalnim ovulatornim ciklusom, sa prethodno lo{im odgovorom na ovarijalnu hiperstimulaciju kod IVF - in vitro fertilisation, su ~esto ispoljavale karakteristike folikularne faze koja indicira starenje jajnika. Hormonska stimulacija ne mo`e kompenzovati gubitak folikularne rezerve, pa se slab ishod ciklusa sa inicijalno lo{im odgovorom na kontrolisanu ovarijalnu
hiperstimulaciju ne mo`e spre~iti udvostru~avanjem ili pove}avanjem HMG - human menopausal gonadotrophin doze posle 5 dana od stimulacije. Iz svega navedenog jasno je da multivarijantna analiza ovarijalne rezerve mo`e pomo}i u predvi|anju ukupnog broja oocita, njihove kompetentnosti i ishoda IVF - in vitro fertilisation. Pregled ovarijalne rezerve i epidemiolo{ke studije plodnosti pokazuju da se finalna etapa reproduktivnog starenja, ozna~ena menopauzom, u mnogome razlikuje me|u `enama. Osim uticaja sredine, specifi~nih promena ili hemoterapije, koji mogu izazvati preuranjenu ovarijalnu hipofunkciju, POF - premature ovarian failure, ~ini se da je starost, pri prirodnoj menopauzi, uglavnom odre|ena interakcijom vi{e gena, na primer onih koji uti~u na veli~inu osnovne populacije folikula kao i na stepen atrezije. Dokazana je pozitivna korelacija izme|u menopauza majki i }erki. Uporedne studije, tako|e, nagove{tavaju sna`an genetski faktor u odre|ivanju starosti pri kojoj dolazi do menopauze. Posledica ovoga je da je `ena sa porodi~nom istorijom rane menopauze i sama izlo`ena riziku ranog prestanka reprodukcije. Osim utvr|ivanja ovarijalne rezerve, identifikacija genetskih determinanti veli~ine pool-a i faktora koji uti~u na folikul i opstanak oocita i njegov razvoj, kao i rizik od nondisjunkcije i smanjene kompetentnosti oocita, bi}e od velikog interesa u budu}nosti. Do danas je identifikovano tek nekoliko gena koji uti~u na opstanak oocita i aneuploidnosti, broj primordijalnih folikula i njihovrazvoj, i opstanak i starost pri kojoj nastupa menopauza. Iscrpljivanje ovarijalnih folikula se kod fetusa obavlja putem svojstvenih mehanizama
303
apoptoze u oocitima, a kasnije tokom `ivota odrasle jedinke opstanak rastu}ih folikula mo`e biti primarno odre|en apoptozom granulosa }elija. Za poreme}aje u uparivanju i rekombinaciji, tokom rane oogeneze unutar ovarijuma embriona, se zna da izazivaju mejotski zastoj, ozbiljno iscrpljivanje veli~ine pool-a i aneuploidnost kod nekoliko preostalih oocita sa niskom razvojnom kompetentno{}u. Kod `ivotinjskih modela, homozigotne mutacije gena, koji su u rekombinaciji, ~esto rezultuju sterilitetom, bez obzira na opstanak nekih }elija zametka. Mo`e se o~ekivati da aleli sa bla`im fenotipom postoje i da mogu doprineti POF - premature ovarian failure i ranom riziku aneuploidnih oocita sa ugro`enim razvojnim potencijalom. Primarno se numeri~ke ili strukturalne hromozomne aberacije, kao one kod Tarnerovog sindroma ili gonadalne mozai~nosti hromozomnih abnormalnosti, povezuju sa sterilitetom ili subplodno{}u, koji su rezultat preranog iscrpljivanja veli~ine pool-a, iako folikuli mogu pre`iveti do odraslog doba. Za smanjenje broja ovarijalnih folikula, bilo zbog X mutacija koje uti~u na atreziju oocita ili restrikcije po~etne veli~ine pool-a tokom razvoja, veruje se da je uzrok za visok rizik od ponovljenog spontanog abortusa koji je u vezi sa hromozomnom neravnote`om kod nekih pacijenata sa neslu~ajnom iskrivljenom X inaktivacijom. Tako|e se o~ekuje da mutacija gena, koje podsti~u ili {tite od folikularne apoptoze, moduli{u trajanje reproduktivnog `ivotnog veka, ovarijalno iscrpljivanje i kompetentnost oocita. Genetska baza mehanizama popisa, putem koga se vi{ak primordijalnih folikula pri ro|enju detektuje i uklanja iz jajnika do deoba, ili koji {titi od atrezije je jo{ uvek nepoznata.
Oksid azota se pojavio kao za{tita folikula od atrezije, putem podsticanja proteina toplotnog {oka, HSP70 - heat shock protein i potiskivanjem apoptoze podstaknute bax genom.
Kratkoro~ni tretman pacijenta sa L-arojininom u stimulisanim ciklusima radi podsticanja oksida azota i podizanja folikularnog vaskulariteta je nepovoljno uticao na kvalitet embriona i broj trudno}a. Ostali faktori koji se dovode u vezu sa indukcijom apoptoze oocita uklju~uju GnRHgonadotropin releasing hormon agoniste, povla~enje estrogena, androgene, interleukin-6, vezuju}i protein faktora rasta sli~an insulinu i faktor nekroze tumora. Faktori koji smanjuju ovarijalnu apoptozu su gonadotropini, LH - luteinizing hormone i FSH - follicle stimulating hormone, hormon rasta, faktor-1 rasta, nalik insulinu, interleukin -1, epidermalni i osnovni faktor rasta fibroblasta. Nedavni izve{taji dalje podvla~e va`nost hormonalne homeostaze i ekspresiju funkcionalnog faktora rasta i faktora opstanka potrebnih za plodnost i kompetentnost oocita. Pored faktora inhibitora leukemije, LIF - leukemia inhibitory factor, postoje dokazi da insulin, preko insulinskih receptora, poma`e u koordinaciji tranzicije
304
primordijalnog u primarni folikul na nivou oocita, {to dovodi dijabetis u vezu sa plodno{}u i mo`da kompetentno{}u oocita. Status FSH - follicle stimulating hormona je va`na determinanta u starenju jajnika po{to haploinsuficijencija podsti~e ubrzano reproduktivno starenje. Mutacije FSH receptora i mutacije FOXL2 - forkhead transcription factore gene, genskog mapinga na X hromozomu su u~estvovale u ranoj menopauzi. ^ini se da AMH - anti-Mullerian hormone, spre~ava rast primarnog folikula, pa prema tome mo`e biti kandidat za produ`enje reproduktivnog `ivotnog veka. Koncentracije AMH - anti-Mullerian hormone-a su smanjene kod starijih `ena i mogu poslu`iti kao novi marker ovarijalnog starenja i smanjene kompetentnosti. Smanjenje ekspresije AMH - anti-Mullerian hormone-a mo`e doprineti brzom iscrpljivanju pool-a folikula kod premenopauzalnih `ena. Ostali geni sa produktima koji su ume{ani u starenje ili POF - premature ovarian failure, kada se dereguli{u, tako|e mogu imati vezu sa smanjenom kompetentno{}u oocita kao rezultat iscrpljenog pool-a folikula, ili devijantne }elijske signalizacije izme|u oocita i somatske }elije. Tehnologija otcepljenja gena, gene chip tehnology je nedavno dovela do otkri}a pentraksina PTX3 - pentraxin related gene, novog faktora podstaknutog pomo}u GDF9 - growth differentiation factor 9 u granuloza }elijama preovulatornih folikula. Manjak PTX3 - pentraxin related gene izaziva subfertilnost usled defekta u integritetu kompleksa kumulusnih }elija i oocita. Agresivna hemoterapija mo`e izazvati POF - premature ovarian failure dok je gra|a hromozoma i kompetentnost pre`ivelih ovularnih oocita, koji poti~u od delimi~no iscrpljenog pool-a folikula `ena tretiranih
agonisti~nim analognim hormonom koji osloba|a gonadotropin, za sada nepoznata. Zna~aj ishrane, na~in `ivota i delovanje sredine na kompetentnost oocita, sa odmi~u}im maj~inskim godinama, tek treba analizirati. Oralni kontraceptivi visokih doza polako, ali zna~ajno smanjuju starost pri kojoj po~inje menopauza. Ovo mo`e biti razlog aditivnog uticaja kontracepcije i pu{enja na rizik od trisomije 21 zajedno sa drugom mejotskom nondisjunkcijom kod oocita. Testovi odre|ivanja folikularne rezerve kao i analiza porodi~ne istorije, predodre|enosti polimorfizmima, mutacija ili na~ina `ivota i faktora okoline }e u budu}nosti postati korisni za predvi|anje kompetentnosti oocita kod `ena koje se pribli`avaju premenopauzi, ili kod mla|ih pacijenata koji su do`iveli prerani prestanak funkcije jajnika koji je u vezi sa preuranjenim iscrpljenjem pool-a folikula. Kompetentnost, morfologija i sklop hromozoma su od posebnog zna~aja. Pronuklearni skoring i biopsijski pregled polarnog tela na aneuploidnost su metode koje se mogu primeniti za izbor kompetentnih oocita, kod `ena koje se pribli`avaju menopauzi. Aneuploidnost kao najva`niji etiolo{ki faktor u smanjenoj kompetentnosti ne podsti~e uskla|enu devijantnu morfolo{ku osobinu kod starijeg oocita, ili kod njegovog embriona koji }e se iskoristiti u proceni kompetentnosti. Dok se ~ini da monozomija autozoma uti~e na opstanak i razvoj preimplantacionog embriona, trizomija se ne mo`e prepoznati dismorfologijom i vi{e od jedne tre}ine svih trizomi~nih embriona mo`e sti}i do stadijuma blastociste. Odsustvo prolaznih ta~aka, checkpoint koje detektuju hromozomske aberacije i osetljivost preimplantacionog embriona na mitoti~ku nondisjunkciju,
305
pod suboptimalnim uslovima uzgajanja mo`e doprineti mozai~nosti i smanjenoj razvojnoj kompetentnosti starih oplo|enih oocita nakon IVF - in vitro fertilisation. Velika mozai~nost je detektovana u blastocisti dobijenoj od aneuploidnog embriona i u blastocisti sa normalnom morfologijom. Prema tome, produ`eno kultivisanje se ne ~ini korisnim pri selekciji embriona koji nisu hromozomno devijantni. Blastomere jednakih veli~ina mogu biti jedini morfolo{ki parametar za koji se zna da je povezan sa normalnom konstitucijom hromozoma. Identifikacija gena, koji moduli{u doba menopauze, }e doprineti predvi|anju starosnih rizika za smanjenu kompetentnost oocita, kao i savetovanje pacijenata o izgledima uspeha IVF - in vitro fertilisation. Na }elijskom nivou je smanjena kompetentnost starih oocita primarno bazirana na gre{kama u segregaciji hromozoma u oogenezi. Nondisjunkcija, odnosno gre{ke u segregaciji ~itavih hromozoma, kao i prevremen gubitak kohezije me|u sestrinskim hromatidima u prvoj mejozi i pre druge anafaze doprinose aneuploidnosti, i to pre svega, susceptibilnih hromozomnih konfiguracija. ^ini se da su susceptibilni hromozomi prisutni u oocitima kod svih starosnih doba, ali ne uspevaju da se obrade na odgovaraju}i na~in u staroj ooplazmi. Dok mehanizmi prolaznih ta~aka, checkpoint, koji detektuju nedostatke uparivanja u prvoj profazi i nezaka~ene, ili neporavnate hromozome u metafazi, {tite od gre{aka u segregaciji hromozoma u spermatogenezi. Prolazne ta~ke su prili~no permisivne kod oogeneze sisara. Poreme}aji u formiranju niti deobnog vretena, nedovoljna ekspresija komponenti za kontrolu putem prolaznih ta~aka i neodgovaraju}e
snabdevanje visoko energetskim supstratima za pokreta~ke proteine i za aktivnost mejotskih kinaza, na primer usled ugro`ene mitohondrijske funkcije i raspodele, mo`e biti naro~ito kriti~na kod starih oocita. Neuspesi okupljanja hromozoma, poravnavanje hromozoma na ekvatoru niti deobnog vretena su karakteristi~ni za stare oocite kao i one dobijene iz ugro`ene folikulogeneze. Biopsija polarnog tela, ili preimplantaciona genetska dijagnoza PGD - preimplantation genetic diagnosis oocita i embriona je pove}ala broj implantacija kod starijih pacijenata. Lokalizacija i morfologija pronukleusa i obele`avanje embriona mo`e biti korisno za selekciju, dok se o rizicima i koristima produ`ene kultivacije embriona, jo{ uvek raspravlja. Trenutno su metode za pobolj{anje kompetentnosti starih oocita i pobolj{anje njihovog rasta kao i za sticanje kompetentnosti sazrevanja i razvoja, jo{ uvek u ranoj fazi. Rizici koji su povezani sa metodama kao {to je transfer citoplazme, nuklearna razmena i in vitro sazrevanje za pobolj{anje interakcija oocit-somatska }elija i sinhronizma u procesu sazrevanja citoplazme i jedra, moraju biti dalje ispitani pre nego {to po~nu da se koriste u rutinskoj praksi. Molekularnim testiranjem i transgenskom metodologijom }e se dobiti nove informacije. Tehnologija otcepljivanja, ciljanog rascepljivanja gena, omogu}i}e dobijanje novih markera i metoda za predvi|anje i, ~ak, pobolj{anje kompetentnosti oocita kod ljudi sve do poodmaklog reproduktivnog doba. Otkrivanje uslova koji odla`u iscrpljivanje primordijalnog pool-a folikula omogu}i}e o~uvanje plodnosti i kompetentnost oocita u odmaklom maj~inskom dobu.
306
Trenutno nema dokaza da hiperstimulacija pove}ava aneuploidnost oocita ili da izaziva gubitak kompetentnosti oocita. U skladu sa tim, iskustva sa ponovljenom hiperstimulacijom kod doniranja oocita od mladih `ena nagove{tava da nema nepovoljnog uticaja na kompetentnost oocita. Posledice uzastopne i ponovljene hiperstimulacije, radi pobolj{anja {ansi za prirodno za~e}e, i u tretmanu ciklusa asistirane reprodukcije, jo{ uvek treba ispitati u vezi sa njihovim potencijalnim sinergi~nim dejstvom. Oociti starijih pacijentkinja imaju ni`u razvojnu kompetentnost, jer poti~u od ugro`enih folikula koji nisu odgovaraju}e odgovorili na stimulaciju. Vlakna deobnog vretena ovakvih oocita brzo degeneri{u. Zamrzavanje i odmrzavanje imaju dodatne {tetne uticaje na organizaciju mejoti~kog vlakna deobnog vretena oocita krioprezerviranih tokom obe, GV - germinal vesicle i M2 faze. Brzina apoptoze nezrelih oocita kultivisanih u in vitro uslovima je bila zna~ajno ve}a kod oocita dobijenih od starijih `ena, koje su imale 41 do 50 godina starosti, u odnosu na `ene starosti 21 - 40 godina, {to nagove{tava da folikularna sredina pre nastavljanja sazrevanja mo`e uticati na kompetentnost ljudskih oocita.
Usavr{avanjem medijuma za kultivaciju oocita, smanji}e se starosni uticaji i dobiti euploidne oocite sa vi{im razvojnim potencijalom. Pobolj{anjem metodologije krioprezervacije, identifikovanjem gena i produkata gena, koji su markeri visoke kompetentnosti, ili pobolj{anjem folikulogeneze i sazrevanja oocita in vivo i in vitro, smanji}e se uticaji starenja na kompetentnost oocita. Genetska analiza alela i polimorfizama, koji moduli{u doba nastupanja menopauze, pomo}i }e u savetovanju i pru`anju najbolje prognoze i tretmana starijim pacijentima u asistiranoj reprodukciji. Nakon svih ovih godina pokazalo se da stimulacija ovulacije nije potpuno kontrolisana. Jedan od naj~e{}ih rizika je pojava hiperstimulacionog sindroma. Pretpostavlja se da lokalni ovarijalni renin, angiotenzin sistem i vaskularni endometrijalni growth factor imaju glavnu ulogu u patogenezi ovog sindroma deluju}i na angiogenezu i permeabilnost kapilara. Treba pomenuti i mogu}nost primene IVF - in vitro fertilisation u prirodnom ciklusu, nestimulisanom sa, ili bez davanja HCG - human chorionic gonadotropin-a. Procenat uspeha IVF - in vitro fertilisation u nestimulisanom ciklusu se kre}e oko 7% po ciklusu, odnosno 16 % po embrio transferu.
307
Starosna dob pacijenta je va`na za ovarijalnu funkciju, jer ona opada sa godinama. To je biolo{ka, a ne hronolo{ka funkcija. Fertilitet opada zbog smanjenja broja primordijalnih folikula. Vi{e od 250.000 primordijalnih folikula je prisutno u vreme menarhe, dok samo nekoliko stotina ostaje na kraju reproduktivnog zivota. Opadanje broja je, tako|e, registrovano i kod antralnih folikula ve}ih od 1 mm. Broj antralnih folikula veli~ine do 2 mm opada za pribli`no 60 % izme|u 22 i 42. godine `ivota.
308
Brzina smanjenja broja folikula ubrzano raste nakon 37. godine `ivota, prethode}i menopauzi za 10 -12 godina.
Body mass index je va`an, jer je utvr|eno da gojazni pacijenti zahtevaju zna~ajno ve}e doze gonadotropina i du`i protokol stimulacije. Zato se savetuje redukcija telesne te`ine pre procesa stimulacije. Ovaj problem je detaljno opisan u poglavlju - Poreme}aji ishrane i sterilitet. Broj antralnih folikula je u direktnoj koordinaciji sa ovarijalnim odgovorom. Ve}i broj antralnih folikula rezultira}e ve}im brojem oocita dobijenim nakon punkcije. Procenjivanje broja antralnih folikula radi se u ranoj folikularnoj fazi pre po~etka IVF - in vitro fertilisation tretmana brojanjem folikula manjih od 10mm, u oba dijametra, u oba ovarijuma. Zna~ajno vi{e ciklusa se prekida kao neuspe{ni, kod pacijenata gde je broj antralnih folikula ispod 6, dok je za o~ekivati hiperstimulacioni sindrom, ukoliko njihov broj prelazi 9. Broj
antralnih folikula je smanjen i kod pacijenata sa endometriozom. U mnogim istra`ivanjima je dokazano da smanjen broj antralnih folikula pre po~etka stimulacije nema nikakvog zna~aja za procenat trudno}a i da su rezultati isti kao i kod pacijenata sa ve}im brojem antralnih folikula.
Volumen oba jajnika se meri transvaginalnom sondom u ranoj folikularnoj fazi drugog dana menstrualnog ciklusa. 3 D, odnosno 4 D sonografijom, merenje i procena volumena su precizniji. 2 D sonografijom mere se du`ina, {irina i dubina jajnika u sagitalnom i koronarnom preseku, a ovarijalni volumen se dobija po formuli za volumen elipsoida, pi/6 x du`ina x {irina x visina. Zapremina jajnika je proporcionalna broju antralnih folikula pre stimulacije:
- pre puberteta oko 8 ml - posle puberteta oko 18 ml - posle menopause oko 8 ml.
ml ml ml ml ml ml ml
309
Koncentracija FSH - follicle stimulating hormone u ranoj folikularnoj fazi varira od ciklusa do ciklusa od 10 - 25 IU/l. Istra`ivanja su pokazala da bazalna vrednost manja ili jednaka 9,5 IU/l predstavlja gornju grani~nu vrednost normalne ovarijalne rezerve. Koncentracija FSH - follicle stimulating hormone-a u ranoj folikularnoj fazi, tre}i dan menstrualnog ciklusa je obrnuto proporcionalna veli~ini folikularne populacije. Porast koncentracije FSH - follicle stimulating hormone-a nakon testa sa klomifen citratom pokazao se od zna~aja za identifikaciju poor responders-a koji ne bi bili identifikovani odre|ivanjem samo koncentracije FSH - follicle stimulating hormone-a. Kako je FSH - follicle stimulating hormon indirektan marker ovarijalne funkcije, direktni produkti granuloznih }elija mogli bi da bolje reflektuju ovarijalni sekretorni kapacitet kao i broj folikula. Inhibin je heterodimeri~ni glikoprotein produkovan od strane granuloznih }elija i sastoji se od alfa i beta subjedinica. Postoje dve molekularne forme beta subjedinice, beta A i beta B, koje u kombinaciji sa alfa subjedinicom formiraju inhibin A i inhibin B. Inhibin B ima najve}u koncentraciju u ranoj folikularnoj fazi, a inhibin A u lutealnoj. Inhibin B se, uglavnom, sekretuje od strane malih antralnih folikula i jedan je od najranijih markera opadanja broja folikula kao znaka reproduktivnog starenja, {to ne mora da bude pra}eno pove}anjem koncentracije FSH - follicle stimulating hormona merenog tre}eg dana menstrualnog ciklusa. Inhibin A sekretuje dominantan folikul. Nakon injekcije rFSH - rekombinantni folikul stimulirajuci hormon-a dolazi do
naglog porasta sekrecije inhibina B, {to je u skladu sa postavkom da su granulozne }elije malih folikula najsenzitivnije na rast FSH follicle stimulating hormona kada su endogene koncentracije niske. Vrednosti koncentracije inhibina manje od 45 pg/ml merene u serumu tre}eg dana menstrualnog ciklusa, predstavljaju grani~nu vrednost za procenu funkcionalne rezerve jajnika.
Ovarijalni stromalni protok se meri color Doppler-om. Dobijaju se informacije koje se ti~u vaskularizacije i protoka krvi ovarijuma. U ovarijumu su arterije tanke i vijugave {to ote`ava merenje, a meri se protok pojedina~ne arterije subjektivno izabrane. Trodimenzionalna power Doppler sonografija omogu}ava mapiranje i kvantificiranje power Doppler signala unutar celokupnog prostora od interesa, omogu}avaju}i bolju detekciju vaskularizacije i protoka krvi kroz organ. Merenjem je obuhva}en: index vaskularizacije, flow index i vaskularni flow index. Index vaskularizacije meri odnos color voxel-a u definisanom volumenu u odnosu na sve voxele u odre|enom volumenu, reprezentuju}i krvne sudove u tkivu, {to je izra`eno u procentima. Flow index, srednja vrednost color voxel-a, predstavlja prose~an intenzitet protoka /raspon 0 -100/. Vaskularni flow index je srednja color vrednost u svim vokselima u odre|enom prostoru i karakteristika je i vaskularizacije i protoka, opseg 0 -100. Srednja siva vrednost u sivom vokselu pokazuje srednju ehogenost ili prosvetljenost odre|enog volumena, opseg 0 -100.
310
Tabela 4-23: Prikaz 3D ultrasonografskog merenja ovarijuma nakon pituitarne down regulacije i gonadotropne stimulacije
Normalna ovarijalna rezerva 7,5 6,4 44,2 3,0 48,8 31,9 8,8 48,7 4,3 41,8
Uo~eno je pove}anje ovarijalnog vaskularnog indexa, flow indexa i vaskularnog flow indexa nakon gonadotropne stimulacije kod pacijenata sa normalnom ovarijalnom rezervom. Takve promene se ne registruju kod pacijenata sa malom ovarijalnom rezervom. Pokazalo se da ovarijumi sa malim brojem antralnih folikula nisu sposobni da pove}aju protok krvi nakon gonadotropne stimulacije, ili ukoliko do toga dolazi, razlika nije dovoljno velika da se detektuje opisanim metodama.
AMH - anti - Mullerian hormon pripada grupi transforming growth factora beta. Doplerska merenja pokazuju pove}an protok krvi kroz stromu jajnika sa pove}anjem serumske koncentracije endotelijalnog growth factora.Vaskularni endotelijalni growth factor je endotelijalni }elijski mito-
gen sa jakim angiogeni~kim svojstvima, ~iji rast se ne registruje kod ovarijuma sa malim brojem antralnih folikula. Anti Mullerian hormon je detektovan u granuloznim }elijama primarnih folikula sve do antralnog stadijuma kada folikuli postaju FSH - follicle stimulating hormon zavisni. Budu}i da se AMH - anti-Mullerian hormon produkuje samo od strane rastu}ih folikula, serumski nivo mo`e da se koristi kao marker ovarijalne rezerve, reprezentuju}i kvantitativno i kvalitativno ovarijalni folikularni pool. Nivo AMH -anti-Mullerian hormona opada sa godinama `ene. Ve}i nivo serumskog AMH - antiMullerian hormona kod PCO - polycystic ovarian pacijenata obja{njava se time da njihovi ovarijumi sadr`e dva puta vi{e preantralnih, primarnih i sekundarnih folikula kao i antralnih folikula.
311
Nedavno je identifikovano nekoliko faktora rasta i }elijskih povr{inskih molekula kao kriti~ne substance za rast oocita, te su i ove substance kandidati za target antigen koji uzrokuje prerani gubitak ovarijalne funkcije POF - premature ovarian failure.
312
Sl. 4.102 - POF - premature ovarian failure; Histoloski snimak ovarijalnog tkiva imuniziranog sa ZP2 peptidom: A - normalan nalaz; B - imunoreaktivno promenjeno tkivo bez rasta folikula sa fibroziranim intersticijumom
313
Ova prava ne mogu uvek biti istovremeno ispo{tovana. Prema tome, predlo`en je dvostruki kolosek kao re{enje kojim se posti`e najbolja ravnote`a svih interesa,
314
ne treba da bude visoka, jer bi odvratila velikodu{ne nepla}ene donore i privuklo ljude koji u suprotnom ne bi donirali, ili ih podstaklo da prikriju informacije koje mogu biti relevantne po bezbednost donacije. Postoji veliki broj zemalja u kojima je predlo`eno pragmati~no re{enje pla}anja biolo{kog materijala, {to mi smatramo da nije eti~ki.
metode, kada ostali tretmani nisu uspeli, ili ako postoji rizik od prenosa ozbiljne genetske bolesti.
Psiho-socijalne indikacije
Postoji vi{e javnih debata o prihvatljivosti upotrebe doniranja gameta u okolnostima kada je neplodnost izazvana ili obja{njena psiho-socijalnim faktorima, kao {to je to slucaj kod `enskih homoseksualnih parova, slobodnih `ena i postmenopauzalnih `ena. Ne postoji konsenzus o psiho-socijalnim indikacijama za doniranje gameta i embriona. Razli~ita dru{tva odra`avaju svoje stavove po ovom pitanju ure|enjem prava nacionalnim zakonodavstvom.
Bezbednost
Detaljan pregled donora gameta se mora primeniti da bi se izbeglo preno{enje bolesti na recipijenta i dete. Pregled obuhvata kompletno ispitivanje na genetske bolesti, mogu}e infekcije i op{te zdravstveno stanje. Doniranje gameta mora da se praktikuje u centrima koji prolaze kroz proces akreditacije i redovne kontrole. U okviru toga potrebno je postojanje eti~ke komisije radi davanja odobrenja pre po~etka tretmana.
Informisani pristanak
Proces pru`anja informacija, uz savetovanje koje se ti~e implikacija doniranja ili primanja gameta, je neophodan da bi se donoru ili primaocu omogu}ilo da daju svoj informisani pristanak. Ovaj proces zahteva vreme i mogu}nost nastavljene interakcije. Posebna pa`nja treba da se obrati ~injenici da doniranje ili primanje gameta ima dugoro~ne implikacije koje mogu da uti~u na kasniji `ivot.
Medicinske indikacije
Doniranje gameta se indicira kada ne postoji mogu}nost trudno}e bez ove
315
316
doniranju, 41% porodica nije obavestilo ni sopstvene roditelje, a 26% porodica nije obavestilo prijatelje. Sve surogat majke su nameravale da svojoj deci ispri~aju o njihovom za~e}u, ali je samo 57% majki sa doniranim jajnim }elijama bilo spremno da kasnije obavesti dete o na~inu za~e}a. Kada analiziramo trenutno stanje zakonodavne regulative po pojedinim zemljama, surogat roditeljstvo je nelegalno u Austriji, Nema~koj, [vedskoj i Norve-
{koj. U Finskoj, Gr~koj i Irskoj se surogatstvo odvija bez pravnih propisa. U Australiji je dozvoljeno, ali ne u komercijalne svrhe. Francuska, Danska i Holandija zabranjuju pla}anje surogat majkama, dok je u Velikoj Britaniji i Izraelu dozvoljeno pla}anje samo razumnih tro{kova. U SAD se zakoni razlikuju od jedne do druge dr`ave, pa je u Arizoni, Nju D`ersiju i Mi~igenu potpuno zabranjeno, u Floridi dozvoljeno uz odre|ene uslove, a u ostalim dr`avama dozvoljeno.
317
Ektopi~na trudno}a
U istorijatu in vitro fertilizacije prva trudno}a do koje je do{lo nakon IVF - in vitro fertilisation bila je ektopi~na. Steptoe i Edwards su je opisali 1976. godine. Incidenca pojave ektopi~ne trudno}e nakon embriotransfera varira od 2 do 11%. Incidenca iz multicentri~nih studija kre}e se do 5%. O~igledno je da u toku embriotransfera embrion mo`e da dospe u Falopijevu tubu. Ukoliko je tuba normalna, embiron se
Sl. 4.103- Laparoskopski nalaz tubarnog graviditeta
Jedan od faktora za pojavu ektopi~ne trudno}e je sama tehnika embriotransfera. Postoje dokazi koji ukazuju da stimulacija ovulacije pra}ena visokim nivoima estrogena uti~e na tubarni embrio transfer. Tako|e je pove}ana i incidenca kombinovane intrauterine i ekstrauterine trudno}e u programu IVF - in vitro fertilisation.
318
Fiziopatologija
Fiziopatologija OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma se sve bolje razume. Nedoumica je ravnote`a izme|u proangio-
319
kao negativni modulator bioaktivnosti VEGF - vascular endothelial growth factor. Vi{ak bioaktivnog proangiogenog VEGF - vascular endothelial growth factor-a pove}ava rizik pojave OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma. Vi{ak antiangiogenog sVEGFR-1 -vascular endothelial growth factor-a i ostalih antiangiogenih faktora umanjuje reakciju jajnika i rizik za pojavu OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma, a ispoljava se smanjenim stepenom trudno}a. Apsolutne serumske koncentracije nemaju vrednost u pojedina~noj proceni rizika, jer postoje individualne varijacije vezivanja VEGF - vascular endothelial growth factor-a sa njegovim receptorima. Kod eksperimentalnih `ivotinja je dokaz koncepta prikazan tako {to je VEGF2- vascular endothelial growth factor inhibitorom (SU5416) blokirao HCG - human chorionic gonadotropin zavisnu produkciju VEGF - vascular endothelial growth factor. Tako|e je pokazano da izazivanje ovulacije pomo}u LH - luteinizing hormona umesto HCG - human chorionic gonadotropin-om, rezultuje ni`om produkcijom VEGF - vascular endothelial growth factor-a. Ovo slu`i kao teorijska osnova za izazvanu ovulaciju koja koristi rLH - rekombinantni luteinizing hormon u klini~koj praksi. Fiziopatolo{ka kaskada OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma se sastoji od neoangiogeneze i pove}ane kapilarne permeabilnosti pove}anih ovarijalnih i ostalih endotelijalnih povr{ina, pomeranjem te~nosti iz intravaskularnog prostora u ekstravaskularni prostor abdomena, pleure, perikarda, pojavom hemokoncentracije, smanjenjem renalne funkcije sa oligurijom/anurijom, hiperviskozno{}u krvi, modifikacijom faktora koagulacije i tromboembolijskih rizika. Hemokoncentracija vodi pove}anju hematokrita, koncentracije
trombocita i leukocita, kreatinina, ureje i enzima jetre u plazmi, sa pojavom hiperkalijemije i acidoze. Koncentracija albumina u serumu se smanjuje kao rezultat ekstravazacije fluida i pojave ascita. Proces je samoograni~avaju}i, jer se uticaj HCG - human chorionic gonadotropin-a smanjuje, osim u slu~aju trudno}e kada po~inje da se osloba|a fetalni HCG human chorionic gonadotropin.
Faktori rizika
Faktore rizika smo podelili na primarne i sekundarne. Primarni faktori rizika su prisutni pre po~etka davanja lekova, a sekundarni se pojavljuju sa po~etkom stimulacije.
320
vrednosti, relativno lo{a mo} predikcije najvi{e 73%. Sam estradiol nije medijator po{to je OHSS - ovarian hyperstimulation syndrom, tako|e, mogu} i sa niskim vrednostima serumskog estradiola, kod stimulacija sa rFSH - rekombinantni folikul stimuliraju}i hormon-om. Brzina porasta estradiola je glavni faktor rizika i od ve}eg je zna~aja od maksimalnog nivoa, pozitivna prediktivna vrednost 77%: Broj folikula u svakom jajniku ve}i od 20 - 25. Nema jasne grani~ne vrednosti; Merenja apsolutnih koncentracija serumskog vaskularnog endotelijalnog faktora rasta VEGF - vascular endothelial growth factor-a nisu upotrebljiva za pojedina~no predvi|anje.
Pacijente treba umiriti i ve}ina njih }e se potpuno oporaviti u roku od sedam dana. Observacija pacijenata je obavezna u cilju detekcije slu~ajeva koji mogu napredovati do umerenog ili te{kog OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a. Ako su u ovoj fazi hiperstimulacije jajnici uve}ani, pacijenti treba da izbegavaju naporne aktivnosti zbog rizika torzije ovarijuma. Stepen abdominalnih bolova mo`e zahtevati upotrebu analgetika.
Klasifikacija
Podela na razli~ite stepene oblika OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a je na osnovu vremena kada se javlja i na osnovu te`ine klini~ke slike.
Rani oblik je izazvan davanjem HCG human chorionic gonadotropina i hiperreakcijom ovarijuma koji su u fazi gonadotropinske stimulacije. Kasni oblik se javlja kao reakcija na sekreciju placentarnog HCG - human chorionic gonadotropina. Najnovija definicija se jo{ uvek oslanja na osnovnu etiologiju, ali pravi jasnu razliku izme|u ranog oblika, nekoliko dana nakon injekcije HCG human chorionic gonadotropina i kasnog oblika, naj~e{}e oko 10. dana od davanja HCG - human chorionic gonadotropina. Slu~ajevi sa ranim oblikom na koji se nadovezuje trudno}a su naro~ito rizi~ni i dugotrajni. Blagi oblik OHSS- ovarian hyperstimulation syndrome-a
Blagi OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome ne zahteva specifi~an tretman.
321
Koncentracija
kreatinina i uree,
C-reaktivni protein, za isklju~enje infekcije, Vrednosti koagulacije u slu~aju uklju~enja terapeutske antikoagulacije.
Hemokoncentracija, hematokrit >45%, Leukocitoza >15 000/mm3, Osloba|anje kreatinina <50 mL u min-
utu; serumski kreatinin >1.2 mg /dL, Povi{eni enzimi jetre, Hiperkoagulacija, Hipoproteinemija i hipoalbuminemija <30 g/L.
Klini~ka slika
Naj~e{}i simptomi i znaci su: Distenzija donjeg abdomena, Progresivno pove}anje abdominalnog obima merenog u nivou umbilikusa, Jajnici uve}ani preko 12 cm, Mu~nina i povra}anje koji spre~avaju uzimanje hrane i te~nosti, Ote`ano disanje i respiratorni problemi usled povi{ene dijafragme i hidrotoraksa, Diareja, Brzo pove}anje te`ine. Ozbiljniji znaci i simptomi su:
Ascites, Hipotenzija, Pleuralni izliv, ~e{}i na desnoj strani, Perikardijalni izliv, Razvijen oblik sindroma respiratornih
Torzija ovarijuma koja izaziva iznenadni i ekstremni abdominalni bol i mu~ninu. Pojavljuje se u 1/5000 stimulacionih ciklusa, ali je ~e{}a ako su prisutni trudno}a i OHSS - ovarian hyperstimulation syndrom; Ovarijalno krvarenje usled rupture jajnika ili intraovarijalnog krvarenja izazvanog pritiskom ili bimanualnim pregledom. Pra}eno je znacima akutnog krvarenja sa hipotenzijom, mu~ninom, iznenadnim padom hematokrita. Tromboembolizam - opisane su venska u 65.7% i arterijska lokalizacija, naj~e{}e na venama vrata, ruke ili glave u 60% slu~ajeva. Tromboza se tako|e javlja u arterijama i venama donjeg dela tela. Pulmonalna embolija se javlja kod 4 - 12% slu~ajeva.
smetnji, Oligurija i anurija, Vi{estruki otkaz organa, Smrt (1/500 000 ciklusa). Biolo{ki nalazi su:
Poreme}aj elektrolita; hiponatremija <136 mEq /L, hiperkalemija >5.0 mEq /L Hipovolemija,
322
Embolija je opisana kod humeralnih, subklavikularnih i internih vena vrata, kod vena cava-e, kao i kod subklavikularnih, ulnarnih, kod karotidnih, vi{e interne, cerebralnih medijalnih i koronarnih arterija.
Tromboembolijske komplikacije su krajnje retke u slu~aju OHSS -ovarian hyperstimultion syndrome-a, ali mogu imati fatalni ishod uprkos odgovaraju}em tretmanu.
Terapija
Terapija ima za osnovni cilj dopunjavanje arterijalnog volumena, mobilizaciju te~nosti iz van}elijskog prostora, odr`avanje cirkulatorne hemodinamike i spre~avanje hemokoncentracije. Dopuna volumena po~inje intravenskim kristaloidnim rastvorima, normalnim slanim rastvorima brzinom od 125 - 150 ml/h. Ekspanderi plazme, koloidi, se mogu koristiti, ako je to neophodno. Me|utim, ako se sami ekspanderi plazme transportuju do peritonealne {upljine, njihova upotreba mo`e biti kontraproduktivna. Albumin se naj~e{}e koristi, 200 ml 25% rastvora albumina tokom 4h kao i dekstran, manitol i sve`e smrznuta plazma. Nedavno je uticaj rastvora 6% hidroksietil skroba HAES - hydroxyethyl starch,
upore|en sa uticajem albumina kod pacijenata sa te{kim oblikom OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma. Rezultati su bili u korist HAES - hydroxyethyl starch rastvora zbog bolje diureze, manjeg broja procedura punkcije i skra}enja bolni~kih dana. U drugoj komparativnoj studiji upore|ene su primene 10% HAES - hydroxyethyl starch rastvora i hemacela. Nije prona|ena klini~ka prednost HAES - hydroxyethyl starch rastvora u odnosu na hemacel. HAES - hydroxyethyl starch rastvor ima prednost {to je nebiolo{kog porekla i ve}e molekularne te`ine, 200 -1000 kDa, naspram 69 kDa kod albumina. Ishrana bogata proteinima se primenjuje sa istom svrhom. Ukoliko do|e do oligurije neophodna je stimulacija diureze. Dopamin mo`e pomo}i u ponovnom uspostavljanju renalne perfuzije. Pokazalo se da intravensko davanje dopamina od 0.18 mg/kg na svaki sat vremena {iri renalne sudove i pove}ava renalni protok krvi bez uticaja na krvni pritisak i otkucaje srca. Diuretici su kontraindikovani kada pacijenti ispolje hemokoncentraciju, hipotenziju ili hiponatremiju. Njihova upotreba bi trebala da bude ograni~ena na slu~ajeve u kojima se hemodilucija pove}ava, dok oligurija i dalje ostaje. Intravensko davanje 20% albumina zajedno sa frusemidom od 20 mg na svakih 6h se pokazalo uspe{nim kod pacijenata rezistentnih na ostale terapeutske mere. Merenje centralnog venskog pritiska se preporu~uje kada je balans fluida te{ko odr`avati, kao i u slu~aju upotrebe dopamina. Pacijent mo`e napustiti bolnicu kada se hemokoncentracija smanji i kada se diureza pove}a uz nepostojanje dodatnih komplikacija. Antibiotici se savetuju u odre|enim postupcima.
323
Hipoglobulinemija je mogu}a kod slu~ajeva te{kog OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a i mo`e podsta}i relativnu imunodepresiju. Infekcije su prili~no ~esto posledica jatrogenih pojava kao {to je urinarna kateterizacija, venska kateterizacija, pleuralna punkcija, paracenteza i hirur{ke procedure. Preoperativna antibiotska profilaksa se preporu~uje zbog toga. Nej~e{}e bakterije koje su dijagnostikovane su pseudomonas, proteus, klebsiella i enterobacter. Neki predla`u primenu imunoglobulina po{to se koriste i kod drugih patologija koje se dovode u vezu sa hipoglobulinemijom, kao {to je nefroti~ki sindrom ili neke enteropatije. Ova mera tek treba da se proceni. Predlagano je da se indometacin mo`e koristiti kao inhibitor sinteze prostaglandina koji mo`e imati ulogu u etiologiji sindroma. Istra`ivanja su pokazala da indometacin mo`e da spre~i prelaz te~nosti u intercelularni prostor, sa pojavom ascitesa i pleuralnog izliva. U drugim studijama na eksperimentalnim `ivotinjama utvr|eno je da formiranje ascita nije efikasno potisnuto indometacinom. U klini~koj praksi, neki autori upotrebom indometacina nisu prona{li klini~ko pobolj{anje, ili inhibiciju formiranja ascita kod pacijenata sa te{kim OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-om. Osim toga, postoji teratogeni rizik primene indometacina u prvih nekoliko nedelja rane gestacije. Kona~no, oligurija i renalni otkaz su pripisani upotrebi indometacina u slu~ajevima OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma, ~ak i u odsustvu hipovolemije. Renalna perfuzija se mo`e odr`avati na osnovu kompenzacijske vasodilatacije posredovane prostaglandinom kada je renalna aktivnost poja~ana, a kada indometacin mo`e inhibirati ovaj mehanizam.
Preventivni tretman heparinom se savetuje kod svih slu~ajeva povi{enog rizika od tromboembolije. Kod slu~ajeva te{kog oblika OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a slede}e situacije predstavljaju povi{eni rizik od tromboembolije: hiperestrogenemija, imobilizacija, kompresija pelvi~nih sudova od strane uve}anih jajnika ili ascitesa i trudni~ke koagulacione anomalije. Neki istra`iva~i savetuju primenu heparina kod svih hospitalizovanih pacijentima zbog OHSS-ovarian hyperstimulation syndrome-a, dok drugi ograni~avaju njegovu upotrebu na pacijente sa hemokoncentracijom. Prevencija pomo}u mobilizacije i antitromboznih ~arapa se pokazala nedovoljnom, po{to se tromboza mo`e javiti na svim lokalizacijama, pa se ~ini da je etiologija sistemske prirode. Profilaksa heparinom ostaje diskutabilna iz nekoliko razloga. Prvo, nema ve}ih studija koje dokazuju njegovu efikasnost u spre~avanju tromboembolijskih komplikacija tokom te{kih oblika OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a. Osim toga, do{lo je do tromboembolija kod slu~ajeva gde je ve} primenjen tretman heparinom. Tako|e, treba ista}i pojavu dodatnih faktora rizika kao {to su otpornost na aktivni protein C, mutacija zbog Lejden faktora V ili Kronova bolest. Trenutak po~etka primene preventivnih mera je tako|e tema brojnih debata. Prijavljene su kasne tromboze i do 20 nedelja nakon transfera embriona, ali samo u slu~ajevima gde je do{lo do trudno}e. Ova zapa`anja idu u korist preventivnog davanja heparinske terapije do 4. nedelje, pa ~ak, i tokom ~itavog prvog tromese~ja trudno}e. U drugim istra`ivanjima se pokazalo ispitivanjem faktora koagulacije da prve promene nastaju ve} posle dva dana od davanja HCG - human chorionic gonadotropin i da
324
su ove promene maksimalne 8 dana kasnije, {to sugeri{e potrebu za profilaksom, ~ak i pre pojave simptoma OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a.Ovo je naro~ito va`no kod pacijenata sa poznatim prethodnim trombofilnim faktorima. Pored detaljne anamneze, potrebno je ispitati aktivnost AT III, procenu proteina C i S, ispitivanje faktora V, II i MTHFR - 5, 10 methylenetetrahydrofolate reductase gena kod pacijenata sa li~nom i porodi~nom istorijom tromboembolijskih epizoda, ili prethodnim OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a. Ovaj tip provere zahteva precizna ispitivanja. Kod ovih pacijenata nije dovoljno nadgledati protrombinsko vreme PT - prothrombin time i aktivirano parcijalno tromboplastinsko vreme APTT - activated partial thromboplastin time, radi detekcije hiperkoagulabilnosti. Potrebno je pra}enje D-dimera, AT III, trombin-AT III kompleksa, fibrinopeptida A i B, alfa2 plazmin inhibitora i plazmin-alfa2 antiplazmin kompleksa.
Rezultati ura|ene drena`e su bili pobolj{anje dispneje kod 95% slu~ajeva i pove}anje diureze kod 73% slu~ajeva. Abdominalni pristup ima prednost zbog bolje pristupnosti i optimalnog komfora pacijenta. Edemi trbu{nog zida mogu da u~ine ovaj pristup nemogu}im. Tada se pristupa vaginalnoj punkciji sa aplikacijom posebnih vaginalnih katetera. Zbog rizika od povreda hipervaskularizovanih i uve}anih ovarijalnih cisti ili creva i ostalih komplikacija, kao {to je postparacentezni bilateralni vulvarni edem, obavezna je ultrazvu~na kontrola u toku procedure. U slu~aju ultrasonografskih nalaza d`epova ascitesa ve}ih od 5 cm obavezna je transvaginalna ili abdominalna punkcija. Kod hipoalbuminemije indikovano je davanje 250 ml 25% albumina tokom 3- 4 ~asa nakon punkcije. Postoje nekoliko mehanizama zbog kojih uklanjanje ascitesa pove}ava diurezu i smanjuje hemokoncentraciju: 1. Smanjenje intra abdominalnog pritiska mo`e ubla`iti kompresiju vene cave, olak{avaju}i venski protok i sr~ani rad sa pove}anjem urinarne perfuzije, 2. Dekompresija uretera, tako|e pove}ava diurezu, 3. Uklanjanje dela medijatora odgovornog za proces OHSS-ovarian hyperstimulation syndroma prisutnog u peritonealnoj te~nosti. U jednoj studiji je analizirana diureza nakon drena`e ascitesa sa pretpostavkom da punkcija ima direktan uticaj na produkciju urina. Me|utim, naglo smanjenje intra abdominalnog pritiska uzrokovano brzom i totalnom punkcijom olak{ava prelazak te~nosti iz intravaskularnog dela u peritonealnu {upljinu i brzu ponovnu akumulaciju ascitesa i smanjenje efektivnog
Punkcija ascitesa
Abdominalna punkcija je naj~e{}a intervencija kod te{kih slu~ajeva OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a. Nakon punkcije dolazi do zna~ajnog pobolj{anja sa smanjenjem vrednosti kreatinina u krvi i pove}anjem diureze, uz gubitak te`ine. Smanjuje se hematokrit i krvna osmolarnost. U velikoj studiji ura|enoj u Izraelu, punkcija ascitesa je ura|ena abdominalnim ili vaginalnim putem kod 82% OHSS ovarian hyperstimulation syndrome-a. Indikacije su bile pogor{anje respiratorne funkcije u 74% slu~aja, oligurija u 11% , hemodinami~ka nestabilnost kod 2% i kombinacija ovih faktora u 13% slu~ajeva.
325
intravaskularnog volumena. Uklanjanje velikih volumena te~nosti dalje iscrpljuje proteine izgubljene iz intravaskularnog prostora. Ovo ~esto vodi niskoj intravaskularnoj koncentraciji proteina i neravnote`i elektrolita, naro~ito kada se punkcija ponavlja. Niska intravaskularna koncentracija proteina izaziva dalju akumulaciju te~nosti u abdominalnoj, pa ~ak i u pleuralnoj {upljini. Zato se predla`e obavezno intravensko davanje makromolekula, albumina, HAES - hydroxyethyl starch rastvora uz kontrolu hemodinami~kih parametara. Zbog tih razloga su neki autori predlagali upotrebu autoreinfuzije aspirisane te~nosti. Autoinfuzija je obavljena upotrebom kompletne te~nosti. Punkcija se obavlja vaginalno pod strogo sterilnim uslovima. Dobijena te~nost se ~uva na 4C da bi se uradila bakteriolo{ka kultura uzorka i reinfuzija nakon 48 ~asova. Da bi se izbegla infuzija nekoncentrisanih, zna~i velikih volumena te~nosti i kontaminacija bakterijama i }elijama, druga grupa autora je koristila ultrafiltraciju sa dva filtera: celulozno acetatskim vlaknastim filterom koji uklanja }elije i bakterije i poliakrilonitrilnim vlaknastim ultrafilterom koji koncentri{e protein pre reinfuzije. Dobijena koncentracija proteina nakon filtracije je dvostruko pove}ana, a koncentracija albumina 2 - 5 puta. Te~nost se reinfuzira intravenski brzinom od 300500 ml na svakih 6 ~asova. U nekim radovima je opisano peritoneovensko premo{}avanje, koje se koristi kod ciroze jetre. Da bi se postiglo peritoneovensko premo{}avanje abdominalni kateter je spojen sa antekubitalnim venskim kateterom preko peristalti~ne pumpe sa mikrofilterom pre~nika 10m, brzinom od 100 - 200 ml/h. Kontrolna grupa je tretirana intravenskim davanjem albumina
37.5g dnevno. U grupi pacijenata kojima je ura|eno peritoneovensko premo{}avanje, pokazali su se bolji rezultati u pore|enju sa pacijentima koji su primali albumin, skra}enjem boravka u bolnici, pobolj{anjem hematokrita, diureze, krvnog pritiska i serumske koncentracije proteina. Autori su pretpostavili da recirkulacija ascita koji sadr`e potencijalne OHSS - ovarian hyperstimultion syndroma medijatore mo`e olak{ati degradaciju ovih medijatora u jetri, plu}ima ili bubrezima, dok su prethodno bili zarobljeni u peritonealnoj {upljini. Nakon peritoneovenskog premo{}avanja, koncentracije medijatora kao {to su renin, angiotensin I i II i VEGF - vascular endothelial growth factor su se smanjili u serumu kod pacijenata sa te{kim OHSS ovarian hyperstimulation syndrome-om. Potrebno je naglasiti da se peritoneovenskim premo{}avanjem izbegava naglo smanjenje abdominalnog pritiska uzrokovanog paracentezom. Peritoneovensko premo{}avanje i autoinfuzija nisu postali klasi~ni pristupi tretmanu OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a zbog komplikovane primene i straha od sepse.
326
Kiseoni~ka dopuna i rano uklanjanje te~nosti iz slobodnog prostora smanjuje rizik od hipoksije. Torakocenteza nije neophodna kod svih slu~ajeva. U slu~ajevima gde je ura|ena do{lo je do pobolj{anja klini~kog statusa. Potreba za ponovljenom torakocentezom je retka, ~ak i kod slu~ajeva reakumuliranog izliva. Predlo`eno je postavljanje grudne drena`ne cevi za bilateralnu drena`u. Definitivno pobolj{anje klini~ke slike je prime}eno nakon upotrebe ove procedure. Istovremena drena`a ascitesa je kori{}ena bez potrebe za ascitnom punkcijom. Sindrom akutnih respiratornih smetnji ARDS - acute respiratory distress syndrome je prime}en nakon preoptere}enja usled davanja velikih koli~ina te~nosti, preko 5000 ml dnevno, {to nagla{ava potrebu odr`avanja stroge ravnote`e ulaza i izlaza te~nosti. ARDS - acute respiratory distress syndrome se generalno povla~i nakon 3 - 6 dana uz ograni~enje unosa te~nosti, kontrolisanu diurezu i upotrebu dopamina.
Vaskularne hirur{ke procedure su nekada neophodne za tretman tromboza koje su otporne na terapiju lekovima, ili koje se dovode u vezu sa visokim rizikom od embolije. Postoje izve{taji o posterolateralnoj torakotomiji, subklavijalnoj arteriotomiji i tromboarteriektomiji u skladu sa Fogartijevom tehnikom. Kliping inferior vena cave u cilju spre~avanja masivne pulmonalne embolije je tako|e primenjen. Amputacija usled gangrene, uprkos arterijskoj embolektomiji je, tako|e, opisana. Mezenteri~ka resekcija, nakon masivnog infarkta mezenteri~ne arterije je, tako|e, bila neophodna. Slu~aj perforacije duodenalnog ulcerusa pripisan helicobacter pylori u vezi sa intenzivnim stresom povezanim sa te{kim oblikom OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a je, tako|e, objavljen. Prekid trudno}e je obavljen u nekim ekstremnim slu~ajevima sa arterijskim opstrukcijama radi pobolj{anja klini~ke slike sa neurolo{kim, hematolo{kim i vaskularnim smetnjama.
Preventivni tretman
Preventivni tretman zauzima sve va`nije mesto u mnogobrojnim radovima o OHSS - ovarian hyperstimultion syndromu. Velika prepreka prou~avanju ove ozbiljne komplikacije je njena relativno mala frekventnost pojavljivanja. Do danas su samo dve studije prikupile veliki broj slu~ajeva, od kojih je jedna Abramov-aiz 1998. godine, gde su prou~ene i analizirane pulmonalne komplikacije kod 209 te{kih oblika OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a,i druga, Delvigne-ova iz 1993. godine, gde su prou~ene klini~ke osobine i prediktivni faktori kod 128 pacijenata.
327
Patofiziologija i kontrola OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a ostaju nesigurne. Tretman akutne faze se samo oslanja na empirijski i simptomatski pristup. Adekvatnije metode bi zahtevale bolje razumevanje osnovnih patofiziolo{kih mehanizama za unapre|enje etiolo{kog terapeutskog pristupa. Ovo mo`e dovesti do razvoja preventivnih strategija pre pojave znakova te{kog oblika OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a sli~no prevenciji eklampsije kod rizi~nih pacijenata tokom trudno}e. Neki autori sugeriraju izostavljanje primena HCG - human chorionic gonadotropina u slu~ajevima ozbiljnog rizika od OHSS-ovarian hyperstimulation syndrome-a. U slu~ajevima indukcije ovulacije kada se ne koriste GnRH - gonadotropin releasing hormon agonisti, postoji mogu}nost pojave spontanog LH - luteinizing hormone peak-a i spontanog za~e}a sa potenciranjem razvoja OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma, posebno ako se ima u vidu da se ovulacija odigrava i 11 dana nakon prestanka gonadotropin terapije. U IVF - in vitro fertilisation poznato je da je cilj programa, po definiciji, pove}anje broja oocita. S druge strane, jedina sigurna metoda u spre~avanju razvijanja OHSS ovarian hyperstimulation syndrome-a je ne davanje HCG - human chorionic gonadotropina, kao i odustajanje od ciklusa. Sve ostale procedure, uglavnom, smanjuju rizik ili ozbiljnost OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a pre nego {to potpuno spre~avaju razvijanje ovog sindroma.
primene HCG - human chorionic gonadotropin-a ima zna~ajnu ulogu u predvi|anju razvijanja OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a. Kada je kod rizi~nog pacijenta visok nivo estradiola prestaje se sa davanjem egzogenih gonadotropina, a nastavlja se sa primenom GnRh- gonadotropin releasing hormon agonista. Primena HCG human chorionic gonadotropin-a se odla`e dok se nivo serumskog estradiola ne spusti u sigurnu zonu, ukazuju}i na taj na~in na atreziju granuloznih }elija. Ispitivanja su pokazala da je coasting metoda efektivna i da smanjuje rizik od OHSS-ovarian hyperstimulation syndrome-a, iako potpuno ne elimini{e mogu}nost pojave ovog sindroma. Metoda je povezana sa smanjenjem broja dobijenih oocita, posebno ukoliko je coasting - period produ`en 24 h do 72 h. S druge strane, kvalitet oocita nakon coastinga - metode je smanjen isto kao i receptivnost endometrijuma nakon pada nivoa estradiola. Od kako je 1991. godine dokazano da aspiracija folikula indukuje intrafolikularno krvarenje koje ima negativan uticaj na formiranje corpus luteuma, javila se ideja da pra`njenjem folikularnog sadr`aja mo`e da se uti~e na folikularnu maturaciju i modifikovanje intraovarijalnih mehanizama odgovornih za pojavu OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a. Ovi podaci su kontradiktorni.
Coasting - tehnika je opisana po~etkom 1990. godine i vrlo brzo nakon toga primenjena u slu~ajevima IVF - in vitro fertilisation ciklusa. Bazirana je na pretpostavci da nivo estradiola koji je dostignut u vremenu
EUFA - early unilateral folicular aspiration, unilateralna punkcija folikula se primenjuje 10 - 12 h nakon primene HCG human chorionic gonadotropin-a, nakon ~ega sledi punkcija drugog jajnika 35 - 36 h nakon primene HCG - human chorionic gonadotropina. Ovom metodom nije u potpunosti eliminisan rizik od pojave te{kog oblika OHSS
328
- ovarian hyperstimulation syndrome-a. Invazivna priroda ove metode, dve punkcije uz eventualnu primenu anestezije, ~ini da ova metoda nije ~e{}e primenjivana u odnosu na coasting - metodu. Modifikacija metoda za izazivanje ovulacije podrazumeva redukciju doze HCG human chorionic gonadotropina, ili izazivanje ovulacije primenom rLH - rekombinantni luteiniziraju}i hormona, ili endogeno indukovanim LH - luteinizing hormone talasom. Iako su rezultati pokazali da primena glikokortikoida ne smanjuje rizik od OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a novija istra`ivanja koja ukazuju na eventualnu inflamatornu etiopatologiju OHSS ovarian hyperstimulation syndrome-a ponovo aktuelizuju eventualnu upotrebu glikokortikoida u slu~ajevima OHSS ovarian hyperstimulation syndrome-a.
rizik od sekundarne egzarcerbacije ranog OHSS-ovarian hyperstimulation syndrome-a, kao i od kasnog OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a zna~ajno smanjen. Elektrokauterizacija ili laser vaporizacija jednog ili oba ovarijuma se retko primenjuje imaju}i u vidu invazivni karakter ove metode i mogu}e propratne efekte, kao {to su formiranje adhezija i gubitak ovarijalnog tkiva. Ova metoda ima eventualnog opravdanja samo u odre|enim slu~ajevima OHSS ovarian hyperstimulation syndrome-a, kod pacijenata sa PCOS - polycystic ovarian syndrome-om i savetuje se samo kao poslednje sredstvo.
Progesteron
Pretpostavljeni su razli~iti mehanizmi delovanja profilakti~ke primene progesterona u visokim dozama u spre~avanju pojave OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a: - op{ti antiestrogeni efekat progesterona posredovan down regulacijom estrogenih receptora, na primer na vaskularnom endotelu, - direktna inhibicija sekrecije ovarijalnih hormona, kao {to je prorenin, - antagonisti~kim efektom u odnosu na aldosteron.
LTMD - long term moderate dosis je terapija za indukciju ovulacije pacijenata kod kojih su prekinuti prethodni ciklusi stimulacije zbog polifolikularne reakcije nalazom preko 10 folikula po ovarijumu sa pre~nikom od 10 - 12 mm i visokim rizikom nastanka OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a. Tretirani su kao pacijenti sa hipersenzitivnim ovarijumima na gonadotropine. Da bi se kod ovih pacijentkinja postigla selekcija od maksimalno tri dominantna folikula, u slede}em ciklusu le~enja inicijalna FSH - follicle stimulating hormone doza je bila odgovaraju}e redukovana na 37,5 - 75 IJ i zadr`ana toliko, dok se nije pokazala selekcija folikula. Dalje je terapija nastavljena sa pove}anom dozom do postizanja jednog preovulacionog folikula.
LTMD - long term moderate dosis FSH - follicle stimulating hormone terapija predstavlja sigurnu i korisnu stimulacionu terapiju za le~enje pacijentkinja sa hipersenzitivnim jajnicima sa u dve tre}ine slu~aja izbegavanjem polifolikularne reakcije.
Krioprezervacija embriona
Umesto prekidanja ciklusa mogu}e je uraditi punkciju na regularan na~in, ali nakon fertilizacije zamrznuti sve embrione, ~ime se rizik od ranog OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a potpuno ne izbegava, ali je
329
Sl. 4.106- Histopatolo{ki nalaz epitela kod hidrosalpinksa, normalan epitel pokazuje strelica, limfociti (bele okrugle }elije) u submukozi
330
Mnogi pacijenti sa hidrosalpinksom imaju hroni~ni ili povremeni bol, dok su drugi asiptomatski. Pacijenti sa hidrosalpinksom mogu imatu rekurentne akutne tubarne infekcije koje uzrokuju groznicu i bol.
U bla`im slu~ajevima, fertilitet mo`e da bude uspostavljen hirur{kim otvaranjem tube. Ukoliko je tubarni epitel te{ko o{te}en, IVF - in vitro fertilisation koja premo{tava tube je metoda izbora. Iako se smatra da je IVF -in vitro fertilisation najbolji tretman za hidrosalpinks, prisustvo hidrosalpinksa smanjuje uspe{nost IVF - in vitro fertilisation. Te~nost hidrosalpinksa smanjuje procenat implantacije embriona i pove}ava rizik od abortusa. Zbog ovih razloga, preporu~uje se, ili uklanjanje izmenjene tube, ili laparoskopska koagulacija istmi~nog dela tube pre po~etka IVF - in vitro fertilisation tretmana. Dosada{nja ispitivanja su pokazala da IVF - in vitro fertilisation pacijenti sa hidrosalpinksom imaju upola manje {anse da ostanu u drugom stanju u odnosu na pacijnte bez hidrosalpinksa i da operativni tretman pre IVF - in vitro fertilisation tretmana pove}ava uspe}nost IVF - in vitro fertilisation tretmana.
331
332
20. U^ESTALOST HROMOZOMSKIH ABERACIJA KOD NA[IH PACIJENATA U PERIODU OD 2000 - 2005. GODINE
Citogeneti~ki nalaz zauzima veoma va`nu ulogu u asistiranoj reprodukciji, kako zbog otkrivanja eventualnog uzroka steriliteta ili infertiliteta kod le~enih parova, tako i zbog kasnijeg dijagnostikovanja kariotipa ploda kod onih parova koji su u{li u program. Iako u na{oj zemlji nije ura|ena populaciona studija koja bi registrovala ljude sa nenormalnom hromozomskom konstitucijom, podaci iz strane literature govore da je u~estalost individua sa razli~itim numeri~kim aberacijama hromozoma oko 0,85%, a u~estalost ljudi sa strukturnim aberacijama hromozoma oko 0.1%. U Specijalnoj bolnici u Beogradu analizirani su kariotipovi iz limfocita periferne krvi tehnikom G-traka kod pacijenata le~enih od steriliteta u periodu od 5 godina. Od ukupnog broja, u 3% slu~ajeva registrovani su razli~iti poreme}aji u broju ili strukturi hromozoma. Svi pacijenti kod kojih je ura|ena citogeneti~ka analiza mogli su se svrstati u tri kategorije:
Prvu grupu sa~injavale bi osobe kod kojih je nenormalna hromozomska konstitucija direktno povezana sa sterilitetom i specifi~nim izgledom. Nju sa~injavaju individue sa aneuploidijom polnih hromozoma, osobe sa nedostatkom ili vi{kom X ili Y hromozoma. U drugu grupu pacijenata spadaju osobe normalnog fenotipa sa takozvanim balansiranim kariotipom, tj. kariotipa kod koga je ukupna koli~ina naslednog materijala ostala o~uvana, iako je do{lo do preraspodele gena unutar jednog, ili razmene gena izme|u dva hromozoma. Ovi pacijenti skoro po pravilu imaju smanjen reproduktivni potencijal i u zavisnosti od tipa aberacije, sa razli~itim stepenom rizika, mogu o~ekivati nenormalno potomstvo.
333
Tre}u grupu pacijenata predstavljale bi osobe sa normalnim kariotipom. Ne treba isklju~iti mogu}nost da se i unutar ove najmnogobrojnije grupe pacijenata ipak na|u osobe ~iji je sterilitet naslednog porekla, izazvan razli~itim tipovima genskih mutacija. Poznato je da mu{ki sterilitet mo`e nastati kao posledica recesivne mutacije na X - hromozomu, odsustva spermatogeneze izazvanog nedostatkom peptida hipotalamusa odgovornog za sekreciju gonadotropina, Kallmann-ov sindrom, ili recesivnom mutacijom na autozomima koja uzrokuje nepokretljivost spermatozoida, Kartagener-ov sindrom. U na{em uzorku aberantnih kariotipova preovla|uju oni kod kojih se registruje neka od strukturnih aberacija hromozoma: delecija, inverzija ili translokacija.
Tu spadaju poliploidije, aneuploidije svih autozoma sa izuzetkom trizomija: hromozoma 13, Patau-ov sindrom, hromozoma 18, Edwards-ov sindrom i hromozoma 21, Down-ov sindrom. Od pobrojanih vijabilnih trizomija jedino je kod `ena sa Down-ovim sindromom o~uvan reproduktivni potencijal. Iz tih razloga, jedine o~ekivane numeri~ke aberacije hromozoma bile bi aneuploidije polnih hromozoma. Registrovane su: - Monozomija X-hromozoma kod `ene, kariotip 45, X, Turner-ov sindrom, - Dizomija X-hromozoma kod mu{karca, kariotip 47, XXY Klinefelter-ov sindrom, - Dizomija Y-hromozoma kod mu{karca, kariotip 47, XYY. Od svih prethodno pobrojanih aneuploidija polnih hromozoma naju~estaliji su mu{karci sa Klinefelter-ovim sindromom, dok se najre|e sre}u `ene sa Turner-ovim sindromom.
Sl. 4.110 - Zastupljenost numeri~kih i strukturnih aberacija hromozoma kod pacijenata sa aberantnim kariotipom
Ovi podaci ne{to se razlikuju od podataka objavljenih u literaturi, gde se numeri~ke aberacije smatraju u~estalijim od strukturnih aberacija hromozoma, kako u op{toj populaciji tako i kod pacijenata le~enih od steriliteta.
@ene sa Turner-ovim sindromom su veoma niskog rasta, u proseku oko 145 cm, sterilne su sa slabo razvijenim sekundarnim seksualnim karakteristikama, kratkog i zadebljalog vrata.
334
Ovaj sindrom ne nastaje isklju~ivo kao posledica nedostatka X - hromozoma, ve} tako|e i kao rezultat strukturnih aberacija jednog od X - hromozoma, prisustva izohromozoma Xq ili Xp, kariotip 46, X isoXq, ili 46, XisoXp, ili delecije kratkog kraka Xhromozoma, 46, X Xp. Neki pacijenti sa Turner-ovim sindromom kod kojih se registruje mozai~ni kariotip, 45, X/46, XX, mogu biti fertilni, po{to se kod njih umesto primitivnih seksualnih traka mogu na}i funkcionalni jajnici. Na osnovu u~estalosti Turner-ovog sindroma u populaciji od 1 : 2500, mogla bi se o~ekivati njegova ve}a u~estalost i u na{em uzorku. Ovaj sindrom se, uglavnom, dijagnostikuje pre reproduktivnog perioda, pa se samim tim i mali broj `ena sa Turner-ovim sindromom prijavljuje za program asistirane reprodukcije.
Mu{karci sa Klinefelter-ovim sindromom, kariotip 47, XXY, su evnuhoidnog izgleda, sterilni, sa izra`enim, hipogonadizmom i izdu`enim ekstremitetima. Njihov izgled direktno je povezan sa smanjenom produkcijom testosterona. Na 1000 de~aka rodi se jedan sa dizomijom X - hromozoma. Iako se u citogeneti~koj praksi u 15% slu~ajeva Klinefelter-ov sindrom mo`e na}i u mozai~noj formi: kariotip, 46, XY/47, XXY, kod koje postojanje }elijskih linija sa normalnim kariotipom mo`e da bude razlog za fertilnost ovih mu{karaca, u na{em uzorku oni nisu registrovani. Ekstremni oblici Klinefelter-ovog sindroma sa polizomijom X - hromozoma: kariotipovi 48, XXXY i 49, XXXXY, ina~e veoma retki, ni u na{em uzorku nisu bili prisutni.
335
Dizomija Y - hromozoma kod mu{karaca, kariotip 47, XYY, uz trizomiju X-hromozoma kod `ena, kariotip 47, XXX, predstavlja redak primer aneuploidije u kome je reproduktivni potencijal pacijenata o~uvan. Mu{karac sa dizomijom Y- hromozoma ne razlikuje se bitno od mu{karaca sa normalnim kariotipom 46, XY. U njihove specifi~nosti bi se mogle ubrojati ne{to vi{i rast od proseka i agresivno pona{anje. Treba ipak ista}i da se problemi sa infertilitetom javljaju ne{to ~e{}e nego u populaciji mu{karaca sa normalnim kariotipom.
Po podacima iz literature u~estalost strukturnih aberacija hromozoma manja je u odnosu na u~estalost numeri~kih aberacija hromozoma, kako u op{toj populaciji, tako i u grupi pacijenata le~enih od steriliteta, i kre}e se oko 0,1%. Balansirane translokacije se navode kao naju~estaliji tip od svih strukturnih aberacija. Na{i podaci razlikuju se od citiranih, s obzirom da je na|ena ve}a u~estalost pacijenata sa strukturnim aberacijama hromozoma od pacijenata sa numeri~kim aberacijama hromozoma. U na{em uzorku dominantni tip strukturnih aberacija su inverzije, koje ~ine 63% svih registrovanih strukturnih aberacija. Pored inverzija na|eni su pacijenti sa razli~itim tipovima heterologih i Robertsson-ovih translokacija kao pacijenti sa delecijom Y- hromozoma.
Inverzije
Inverzije nastaju kao rezultat dvostrukog prekida na hromozomu pri ~emu se prekinuti fragment zarotira za 180o pre nego {to }e se hromozom ponovo sastaviti. Prilikom rotacije prekinutog fragmenta izmeni se linearni raspored gena na hromozomu.
336
Ukoliko se jedan prekid desi iznad, a drugi ispod centromere, tako da invertovani fragment obuhvata centromeru, inverzija se naziva pericentri~na. U slu~aju pericentri~ne inverzije menja se morfologija hromozoma. Ukoliko se dvostruki prekid desi na jednom od krakova hromozoma, inverzija je paracentri~na i ne dolazi do promene morfologije hromozoma. Inverzije, skoro po pravilu, ne pokazuju {tetne posledice za nosioca. Mo`e do}i do pozicionog efekta, {to podrazumeva izmenjenu ekspresiju gena. Pove}ana aktivnost nekih protoonkogena mo`e prouzrokovati transformaciju normalne }elije u malignu, dok smanjena aktivnost gena dovodi do nedostatka odre|enog proteina }eliji, {to se tako|e manifestuje kao poreme}aj. Iako je u literaturi opisan veoma velik broj pojedina~nih primera u kojima je kod nosioca razli~itih tipova inverzija bio ispoljen neki poreme}aj ili oboljenje, smatra se da je prisustvo invertovanog hromozoma uglavnom bilo rezultat slu~ajnosti, a ne razlog za ispoljavanje oboljenja. Osnovni problem za nosioca invertovanog hromozoma sastoji se u naru{enom procesu gametogeneze. Taj problem je izra`eniji kod mu{karaca nego kod `ena.
Nezavisno od tipa hromozoma, oligospermija ili azospermija prisutni su skoro po pravilu kod nosioca pericentri~nih inverzija. [to je invertovani fragment na hromozomu ve}i posledice na spermatogenezu su te`e. Razlog za poreme}aj gametogeneze le`i u ~injenici da je ote`ano sparivanje invertovanog hromozoma i njegovog homologog para u mejozi. Ne retko, kada je invertovani fragment veoma velik, sinapti~ki kompleks se, ~ak, i ne formira asinapsis, pa se kao posledica toga stvaraju aneuploidni gameti, gameti sa vi{kom ili nedostatkom hromozoma.
U slu~ajevima gde se sinapti~ki kompleks formira, sinapsiranje izme|u normalnog i invertovanog hromozoma se odvija tako {to invertovani hromozom pravi petlju da bi se identi~ni genski lokusi normalnog i invertovanog hromozoma sparili. U retkim slu~ajevima kada se rekombinacija ili crossing-over desi u regionu inverzione petlje stvori}e se nebalansirani hromozomi sa duplikacijom i delecijom. Gameti koji budu sadr`avali nebalansirane hromozome, nebalansirani gameti, prilikom sparivanja sa normalnim gametima da}e potomstvo sa poreme}ajem. U na{em uzorku registrovane su inverzije tri razli~ita hromozoma:
337
- Inverzija hromozoma 9 u 25 slu~ajeva - Inverzija hromozoma 1 u jednom slu~aju - Inverzija hromozoma 19 u jednom slu~aju. Sve inverzije u zavisnosti od veli~ine invertovanog fragmenta pokazuju razli~it stepen negativnih posledica na reprodukciju. Kod mu{karaca je {tetni efekt lak{e uo~ljiv s obzirom na ~injenicu da se u ve}ini slu~ajeva, bez obzira na tip inverzije, javlja oligospermija. Najzna~ajnija i naj~e{}e na|ena inverzija je inverzija hromozoma 9, koja pored oligospermije u odre|enom broju slu~ajeva dovodi i do azospermije.
akrocentri~ne hromozome, hromozomi D grupe 13, 14, i 15 i hromozomi G grupe 21 i 22. Kao rezultat razmene gena izme|u dva akrocentri~na hromozoma nastaje jedan hromozom sa skoro celokupnom koli~inom gena dva hromozoma i jedan hromozom sa zanemarljivo malom koli~inom gena koji se gubi, tzv. minutni hromozom.
Translokacije
Translokacije predstavljaju razmenu segmenata izme|u dva hromozoma. One mogu biti recipro~ne, kada svaki hromozom daje i dobija odre|eni segment, ili nerecipro~ne, kada segment jednog hromozoma prelazi na drugi hromozom.
Nerecipro~ne translokacije jo{ se nazivaju i insrecije. Poseban vid recipro~nih translokacija su Robertsson-ove translokacije ili hromozomske fuzije. One su karakteristi~ne za
Na taj na~in svaki nosilac Robertssonove translokacije sadr`i u somatskim }elijama 45 umesto 46 hromozoma. Uprkos ~injenici da nedostaje jedan ceo hromozom, zbog postojanja translociranog hromozoma koji sadr`i skoro kompletnu koli~inu gena dva hromozoma, kariotip nosioca Robertsson-ove translokacije ozna~ava se kao balansiran. Nosioce translokacija, uglavnom, karakteri{e normalan fenotip. Kao i u slu~aju inverzija i kod nosioca translokacija mo`e da se ispolji pozicioni efekt. Njihova gametogeneza je specifi~na, jer se svaki translocirani hromozom sparuje sa homologim regionima dva hromozoma istovremeno, pa se u pahitenu prve mejoti~ke deobe umesto bivalenata formira kvadrivalent, kod obi~nih heterologih translokacija, ili trivalent kod Robertssonovih translokacija.
338
Razdvajanje trivalenta ili kvadrivalenta mo`e se odigrati na tri na~ina. U dva slu~aja na kraju mejoze dobijaju se gameti sa nebalansiranim kariotipom, gameti koji imaju duplirane gene jednog hromozoma translokacione dizomije i istovremeno nedostatak gena drugog hromozoma. Ovakav tip razdvajanja naziva se susedni, a rezultat dva tipa susednog razdvajanja je formiranje ~etiri tipa razli~itih gameta sa nebalansiranim kariotipom. U jednom slu~aju razdvajanje mo`e da bude tako da u jednu }eliju odu translocirani hromozomi, ili samo jedan translocirani u slu~aju Robertsson-ovih translokacija, a da u drugu }eliju odu dva normalna hromozoma. Ovakvo razdvajanje kvadrivalenta ili trivalenta naziva se naizmeni~no ili alternativno i rezultira}e nastankom normalnih gameta i gameta sa balansiranim kariotipom na kraju mejoze.
Iz svega izlo`enog mo`e se zaklju~iti da svaki nosilac translokacije formira {est tipova razli~itih gameta, pri ~emu samo u jednom slu~aju nastaje gamet sa normalnim kariotipom i u jednom slu~aju gamet sa balansiranim kariotipom. Pod pretpostavkom da je verovatno}a nastanka svih tipova gameta podjednaka, procenjuje se da svaki nosioc translokacije nosi rizik od 2/3 ili 66% za dobijanje nenormalnog potomstva. Verovatno}a da se dobije normalan potomak iznosi svega 1/6. U na{em uzorku od ukupnog broja translokacija preovladavali su pacijenti sa Robertsson-ovim translokacijama. Od Robertsson-ovih translokacija su na|ene: - Translokacija hromozoma 14 i 21, kariotip 45, XX t (14/21) - Translokacija hromozoma 13 i 14, kariotip 45, XY t (13/14).
339
U slu~aju braka normalnog mu{karca i `ene sa translokacijom 14 i 21 rizik po potomstvo je prikazan na slede}oj slici.
Robertsson-ove translokacije u kojima u~estvuje hromozom 21 predstavljaju posebnu nepovoljnost za nosioce, po{to kod njih postoji pove}an rizik za dobijanje deteta sa Down-ovim sindromom, teoretska verovatno}a 16%. Zbog toga se svim trudnicama koje poseduju ovu anomaliju preporu~uje prenatalna dijagnostika. Kod `ena nosioca translokacije registruje se pove}an broj spontanih poba~aja. Do njih dolazi po{to jajnu }eliju sa nebalansiranim kariotipom oplodi normalan spermatozoid. Embrion koji tom prilikom nastaje uglavnom je inkompatibilan sa `ivotom.
Mu{karce nosioce Robertsson-ove translokacije, pored rizika za dobijanje nenormalnog potomstva, ~esto prati oligospermija, {to kod njih dodatno komplikuje planiranje porodice. Od heterologih translokacija na|eni su pacijenti kod kojih je do{lo do razmene izme|u hromozoma 7 i 15, kao i izme|u hromozoma 2 i 9.
340
Delecije
Delecije predstavljaju gubitak gena sa hromozoma. One mogu biti terminalne, kada jednostruki prekid dovodi do gubitka hromozomskih krajeva, ili intersticijalne, kada dvostruki prekid unutar hromozoma izazove gubitak prekinutog fragmenta. Sve delecije su veoma {tetne za nosioca, ali stepen {tetnosti varira u zavisnosti od veli~ine izgubljenog fragmenta, kao i od hromozoma na kome je do gubitka do{lo. Delecije se nazivaju i parcijalne monozomije, po{to je odre|en broj gena zbog gubitka homologog para prisutan u jednoj dozi. ^esto delecije imaju letalan efekat. U najpoznatije primere delecija u humanoj genetici mogu se navesti: delecija kratkog kraka hromozoma 5, 5p-, sindrom ma~jeg pla~a, delecija dugog kraka hromozoma 13, 13q-, Praeder-Vili-ov sindrom. Neki oblici
tumora kao {to je retinoblastom mogu nastati kao rezultat delecije na dugom kraku hromozoma 13. Od svih delecija najmanje su {tetne delecije na Y - hromozomu. U odnosu na svoju veli~inu ovaj hromozom sadr`i relativno malo gena, oko 50. Najbitniji je gen koji kontroli{e transformaciju Milerovih kanala u Volfove, tj diferencijaciju testisa. Gubitak ovog gena, gena za TDF - testis determining factor, mo`e izazvati sindrom reverzije pola. Pored ovog, za proces spermatogeneze su bitna tri genska lokusa koja kontroli{u sintezu takozvanih faktora azospermije, geni AZF - azoospermia factors a, b, i c . Gubitak nekog od njih uslovi}e oligospermiju, dok gubitak sva tri izaziva azospermiju. Neki podaci govore da je zastupljenost delecija Y - hromozoma prisutno kod 20% pacijenata sa oligospermijom ili azospermijom.
341
Zemlje
Belgija ^eka Republika Danska Finska Francuska Nema~ka Gr~ka Ma|arska Island Irska Italija Holandija
Broj IVF klinika u zemlji Broj Izvetaji klinika klinika 27 25 16 16 18 93 46 8 1 5 115 13 7 16 17 88 103 8 7 1 3 75 13
Tretmani IVF 3316 1459 ICSI 5667 706 FER 2340 376 OD 500 64 158 290 143 0 244 18 23 0 806 0 Ali 11823 2605 9682 7489 56754 63005 5888 2157 364 1570 19835 15062
5278 3004 1242 2651 1672 2876 23347 23228 10036 35285 16991 10729 2310 3075 259 772 1355 12 153 103 85 782 527 261 6876 9419 2734 9563 4162 1336
342
Norve{ka Poljska Portugal Slovenija Rusija [panija [vedska [vajcarska Velika Britanija Ukrajina Ukupno
8 15 16 3 30 182 15 17 75 10 >729
8 12 11 3 21 36 15 17 75 8 569
0 35 0 0
Tabela prikazuje broj svih stimulisanih ciklusa zabele`enih u svakoj zemlji, broj klinika u zemlji i broj klinika koje su slale izve{taj za registraciju. Ciklusi su podeljeni na IVF - in vitro fertilisation, ICSI - intra citoplasmatic sperm injection, FER - frozen
Tabela 4-25: Broj prijavljenih ciklusa, poro|aja i beba u odnosu na populaciju i nacionalni broj `ivo-ro|ene dece. Ciklusi uklju~uju IVF, ICSI, FER i OD.
Zemlje
Broj Populacija Cik/mi ART ART Nacionalni ART ciklusa br 1 poro|aji bebe br.poro|aja bebe% 5.25 5.18 59.08 0.28 15.93 4.47 8.87 7.21 59.76 166.07 1830 1446 961 1300 946 971 1038 644 580 856 2457 1184 8357 102 NA 860 1854 783 5553 2457 1293 10334 166 NA 1223 2253 809 7677 67081 56742 744791 4315 59234 90441 78458 679029 3,7% 2,3% 1,4% 3,8% 2,1% 2,5% 1,0% 1,1%
Danska 9682 Finska 7489 Francuska 56754 Island 364 Holandija 15062 Norve{ka 4340 [vedska 9205 [vajcarska 4644 Velika Britanija 34634 Ukupno 1421744
343
Zemlje kod kojih su kompletno sve klinike koje rade slale izve{taje nacionalnom registru date su u slede}oj tabeli. Tabela prikazuje podatke devet zemalja iz kojih su sve klinike slale izve{taje za Registar: Danska, Finska, Francuska, Island, Holandija, Norve{ka, [vedska, [vajcarska i Velika Britanija. Na taj na~in se broj ciklusa odnosi na ukupnu populaciju u zemlji. Osim toga, broj beba ro|enih nakon ART - assisted reproductive technology je izra`en kao pro-
cenat ukupnog broja poro|aja u zemlji. Ukupno je ura|eno 142.174 ciklusa u populaciji od 116 miliona, {to daje srednju vrednost od 856 ciklusa po milionu stanovnika. Broj beba ro|enih nakon ART - assisted reproductive technology se kre}e od 1% do 3.8%. Slede}a tabela prikazuje raspodelu veli~ine 569 klinika koje su slale izve{taje. Veli~ina klinike ili odeljenja je bazirana na svim ciklusima koji su obavljeni tokom godine.
Broj IVF klinika Veli~ina klinika u zemlji Broj Izve{taj <100 100 -199 200-499 500-1000 >1000 Zemlje klinika klinika ciklusa ciklusa ciklusa ciklusa ciklusa Belgija 27 25 2 6 10 5 2 ^eka Republika 16 7 1 1 13 2 0 Danska 16 16 1 1 4 9 1 Finska 18 17 2 1 9 3 2 Francuska 93 88 5 6 28 36 13 Nema~ka 103 16 11 29 25 22 Gr~ka 46 8 0 3 3 1 1 Ma|arska 8 7 2 1 3 1 0 Island 1 1 0 0 1 0 0 Irska 5 3 0 1 1 1 0 Italija 115 75 25 24 12 12 2 Holandija 13 13 0 1 0 6 6 Norve{ka 8 8 0 0 5 3 0 Poljska 15 12 4 3 3 2 0 Portugalija 16 11 3 4 3 1 0 Slovenija 3 3 0 0 1 1 1 Rusija 30 21 5 8 5 3 0 [panija 182 36 4 9 14 6 3 [vedska 15 15 2 0 3 7 3 [vajcarska 17 17 4 6 4 2 1 Velika Britanija 75 75 7 17 20 24 7 Ukrajina 10 8 4 2 2 0 0 >729 569 87 105 163 150 64 Ukupno
344
Tabela 4-27: Procentualna starost `ena tretiranih sa IVF - in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection
Zemlje Belgija ^e{ka Republika Danska Finska Francuska Nema~ka Gr~ka Ma|arska Island Irska Italija Holandija Norve{ka Poljska Portugalija Rusija Slovenija [panija [vedska [vajcarska Velika Britanija Ukrajina Ukupno, opseg
< 29 Godina 23% 49% 22% 19% 20% 18% 9% 28% 23% 5% 13% NA NA 13% 18% 25% 14% 14% 14% 13% 9% 37% 5-49%
30 - 34 Godina 37% 30% 40% 32% 39% 38% 37% 37% 29% 34% 34%
35 - 39 Godina 26% 17% 32% 29% 33% 33% 39% 25% 39% 46% 46%
> 40 Godina 13% 4% 7% 20% 13% 11% 15% 11% 9% 15% 15%
35% 43% 29% 25% 37% 36% 35% 36% 33% 25-43%
27% 33% 29% 50% 37% 36% 36% 38% 22% 17-50%
Tabela prikazuje procentualnu starost tretiranih `ena u raznim zemljama. U razli~itim zemljama opseg starosti `ena do
29 godina je od 5 % - 49%, 30 - 34. godine 25% - 43%, 35 - 39. godine 17% - 50%, i preko 40 godina 4% - 20%.
345
Tabela 4-28: Broj transferisanih embriona nakon IVF - in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection
Zemlje Belgija ^e{ka Republika Danska Finska Francuska Nema~ka Gr~ka Ma|arska Island Irska Italija Poljska Portugalija Rusija Slovenija [panija [vedska [vajcarska Velika Britanija Ukrajina Ukupno
2 embriona 3 embriona 4embriona Ukupno 1embrion % % % % transfera 7754 1003 12.9% 3996 51.5% 2229 28.7% 526 6.8% 1783 7053 3756 36406 40928 4713 1853 235 1144 13150 2563 1625 5005 1600 8857 6586 2537 22783 970 198 990 1015 5055 4689 432 141 22 81 1745 431 176 529 327 340 829 340 1825 89 11.1% 14.0% 27.0% 13.9% 11.5% 9.2% 7.6% 9.4% 7.1% 13.3% 16.8% 10.8% 10.6% 20.4% 27.0% 12.6% 13.4% 8.0% 9.2% 513 5477 2525 16677 18154 786 355 164 462 4396 1458 569 974 1042 1956 5507 1467 13261 178 28.8% 77.7% 67.2% 45.8% 44.4% 16.7% 19.2% 69.8% 40.4% 33.4% 56.9% 35.0% 19.5% 65.1% 22.1% 83.6% 57.8% 58.2% 18.4% 734 586 226 11144 18085 1496 885 49 578 5016 535 783 1657 231 3933 249 687 7697 282 41.2% 8.3% 6.0% 30.6% 44.2% 31.7% 47.8% 20.9% 50.5% 38.1% 20.9% 48.2% 33.1% 14.4% 44.4% 3,8% 27.1% 33.8% 29.1% 338 0 5 1747 0 1999 472 0 23 1993 139 97 1774 0 2138 0 43 0 421 19.0% 0.0% 0.1% 4.8% 0.0% 42.2% 25.5% 0.0% 2.0% 15.2% 5.4% 6.0% 35.4% 0.0% 24.1% 0.0% 1.7% 0.0% 43.4%
Tabela prikazuje broj transferisanih embriona nakon kombinovane IVF-in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. Ukupan broj transfera jednog embriona je bio 20 756 (12.1%), dva embriona 79 917 (46.7 %), tri embriona 57 082 (33.3%) i ~etiri ili vi{e embriona 11 715 (6.8%). Kao {to se iz tabele vidi, postoje zapa`ene razlike me|u dr`avama u broju tran-
346
Inicirani Aspir- Tran- Trudn- Poro|o}e aji po ciklusi racije sferi ciklusu Belgija 3316 2944 2708 775 619 23.4% ^e{ka Republika 1459 1395 1166 357 232 24.5% Danska 5278 4999 4418 1395 1097 26.4% Finska 2651 2546 2242 671 530 25.3% Francuska 23347 20513 17433 4654 3508 19.9% Nema~ka 35285 30353 25327 6827 4489 19.3% Gr~ka 2310 2138 1929 645 487 27.9% Ma|arska 772 699 630 183 137 23.7% Island 153 153 138 63 53 41.2% Irska 782 725 682 166 135 21.2% Italija 6876 6061 5235 1421 1106 20.7% Holandija 9563 8426 7294 2374 24.8% Norve{ka 2624 2463 2229 654 549 24.9% Poljska 1065 1022 898 183 139 17.2% Portugalija 896 807 725 178 125 19.9% Rusija 4155 3793 3615 1100 607 26.5% Slovenija 975 902 789 256 199 26.8% [panija 3974 3406 3032 982 601 24.7% [vedska 4048 3699 3392 1146 889 28.3% [vajcarska 954 871 769 176 140 18.4% Velika Britanija 15694 14015 12794 3489 2725 22.2% Ukrajina 802 778 736 181 128 22.6% Ukupno 126961 112708 98181 27876 22.0% Zemlje
Tabela prikazuje broj trudno}a i poro|aja u odnosu na broj iniciranih ciklusa, aspiracija i transfera za IVF - in vitro fertilisation Nakon IVF - in vitro fertilisation, 27 876 trudno}a rezultovalo iz 98 181 transfera embriona. Prema tome je srednji klini~ki
Trudno}e
po 26.3% 25.6% 27.9% 26.4% 22.7% 22.5% 30.2% 26.2% 41.2% 22.9% 23.4% 28.2% 26.6% 17.9% 22.1% 29.0% 28.4% 28.8% 31.0% 20.2% 24.9% 23.3% 24.7%
po 28.6% 30.6% 31.6% 29.9% 26.7% 27.0% 33.4% 29.0% 45.7% 24.3% 27.1% 32.5% 29.3% 20.4% 24.6% 30.4% 32.4% 32.4% 33.8% 22.9% 27.3% 24.6% 28.4%
aspiraciji transferu
broj trudno}a po transferu embriona bio 28.4% sa opsegom od 20.4 do 47.70%. Broj poro|aja po transferu embriona nakon IVF - in vitro fertilisation nije sumiran zbog nekompletnog pra}enja trudno}e u mnogim zemljama.
347
Aspir- Tran- Trudn- Poro|Ciklus Zemlje o}e aji po i racije sferi ciklusu Belgija 5667 5318 5046 1443 1172 25.5% ^e{ka Republika 706 694 617 146 101 20.7% Danska 3004 2884 2635 846 685 28.2% Finska 1672 1638 1514 417 323 24.9% Francuska 23228 20921 18973 5419 3913 23.3% Nema~ka 16991 16441 15601 4176 2804 24.6% Gr~ka 3075 2947 2784 928 672 30.2% Ma|arska 1355 1328 1223 351 242 25.9% Island 103 103 97 43 35 41.7% Irska 527 479 462 113 90 21.4% Italija 9419 8672 7915 2084 1735 22.1% Holandija 4162 3840 3579 1266 NA 30.4% Norve{ka 1405 1333 1226 327 275 23.3% Poljska 1812 1762 1665 537 418 29.6% Portugalija 1063 966 900 217 155 20.4% Rusija 1440 1398 1390 394 224 27.4% Slovenija 1046 995 811 255 203 24.4% [panija 6645 6233 5833 2002 1253 30.1% [vedska 3749 3513 3194 988 771 26.4% [vajcarska 2010 1947 1768 455 336 22.6% Velika Britanija 10645 10637 9989 2673 2141 25.1% Ukrajina 252 247 234 48 33 19.0% Ukupno 99976 94296 87456 25128 25.1%
Nakon ICSI - intra citoplasmatic sperm injection, 25128 trudno}a je rezultovalo iz 87 456 transfera embriona. Srednji klini~ki broj trudno}a po transferu embriona je bio 28.7% sa
Trudno}e
po 27.1% 21.0% 29.3% 25.5% 25.9% 25.4% 31.5% 26.4% 41.7% 23.6% 24.0% 33.0% 24.5% 30.5% 22.5% 28.2% 25.6% 32.1% 28.1% 23.4% 25.1% 19.4% 26.6%
po 28.6% 23.7% 33.1% 27.5% 28.6% 26.8% 33.3% 28.7% 44.3% 24.5% 26.3% 35.4% 26.7% 32.3% 24.1% 28.3% 31.4% 34.3% 30.9% 25.7% 26.8% 20.5% 28.7%
aspiraciji transferu
opsegom od 20.5 do 44.3%. Broj poro|aja po transferu embriona nakon ICSI intra citoplasmatic sperm injection nije sumiran zbog nekompletnog pra}enja trudno}a u mnogim zemljama
348
Zemlje Belgija ^e{ka Republika Danska Finska Francuska Nema~ka Gr~ka Ma|arska Island Irska Italija Holandija Norve{ka Poljska Portugalija Rusija Slovenija [panija [vedska [vajcarska Velika Britanija Ukrajina Ukupno
Poro|aji po Trudno}e po Otapa- Tran- Trud- Poro|nje sferi no}e aji otapanju transferu otapanju transferu 2340 507 1242 2876 10036 10729 259 12 85 261 2734 311 816 120 316 371 2323 1408 1680 6160 8 1879 464 970 2488 8753 9546 247 8 83 219 2368 1337 225 697 107 279 340 1872 1208 1487 5569 8 40154 263 45 163 448 1284 1541 76 3 21 43 462 270 43 94 19 50 51 366 259 246 914 2 6663 207 20 135 331 936 937 51 0 14 34 350 NA 36 75 7 33 38 245 194 184 697 1 11.2% 8.9% 13.1% 15.6% 12.8% 14.4% 29.3% 25.0% 24.7% 16.5% 16.9% 13.8% 11.5% 15.8% 15.8% 13.7% 15.8% 18.4% 14.6% 14.8% 25.0% 14.0% 9.7% 16.8% 18.0% 14.7% 16.1% 30.8% 37.5% 25.3% 19.6% 19.5% 20.2% 19.1% 13.5% 17.8% 17.9% 15.0% 19.6% 21.4% 16.5% 16.4% 25.0% 16.6% 8.8% 3.9% 10.9% 11.5% 9.3% 8.7% 19.7% 0.0% 16.5% 13.0% 12.8% 11.6% 9.2% 5.8% 10.4% 10.2% 10.5% 13.8% 11.0% 11.3% 12.5% 11.0% 4.3% 13.9% 13.3% 10.7% 9.8% 20.6% 0.0% 16.9% 15.5% 14.8% 16.0% 10.8% 6.5% 11.8% 11.2% 13.1% 16.1% 12.4% 12.5% 12.5%
Tabela pokazuje da je nakon FER frozen embryo replacement 6 663 trudno}e rezultovalo iz 40155 transfera. Srednji klini~ki broj trudno}a po transferu embriona nakon FER - frozen embryo replace-
ment je bio 16.6%. Broj poro|aja po transferu embriona nakon FER - frozen embryo replacement nije sumiran zbog nekompletnog pra}enja trudno}a u mnogim zemljama.
349
Zemlje
Belgija 500 ^e{ka Republika 78 Danska 158 Finska NA Francuska 143 Nema~ka 0 Gr~ka 244 Ma|arska 18 Island 23 Irska 0 Italija 806 Holandija NA Norve{ka 0 Poljska 35 Portugalija 0 Rusija 452 Slovenija 0 [panija 1577 [vedska 0 [vajcarska 0 Velika Britanija 2135 Ukrajina 85 Ukupno
359 50 132 290 214 0 223 16 20 0 722 NA 0 35 0 383 0 1416 0 0 1982 83 5925
86 7 47 91 41 71 6 9 214
70 1 26 61 NA 33 NA 8 161
17.2% 24.0% 14.0% 9.0% 14.0% 1.3% 2.0% 19.7% 35.6% 16.5% 19.7% 31.4% 21.0% 28.7% 19.2% 29.1% 31.8% 13.5% 14.8% 33.3% 37.5% 39.1% 45.0% 34.8% 40.0% 26.6% 29.6% 20.0% 22.3%
11 137 662
11 0 89 357
31.4% 31.4% 31.4% 31.1% 30.3% 35.8% 19.7% 23.2% 42.0% 46.8% 22.6% 25.2%
549 20 1951
403 15
350
Zemlje Belgija ^e{ka Republika Danska Finska Francuska Nema~ka Gr~ka Ma|arska Island Irska Italija Holandija Norve{ka Poljska Portugalija Rusija Slovenija [panija [vedska [vajcarska Velika Britanija Ukrajina Ukupno
Jedna beba %
Blizanci% Trojke %
207 20 135 331 936 937 51 0 14 34 350 NA 36 75 7 33 38 245 194 184 697 1
263 45 163 448 1284 1541 74 2 21 43 462 270 43 94 19 53 51 366 259 246 914 2 6663
NA 1 1 6 57 12 1 0 29 NA 0 0 8 4 8 29 0 8 142 0
NA
NA
NA
16 80.0% 4 20.2% 0 0.0% 107 79.3% 28 20.7% 0 0.0% 291 87.9% 38 11.5% 2 0.6% 775 82.8% 125 13.4% 5 0.5% 37 72.5% 14 27.5% 0 0.0% 0 11 78.6% 3 21.4% 0 0.0% 25 73.5% 7 20.6% 2 5.9% 313 89.4% 34 9.7% NA NA 3 0.9% NA
26 72.2% 10 27.8% 0 0.0% 67 89.3% 8 10.7% 1 1.3% 7 1 00.0% 0 38 100.0% 0 0.0% 0.0% 0 0.0% 0 0.0% 0.0% 29 87.9% 4 12.1% 0 0.0% 129 80.0% 46 18.8% 3 1.2% 169 87.1% 25 12.9% 0 157 85.3% 26 14.1% 1 100.0% 0 0.0% 1 0.5% 0 0.0
577 82.8% 108 15.5% 11 1.6% 3632 84.7% 617 14.4% 37 0.9%
Tabela prikazuje poro|aje nakon IVF i ICSI, i to poro|aj jedne bebe, blizanaca, trojki i ~etvorki. Poro|aji jedne bebe, blizanaca, trojki i ~etvorki nakon IVF - in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection.
Mo`e se videti da je raspodela poro|aja slede}a: jedna beba 25 336 (73.6%), blizanci 8396 (24.4%), trojki 674 (2%) i ~etvorki 13 (0.04%). Poro|aji jedne bebe, blizanaca, trojki i ~etvorki nakon FER - frozen embryo replacement.
351
Tabela prikazuje poro|aje nakon FER frozen embryo replacement u odnosu na poro|aj jedne bebe, blizanaca, trojki i ~etvorki. Mo`e se videti da je raspodela poro|aja slede}a: jedna beba 3632 (84.7%), blizanci 617 (14.4%), trojke 37 (0.9%) i ~etvorki 2 (0.05%).
Tabela prikazuje udeo novoro|en~adi koja su ro|ena kao jedna beba, blizanci, trojke i ~etvorke nakon IVF - in vitro fertilisation i ICSI intra citoplasmatic sperm injection tretmana.
Tabela 4-34: Procenat novoro|en~adi ro|enih kao jedna beba, blizanci, trojke, ~etvorke
Zemlje Belgija ^e{ka Republika Danska Finska Francuska Nema~ka Gr~ka Ma|arska Island Irska Italija Holandija Norve{ka Poljska Portugalija Rusija Slovenija [panija [vedska [vajcarska Velika Britanija Ukrajina Ukupno
Ukupno beba 444 2260 1150 9302 9324 1548 526 121 297 3630 1177 899 375 1239 500 2529 2034 597 6334 264 44587
Jedna beba NA 52.3% 57.9% 59.8% 60.4% 58.3% 51.1% 47.9% 46.3% 54.2% 59.6% NA 51.1% 46.8% 52.8% 50.2% 61.4% 49.6% 63.5% 61.0% 55.1% 37.1% 56.7%
Blizanci NA 41.0% 41.6% 39.7% 37.1% 36,0% 44.8% 40.7% 51.2% 37.7% 31.5% NA 47.9% 28.3% 35.2% 42.3% 36.8% 41.6% 35.6% 34.5% 39.7% 56.1% 38.7%
Trojke NA 6.8% 0.5% 0.5% 2.4% 5.6% 4.1% 11.4% 2.5% 8.1% 8.0% NA 1.0% 2.7% 12.0% 7.5% 1.8% 8.7% 0.9% 4.5% 5.2% 6.8% 4.5%
^etvorke NA 0.0% 0.0% 0.0% 0.1% 0.1% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 1.9% NA 0.0 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.2% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.1%
352
Ukupno komplikacija Zemlje OHSS pri pribavlj- Krvarenje Infekcija anju oocita Belgija 139 17 8 9 ^e{ka Republika 25 7 4 2 Danska NA NA Na NA Finska NA NA Na NA Nema~ka 336 377 278 0 Gr~ka 36 1 2 2 Ma|arska 23 1 0 1 Island 2 1 0 1 Irska 11 1 2 1 Italija 255 51 41 10 Holandija NA NA Na NA Norve{ka 31 9 3 1 Poljska 54 6 6 0 Portugalija 11 0 0 0 Rusija 158 32 29 3 Slovenija 21 2 2 0 [panija 75 24 S 5 [vedska NA NA Na NA [vajcarska 17 1 0 1 Velika Britanija 376 120 6 0 Ukrajina 16 2 2 0 Ukupno 1586 652 388 36
Tabela predstavlja incidenciju OHSS ovarian hyperstimultion syndrome-a koja je zabele`ena u registrima 17 zemlje. Vidi se da je bilo 1586 slu~ajeva ovog sindroma. Broj IVF - in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection ciklusa u ovih 17 zemalja je bio 146 342, {to odgo-
Smrt majke 0 0 NA NA 0 0 0 0 0 NA 0 0 0 0 0 0 NA 0 0 0
vara incidenci od 1.1% od svih stimulisanih ciklusa. Iz istih zemalja je zabele`eno 652 komplikacije pri aspiraciji oocita. Ova tabela, tako|e, daje podatke o zabele`enim elektivnim fetalnim redukcijama. Ukupno je zabele`eno 256 slu~ajeva.
353
Radi sistematizacije bolje kontrole programa asistirane reprodukcije ESHRE european society for human reproduction and embryology uvodi parametre visokog kvaliteta. Jedan od parametara visokog kvaliteta definisan je kao broj poro|aja po transferisanom embrionu, {to zna~i koliko se implantira embriona za jednu trudno}u. Nakon IVF - in vitro fertilisation i ICSI intra citoplasmatic sperm injection, 20 zemalja je transferisalo 398 952 embriona i ovo je rezultovalo 35 928 poro|aja. Broj transferisanih embriona za svaki poro|aj je prema tome 11,1. Broj poro|aja po transferisanom embrionu je bio 0.09%, {to zna~i da je na 11,1 embrion bila jedna trudno}a. Analiziraju}i ove podatke, va`no je napomenuti da je jedan broj trudno}a izgubljen u pra}enju, pa ovi podaci ostaju samo procena. Drugi parametar visokog kvaliteta je broj ro|enja jedne bebe po transferu. Nakon IVF - in vitro fertilisation i nakon 167 097 transfera, broj ro|enja jedne bebe po transferu je bio 15.2%. Uzimaju}i u obzir ovaj broj va`no je imati na umu da se jedan broj trudno}a gubi u pra}enju, pa ta~an broj poro|aja ostaje nepoznat. PGD - preimplantation genetic diagnosis je zabele`ena u sedam zemalja: Belgiji, Danskoj, Gr~koj, Ma|arskoj, Italiji, Portugalu i Rusiji. Ukupno 543 ciklusa, 533 aspiracija i 362 transfera je rezultovalo sa 106 trudno}a i 78 poro|aja. Ovo daje klini~ki broj trudno}a od 19.5% po ciklusu, 19.39% po aspiraciji i 29.2% po transferu. Navedeni izve{taj je ~etvrti uzastopni evropski izve{taj o IVF - in vitro fertilisation podacima i pokriva cikluse tretmana iz godine 1997., 1998., 1999. i 2000. Broj zemalja koje su izve{tavale je nepromenjen od 1999. godine i okuplja 22
zemlje koje pokrivaju celu Zapadnu Evropu sa izuzetkom Austrije i Luksemburga koji nema IVF - in vitro fertilisation centre. Devet zemalja u~esnica ve} ima kompletne izve{taje u svom sistemu: Danska, Finska, Francuska, Island, Holandija, Norve{ka, [vedska, [vajcarska i Velika Britanija. Broj prijavljenih ciklusa nastavlja da raste. Godine 2000. je 569 klinika prijavilo 279 267 ciklusa, {to je pove}anje od 8% u odnosu na 1999. godinu. Od 1997. godine do 1998. je pove}anje iznosilo 14% , a od 1998. godine do 1999. godine je 11%. Ukupno, ovo zna~i pove}anje sa 203 893 ciklusa u 1997.godini na 279 267 u 2000. godini i ekvivalentno je u porastu od 37% tokom perioda od ~etiri godine. Ovo zapa`eno pove}anje je delimi~no posledica boljeg izve{tavanja, ali je i posledica pro{irenja aktivnosti u nekim zemljama. Poslednji svetski izve{taj o IVF - in vitro fertilisation podacima iz 1998. godine je zabele`io 388 000 procedura {irom sveta i procenjuje sa da ovaj broj predstavlja 80% od ukupnih aktivnosti. U Sjedinjenim Dr`avama je zabele`eno 88 077 ciklusa od 1999. godine. Ovo zna~i da pribli`no 60% zabele`enih IVF - in vitro fertilisation aktivnosti poti~e iz Evrope. U samoj Evropi, najve}i broj poku{aja dolazi iz Nema~ke sa 63 000 ciklusa, Francuske sa 57 000 ciklusa i Velike Britanije sa 34 000 ciklusa. U Italiji je prijavljeno blizu 200 000 ciklusa u 2000. godini. [panija ima podatke od samo 36, od pribli`no 180 klinika, iako su uglavnom ve}e klinike prijavile 14 500 ciklusa u [paniji, veoma je verovatno da se samo mali deo ART - assisted reproductive technology aktivnosti iz [panije evidentira.
354
Odnos standardnih IVF - in vitro fertilisation procedura i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection procedura je ostao isti u 2000. godini u pore|enju sa prethodne dve godine, 56% standardnih IVF - in vitro fertilisation u odnosu na 44% ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. U nekim zemljama je ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metoda rasprostranjenija od IVF in vitro fertilisation, u Belgiji, Gr~koj, Ma|arskoj, Italiji, Poljskoj, Portugalu, Sloveniji, [paniji i [vajcarskoj. Broj prijavljenih FER - frozen embryo replacement i OD - ovum donation ciklusa je tako|e u porastu u 2000. godini, u odnosu na 1999. godinu. Dostupnost usluga je jo{ uvek najve}a u Danskoj sa 1830 ciklusa na milion stanovnika. Ovaj broj je, tako|e, visok u Skandinaviji, i u Holandiji i Francuskoj. Prose~an broj ciklusa na milion stanovnika u onim zemljama sa kompletnim izve{tavanjem je iznosio 856. Udeo ART - assisted reproductive technology dece u ukupnom broju ro|ene dece je bio najve}i u Skandinaviji i kretao se od 2.1 do 3.8%. Broj transferisanih embriona u IVF - in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection ciklusima se zna~ajno rezlikovao me|u zemljama. Prose~an broj transfera jednog embriona je ostao na oko 12%, dok je udeo transfera dva embriona pove}an sa 39.2% 1999. godine na 46.7% 2000. godine. Udeo transfera tri embriona je smanjen sa 39.6% 1999., na 33.3% u 2000. godini. Broj transfera ~etiri embriona je tako|e smanjen sa 9.3% na 6.8%. Danska, Finska i [vedska su prijavile mali udeo transfera tri embriona. Po prvi put su podaci iz 2000. godine uklju~ivali i broj eSET - elective single embryo transfer-a. Dostupni su bili podaci iz
samo 4 zemlje koje su prijavile 2295 eSET - elective single embryo transfer-a. eSET elective single embryo transfer se pojavio tokom poslednjih godina i broj poro|aja jedne bebe nije promenjen u 2000. godini, kada se uporedi sa prethodnim godinama. Va`no je primetiti da je ukupna pojava vi{estrukih poro|aja nakon IVF - in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection od 26.9% u 2000. godini bila sli~na sa brojem iz 1997. godine. Me|utim, bilo je promena u broju poro|aja trojki koji je smanjen sa 3.6% u 1997. godini na 2.3% u 1998. i 1999. godini, i na 2% u 2000. godini. Postoje velike razlike u brojevima ro|enja trojki me|u raznim zemljama. Ovo je prvi izve{taj o ukupnom broju fetalne redukcije u Evropi. Ukupno je prijavljeno 256 procedura, ali podaci od jednog broja zemalja nisu dostupni, pa je zato mogu}e da je obavljen ve}i broj ovih procedura. Ukupan broj trudno}a za IVF - in vitro fertilisation, ICSI - intra citoplasmatic sperm injection i FER - frozen embryo replacement nastavlja da polako raste. Kod IVF - in vitro fertilisation je sada prose~an broj trudno}a po transferu 28.4% u pore|enju sa 27.7% u 1999. godini. Kod ICSI - intra citoplasmatic sperm injection je 28.7% u pore|enju sa 27.9% u 1999. godini. Kod FER - frozen embryo replacement je 16.6% dok je 1999. godine bio 15.37%. Jo{ jedan na~in za izve{tavanje o uspe{nosti bi bilo zasebno izve{tavanje o broju poro|aja jedne bebe. Trenutno ukupan broj ovih poro|aja iznosi 15.2% po transferu nakon IVF - in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. Alternativni na~in prikazivanja uspe{nosti unutar jednog parametra visokog kvaliteta je bio broj poro|aja po transferisanom embrionu od 0.09% {to je ekvi-
355
valentno sa upotrebom 11 embriona da bi se ostvario jedan poro|aj nakon IVF - in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. Ukupno je prijavljeno 543 PGD preimplantation genetic diagnosis ciklusa, dok ih je 1999. godine bilo 131, {to nagove{tava {irenje ove aktivnosti u slede}im godinama. Rezultati tehnika asistirane reprodukcije, za parove i za dru{tvo, moraju biti nadgledani i pra}eni u svojoj efikasnosti, bezbednosti, kvalitetu, dostupnosti i ceni. Sada{nji izve{taj uklju~uje i podatke o efikasnosti i dostupnosti kao i o jednom veoma va`nom aspektu bezbednosti tj. vi{estrukim trudno}ama. ESHRE - european society for human reproduction and embryology i EIM - european IVF - monitoring programme sada planiraju da pro{ire svoje aktivnosti nadgledanja tehnika asistirane reprodukcije,
uklju~uju}i podatke o bezbednosti, kvalitetu i ceni. Sada{nji, ~etvrti godi{nji ESHRE european society for human reproduction and embryology Izve{taj ART - assisted reproductive technology u Evropi u 2000. godini pokazuje nastavak {irenja izve{tavanja u pogledu centara koji u~estvuju i broju prijavljenih ciklusa. Trendovi postaju vidljivi. Postoji trend ka ve}oj efikasnosti. Poro|aji trojki se re|e pojavljuje nego u prethodnim godinama, ali je broj vi{estrukih trudno}a sa 26.4% sli~an sa prethodnim procentima. U Srbiji je 2006. godine formirana asocijacija centara koji se bave ART - assisted reproductive technology, pa se o~ekuje da se sa 2007. godinom uvede i statisti~ko pra}enje programa sa evidentiranjem godi{njih podataka kod ESHRE - european society for human reproduction and embryology.
356
357
terijama, a u svakom tre}em punktatu folikula mogu da se doka`u bakterije koje tako mogu da budu unete u medijum sa kulturom. Zbog toga je neophodno dodavanje penicilina i streptomicina u medijume sa kulturom. Profilakti~ko davanje antibiotika pacijentkinji, naprotiv ne pobolj{ava rezultate intervencije i stoga se ne preporu~uje. Ejakulat nikada nije apsolutno sterilan. Priprema spermatozoida u laboratoriji putem swim-up tehnike, ili metodom gradijentne selekcije centrifugiranjem, dovodi do efikasne fizi~ke redukcije broja klica. I ovde se kao pouzdana metoda dokazalo dodavanje penicilina. Uz pomo} senzitivnih metoda ispitivanja klica i pored toga mogu da se doka`u u 90 do 99% svih analiza sperme. Identifikuju se, uglavnom, normalna flora distalnog mokra}nog kanala kao i bakterije ko`ne i perinealne flore. Profilakti~ko davanje antibiotika pacijentima isto kao i kod `ena, ne pobolj{ava uspeh ART- assisted reproductive technology i stoga se ne preporu~uje. U embrionalnoj laboratoriji trebalo bi da se u potpunosti radi sa materijalom za jednokratnu upotrebu. Pridr`avanje preporuka o higijeni za rad u sterilnim laboratorijama se podrazumeva. Posebnu pa`nju kao potencijalni izvor infekcije, zaslu`uje medijum u kome se nalazi kultura. Ukoliko se ne koriste industrijski proizvedeni medijumi, koji podle`u kontroli kvaliteta od strane proizvo|a~a, prilikom obrade treba da se po{tuju preporuke American Fertility Society koje podrazumevaju strogu kontrolu kvaliteta kori{}ene vode radi spre~avanja pirogenih, endotoksi~nih i bakterijskih kontaminacija, kao i sterilne uslove spravljanja sirovina sa prevashodnom primenom materijala za jednokratnu upotrebu.
Dok su na raspolaganju rekombinantni serumski suplementi, potrebno je da se po mogu}nosti koriste humane albuminske preparacije iz karantinskog spender pools - a, testirane na HIV - human immunodeficiency virus, HBV - hepatitis B virus, HCV hepatitis C virus, HCMV- human cytomegalo virus i na treponemu pallidum. Do kontaminacije mo`e da do|e i tokom kriokonzervacije i skladi{tenja gameta, odnosno krioprotektiranih jajnih }elija. Te~ni azot mo`e kroz pukotine da prodre u pajete i do|e u kontakt sa infektivnim materijalom. Kriokonzerviran materijal u reproduktivnoj medicini nije ni pribli`no tako visoko optere}en virusima kao krv i ki~mena mo`dina. Pojedina~ne preparacije i kulture, odnosno obrade spermatozoida dovode do fizi~ke redukcije klica. I pored toga, treba da se koriste samo posude za zamrznuti materijal, koje mogu pouzdano da se zatvore, koje ne mogu da postanu porozne i ~ija mehani~ka stabilnost se ne menja prepakivanjem. Osim toga, posuda za skladi{tenje treba da redovno prazne i ~iste. Za{tita osoblja u laboratoriji pri radu sa potencijalnim infektivnim telesnim te~nostima se sprovodi u skladu sa propisima o za{titi od nezgoda no{enjem rukavica, mantila i za{titnih nao~ara zbog opasnosti od prskanja, izbegavanjem o{trih ili {picastih instrumenata, njihovim pravilnim odlaganjem, odricanjem od usnih pipeta kod pojedina~nih manipulacija i manipulacija sa embrionom, redovnom dezinfekcijom radnih povr{ina sa odgovaraju}im sredstvima, kao i opreme laboratorijskih prostorija sa lavaboima za pranje ruku i aparata za ispiranje o~iju za neodlo`nu dekontaminaciju. Podrazumeva se, da tim koji radi u laboratoriji treba da bude vakcinisan protiv hepatitisa B.
358
Ppripremno saniranje hidro-i piosalpinksa Ispiranje vagine i tupferovanje grli}a sterilnim izotonim rastvorom kuhinjske soli pre intervencije Kori}enje instrumenata za jednokratnu upotrebu pri punkciji folikula, preparaciji spermatozoida, kulture embriona i pri prenosu embriona Sterilizacija toplotom i po potrebi ~i}enje ultrazvukom potrebnog pribora koji se koristi vie puta Dopunjavanje medijuma sa kulturom penicilinom i streptomicinom Kontrola kvaliteta medijuma sa kulturom (klice, endotoksini, pirogeni) Kao suplement serumu koristiti samo albuminske preparacije iz testiranih na HIV, HBV, HCV, CMV, treponemu pallidum, karantinski uskladitenih spender pools-a, u slu~aju potrebe koristiti sopstveni serum pacijentkinje Ispiranje jajne }elije i kumulusa medijumom sa kulturom Potovanje detaljnih propisa o higijeni za dobijanje spermatozoida Obrada spermatozoida Kori}enje stabilnih posuda za zamrzavanje Redovno pra`njenje i ~i}enje posuda za skladitenje kriokonzervanta Prevencija vakcinacijom za osoblje laboratorije i higijenske mere zatite
359
360
Pravila i procedure
Sve laboratorijske procedure moraju da uklju~uju pru`anje jedinstvene identifikacije pacijenta uz zadr`avanje poverljivosti prema pacijentu. Laboratorijski rezultati treba da se saop{tavaju u skladu sa pisanom procedurom. Rezultati treba da budu provereni, datirani i treba da uklju~uju jedinstven identitet pacijenta. Bilo kakva interpretacija rezultata treba da bude precizna, iscrpna i klini~ki relevantna. Mora postojati zapis svih reagenasa, kalibracije i materijala za kontrolu kvaliteta. Mora postojati pisani, potpisani i datirani protokol za svaku proceduru, pisani prenos rezultata i redovno odr`avanje opreme. Sve procedure treba da se nalaze u priru~niku u laboratoriji, koji je na raspolaganju. Potrebno je odr`avati dnevnik rada u cilju redovnog procenjivanja rezultata.
Konstrukcija laboratorije treba da osigura asepti~no i optimalno rukovanje gametima i embrionima tokom svih faza tretmana; Lokacija prostora za kultivaciju i opremu, kao {to su inkubatori, centrifuge i kriooprema treba da bude logi~ki planirana unutar svakog radnog prostora; Odvojeni kancelarijski prostor treba da bude obezbe|en za administrativni rad, kao {to je arhiviranje i uno{enje podataka; Op{ti prostor gde se obavlja pranje opreme, sterilizacija, itd., treba da bude odvojen od embriolo{ke laboratorije. Ako se koriste fiksativi, ove analize treba da budu obavljene u zasebnoj prostoriji sa fume-hood. Prilikom pu{tanja laboratorije u rad, treba uzeti u obzir najnovija dostignu}a u proizvodnji opreme i izgradnji pomo}nih prostorija. Visina radnog stola, podesive stolice, visina mikroskopa, efikasna upotreba prostora i povr{ine, odgovaraju}a klimatizacija i koli~ina dnevne svetlosti, doprinose radnom okru`enju koje minimizuje ometanje i zamor. Pa`nja se tako|e mora obratiti lokalnim zdravstvenim i bezbednosnim zahtevima.
Laboratorijska oprema
Laboratorijska oprema koja se koristi treba da bude adekvatna za laboratorijski rad i jednostavna za ~i{}enje i dezinfekciju; Kriti~na oprema, uklju~uju}i inkubatore i opremu za ~uvanje zamrznutih embriona, treba da bude pod odgovaraju}im alarmima i nadgledana; Sve embriolo{ke laboratorije mora da imaju automatski pomo}ni generator za napajanje u slu~aju nestanka elektri~ne energije; Preporu~uje se minimalno dva inkubatora. Cilindri sa gasom treba da budu
Bezbednost u laboratoriji
Nacrt laboratorije
Embriolo{ka laboratorija bi trebalo da ima odgovaraju}i prostor radi odr`avanje dobre laboratorijske prakse i to:
361
sme{teni napolju ili u zasebnoj prostoriji sa automatskim pomo}nim sistemom; Inkubatore treba redovno ~istiti i sterilizovati. Tankovi sa azotom mora da se ~iste bar jednom godi{nje.
Infektivni agensi
Sve tehnologije asistirane reprodukcije uklju~uju rukovanje biolo{kim materijalom i predstavljaju potencijalnu opasnost od preno{enja bolesti na osoblje. Izvori infekcije u ovom sistemu su jedinjenja i folikularna te~nost. Svaka jedinica treba da utvrdi procedure i pravila za bezbednost osoblja uzimaju}i u obzir propise. Prema tome: Preporu~uje se vakcinacija osoblja protiv hepatitisa B, ili ostalih virusnih bolesti; Pregled pacijenata i donora gameta na HIV - human immunodeficiency virus, hepatitis B/C i ostale prenosive bolesti pre tretmana ili krioprezervacije gameta. Iako je prijem pacijenata u tretman IVF - in vitro fertilisation regulisan od strane lekara, laboratorijsko osoblje mora da bude informisano o rizicima rukovanja potencijalno inficiranim biolo{kim materijalom. Slede}e preporuke treba razmotriti: Ako je jedan ili ako su oba partnera HIV - human immunodeficiency virus pozitivni, IVF - in vitro fertilisation i transfer embriona ne treba poku{avati, osim, ako eti~ki komitet da dozvolu. Za seronegativnu `enu se preporu~uje donorska sperma ukoliko je njen partner seropozitivan po{to virus HIV -1 - human immunodeficiency virus mo`e biti prisutan u citoplazmi sprematozoida. Prema tome, postoji mogu}nost da virus u|e u oocit tokom oplodnje bilo konvencionalnom IVF - in vitro fertilisation ili intracitoplazmati~nom injekcijom sperme;
Ako je mu{ki partner inficiran virusom hepatitisa B, seronegativna `ena mora biti vakcinisana pre IVF - in vitro fertilisation. Ako je `ena inficirana virusom hepatitisa B, IVF - in vitro fertilisation je izvodljiva, ali par mora biti upozoren o neophodnosti specifi~ne vakcinacije bebe na ro|enju. Nedavno je predlo`eno da upotreba ICSI - intra citoplasmatic sperm injection kod pacijenata koji su pozitivni na hepatitis B mo`e pove}ati rizik uno{enja virusa u oocit, zbog prijanjanja virusa uz membranu spermatozoida; Ako je jedan partner inficiran virusom hepatitisa C, IVF - in vitro fertilisation se mo`e obaviti nakon konsultovanja; U slu~aju seropozitivnosti na sifilis, mora biti obavljen odgovaraju}i tretman pre primene IVF - in vitro fertilisation.
Za{titne mere
Svrha za{titnih mera je osiguravanje asepti~kih uslova za gamete i embrione. Procedure su sledece: Upotreba laboratorijske ode}e; Upotreba netoksi~nih rukavica i maski; Upotreba za{tite za o~i i lice prilikom rukovanja kriogenskim materijalima; Upotreba radnih stolova sa vertikalnim laminarnim protokom; Upotreba mehani~kih pipeta; Upotreba fume-hood u slu~aju fiksativa; Dezinfekcija i sterilizacija potencijalno inficirane opreme; Upotreba materijala za jednokratnu upotrebu. Nakon upotrebe mora odmah da bude odba~en u odgovaraju}e kontejnere za otpad. Potencijalno infektivni materijali se moraju ukloniti na na~in koji }e za{tititi laboratorijske radnike, sanitarno i osoblje koje radi na odr`avanju, od izlaganja infektivnim materijalima tokom njihovog rada; Iglama i ostalim o{trim predmetima
362
treba rukovati uz ekstremnu pa`nju i odbaciti u specijalne kontejnere. Ukoliko je mogu}e, iz laboratorije treba ukloniti sve staklene predmete. U suprotnom, Pasterove pipete i polomljene staklene predmete treba odbaciti u specijalne kontejnere. Unakrsna kontaminacija infektivnim materijalom sa jednog pacijenta na drugog jo{ uvek mo`e da se desi tokom procedure krioprezervacije kada se pajete sa spermom ili embrionima pune spermom ili embrionima, zape~a}uju i prebacuju u te~ni azot bez spoljne dezinfekcije. Materijal koji je deponovan u rezervoarima za krioprezervaciju mora biti ~uvan na na~in koji izbegava kontakt faze te~nog azota sa biolo{kim supstancama. Sigurnosne pajete su zami{ljene da ispune ovaj zahtev. Uzorak za koji se zna da je kontaminiran treba da bude ~uvan u takvim visoko bezbednim pajetama.
minantima. Prostorije pod pritiskom koje koriste HEPA - high efficiency particulate air filtraciju su napravljene u brojnim IVF in vitro fertilisation laboratorijama sa standardima koji se primenjuju za farmaceutske ~iste sobe. Me|utim, HEPA - high efficiency particulate air filtracija ne mo`e efikasno da zadr`i gasne organske i neorganske molekule male molekularne te`ine. ^etiri naj~e{}a vazdu{na zaga|iva~a su: 1. U urbanim i gustim prigradskim podru~jima isparljiva organska jedinjenja koja stvara industrija, raznolike procedure ~i{}enja, isparenja iz izduvnih cevi vozila i sistema za grejanje. Instrumenti kao {to su mikroskopi, televizijski monitori ili name{taj, kao rezultat proizvodnje, tako|e mogu stvarati isparljiva organska jedinjenja. 2. Mali neorganski molekuli kao {to su N2O, SO2, CO. 3. Supstance dobijene od gra|evinskih materijala, npr. aldehidi iz podnih lepkova, substituisani benzeni, fenol i n-dekan oslobo|en iz vinilnih podnih plo~ica. Otkriveno je da su podni lepkovi naro~ito agresivni. Sve`e ofarbane povr{ine ~esto predstavljaju opasnost, po{to veliki broj farbi sadr`i supstance koje su veoma toksi~ne u IVF - in vitro fertilisation laboratoriji. 4. Ostala zaga|iva~ka jedinjenja su pesticidi i aerosoli koji sadr`e butan ili izobutan kao podlogu. Te~nosti kao {to su podni voskovi sadr`e te{ke metale koji imaju drasti~an uticaj na implantacioni potencijal embriona. Koen je sproveo detaljnu studiju hemijske kontaminacije vazduha u svim podru~jima njegove IVF - in vitro fertilisation laboratorije koja je otkrila dinami~ke interaktivne procese izme|u sistema koji rade sa vazduhom, prostora, alata, materijala za
363
jednokratnu upotrebu i ostalih predmeta. Prona|eni su anestetski gasovi, rashladne te~nosti, agensi za ~i{}enje, ugljovodonici i aromati~na jedinjenja, a neki su se akumulirali, naro~ito u inkubatorima. Koen nagove{tava da mo`da postoji interakcija izme|u ~vrstih faza rastvorljivih u vodi i rastvorljivih u lipidima, kao {to su one u inkubatorima. Dok se neki kontaminanti mogu apsorbovati u medijumima kulture, ovo se mo`e neutralisati obezbe|ivanjem ve}eg odvoda kao {to je ovla`iva~ u inkubatoru. Mineralno ulje mo`e delovati kao odvod za ostale komponente. Nefiltriran spoljni vazduh mo`e biti ~istiji od laboratorijskog vazduha filtriranog pomo}u HEPA - high efficiency particulate air, zbog akumulacije isparljivih organskih jedinjenja dobijenih iz susednih prostorija, ili specifi~nih laboratorijskih proizvoda. Proizvo|a~i kompresovanog vazduha i inkubatora nemaju obzira prema specifi~nim potrebama in vitro oplodnje za ~istim vazduhom. Standardi za zalihe kompresovanog vazduha su zasnovani na kriterijumima koji nisu dizajnirani za uzgajane i neza{ti}ene }elije. Testiranje novog inkubatora je otkrilo koncentracije isparljivih organskih jedinjenja koje su 100 puta ve}e od onih koje su dobijene iz testiranja kori{}enih inkubatora istog proizvo|a~a. Dozvoljavanje emisije gasova iz novih laboratorijskih proizvoda je od presudne va`nosti. U svetlu ~injenice da se ~ini nemogu}im spre~iti zaga|enje laboratorije iz okru`enja pomo}u trenutnih tehnologija obrade vazduha, primarna pa`nja treba da se usmeri prema osmi{ljavanju prostora za laboratoriju i susednih podru~ja. Da bi prevazi{li ovaj problem potencijalnih opasnosti u ambijentalnom prostoru, posebno su razvijene jedinice aktivne filtracije sa filterima sa aktivnim ugljenikom i oksidacionim
materijalom za IVF - in vitro fertilisation laboratorije. One se mogu postaviti unutar inkubatora, ili u samom laboratorijskom prostoru.
Inkubatori
Uspe{no su kori{}ena dva tipa gasne faze: 5% CO2 u vazduhu i me{avina tri gasa, i to, 5% CO2, 5% O2 i 90% N2. Atmosfera sa 5% CO2 je potrebna za odr`avanje odgovaraju}e pH vrednosti u bikarbonatnim sistemima medijuma kulture da bi
364
fiziolo{ka pH vrednost bila ispod 7.5. Ova ravnote`a zavisi od sastava kori{}enih medijuma i na nju uti~u temperatura i atmosferski pritisak. Neki uslovi zahtevaju 6% CO2 u vazduhu da bi se odr`avala odgovaraju}a pH vrednost. Pa`ljivo kalibrisani i precizno kontrolisani CO2 inkubatori su od kriti~nog zna~aja za uspe{nu in vitro oplodnju. Izbor izme|u humidifikovanog i nehumidifikovanog inkubatora zavisi od tipa kori{}enog tkivnog sistema kulture. Dok je vla`nost potrebna za standardnu ~etvorodelnu otvorenu kulturu, upotreba uravnote`ene humidifikovane dopune mineralnih ulja dozvoljava upotrebu inkubatora bez vlage. Suvi inkubatori sa sobom nose manji rizik od gljivi~ne kontaminacije i lak{i su za ~i{}enje. Inkubator se mora redovno nadgledati, a o~itavanja sa displeja proveravati i kalibrisati prema nezavisnim bele{kama temperature. pH vrednosti treba da se nadgledaju sondama koje su postavljene u standardni test sistem kulture. Unutra{nje zidove i vrata treba jednom nedeljno prati sterilnom vodom i preporu~uje se godi{nja inspekcija i generalno servisiranje od strane dobavlja~a. Ponovljeno otvaranje i zatvaranje inkubatora uti~e na stabilnost okru`enja kulture tkiva. Upotreba malog stonog mini inkubatora tokom prikupljanja oocita i manipulacije poma`e u minimizaciji ometanja skladi{nog inkubatora. Savremeni mini inkubatori za IVF - in vitro fertilisation kulturu su predstavljeni nedavno i projektovani su da prevazi|u probleme postojanosti i stabilnosti pH vrednosti i temperature koji se susre}u kod tradicionalnih sistema sa velikim inkubatorima.
Kvalitet vode
Pouzdan izvor ultra~iste vode je kriti~an faktor u laboratoriji, naro~ito ako se medi-
jumi pripremaju na licu mesta. Vajmer je obavio potpunu analizu ne~isto}a koje se mogu na}i u vodi. Voda kao univerzalni rastvara~ pru`a medijum za ve}inu biolo{kih i hemijskih reakcija i podlo`nija je kontaminaciji od bilo kog drugog rastvara~a. Povr{inska i podzemna voda je kontaminirana {irokim opsegom supstanci, uklju~uju}i |ubriva, pesticide, herbicide, deterd`ente, industrijske otpadne vode i otpadne rastvara~e uz sezonska kolebanja temperature i padavina koja uti~u na nivoe kontaminacije. Postoje ~etiri kategorije kontaminanata: neorganski, rastvorene katjonske i anjonske vrste, organski, ~esti~ni i mikroorganizmi kao {to su bakterije, alge, bu| i gljivice. Hlor, hloramini, polijonski supstrati, ozon i fluor se mogu dodati vodi tokom procesa tretmana i moraju se ukloniti iz vode radi pripremanja medijuma kulture }elija. U pro~i{}avanju vode je od presudne va`nosti analiza izvora dolazne vode zbog utvr|ivanja potrebnih koraka filtracije, a protokoli za obradu vode treba da budu prilago|eni regionalnim zahtevima. Sistemi obrade vode uklju~uju ~esti~nu filtraciju, filtraciju aktivnim ugljenikom, inverznu osmozu i elektro-dejonizaciju. Ultraljubi~asti oksidacioni sistem nakon koga sledi Milli-Q PF Plus pro~i{}avanje pre finalne filtracije kroz filter od 0.22 m za uklanjanje bilo kakvih ~estica i spre~avanje reverzne bakterijske kontaminacije iz okru`enja. Osoblje IVF - in vitro fertilisation laboratorije treba da bude upoznato sa varijacijama njihovog izvora vode kao i sa sposobnostima njihovog sistema za pro~i{}avanje vode i treba da razvije protokole za postojano osiguravanje visokokvalitetnih zaliha ultra~iste vode. Vajmer je preporu~io slede}i raspored za odr`avanje vode za sistem koji je koristio
365
gametima ili embrionima, svaku pipetu treba pregledati i isprati sterilnim medijumom da bi se osiguralo da je ~ista i da na njoj nema ostataka.
Zalihe
Osnovni spisak zaliha je opisan na kraju ovog poglavlja; ta~no potrebna kombinacija }e zavisiti od sistema kulture i kori{}enih tehnika manipulacije. Zalihe za jednokratnu upotrebu se koriste kad god je to mogu}e i mora se garantovati stepen netoksi~nosti kulture, naro~ito posuda kulture, igala, sistema za prikupljanje i katetera za aspiraciju oocita i transfer embriona. Visokokvalitetne staklene pipete za jednokratnu upotrebu su potrebne za manipulisanje gametima i embrionima; one moraju biti potopljene i isprane sterilnom vodom i sterilisane suvom toplotom pre upotrebe. Prilikom pripreme za rukovanje
Pipete
1. Nove pipete preko no}i potopiti u ~istu Analar ili Milli-Q vodu proveravaju}i da su potpuno pokrivene;
366
2. Ocediti pipete i isprati ~istom vodom; 3. Ponovo ocediti i osu{iti pri temperaturi od 100C u trajanju od 1-2 ~asa; 4. Postaviti ih u ~ist kanister sa vrhovima napred i sterilisati suvom toplotom u trajanju od 3 ~asa pri temperaturi od 180C. 5. Nakon hla|enja, zapisati datum i koristiti u roku od jednog meseca od sterilizacije.
Predmeti za vi{ekratnu upotrebu, rukovanje sa rukavicama bez praha non-powered ispranim u pro~i{}enoj vodi
1. Potopiti u destilovanu vodu koja sadr`i 3-5% 7 X; 2. Male predmete staviti u ultrazvu~nu kadu za ~i{}enje u trajanju od 5-10 minuta; 3. Osam puta isprati destilovanom vodom pa zatim dva puta u Analar ili MilliQ vodi; 4. Osu{iti, zape~atiti u aluminijumsku foliju, ili dvostruko upakovati u autoklavne vre}e; 5. Sterilizovati u autoklavu ili suvom toplotom na temperaturi od 180C u trajanju od tri ~asa; 6. Zabele`iti datum sterilizacije i odlo`iti na ~istom mestu na kome nema pra{ine.
velikog napretka proizvodnje medijuma. Kontrola kvaliteta je veoma va`na u pripremi medijuma, uklju~uju}i i izvor svih sastojaka, naro~ito vode, koji moraju da budu bez endotoksina, sa niskim sadr`ajem jona i garantovano bez organskih molekula i mikroorganizama. Svaka serija pripremljenih medijuma kulture se mora proveriti na osmolarnost 285 2 mOsm /kg i pH vrednost 7.35-7.45 i moraju se pre upotrebe podvrgnuti procedurama kontrole kvaliteta pomo}u testa pre`ivljavanja spermatozoida ili mi{jih embriona. Medijumi kulture mogu brzo da se promene za vreme skladi{tenja, pa se posebna pa`nja mora obratiti na uslove skladi{tenja i preporu~eni datum isteka roka upotrebe koji je dao proizvo|a~. Komercijalno pripremljeni i unapred testirani visokokvalitetni medijumi kulture se danas mogu kupiti od velikog broja snabdeva~a iz celog sveta, pa priprema medijuma za rutinsku upotrebu u laboratoriji nije neophodna, jer ova ve`ba mo`e biti skupa kada se uzmu u obzir vreme i kontrola kvaliteta. Za sada nema ~vrstih nau~nih dokaza da je neki od ovih medijuma superiorniji u odnosu na druge u rutinskoj IVF - in vitro fertilisation, pa izbor treba da zavisi od okolnosti kao {to su kontrola kvaliteta i primenjene procedure testiranja tokom proizvodnje, cena i, naro~ito, garantovana efikasnost dostave u pogledu roka trajanja. Nakon isporuke se medijum mo`e podeliti na jednake male zapremine tako da se svaka mo`e koristiti za pripremu i kultivaciju gameta jednog pacijenta, uklju~uju}i i pripremu spermatozoida. Medijumi koji sadr`e HEPES - (4-(2hydroxyethyl)-piperazineethanesulfonic acid), koji odr`ava stabilnu pH vrednost u bikarbonatnom sistemu, se mogu koristiti
367
za pripremu spermatozoida i prikupljanje i pranje oocita. Me|utim, poznato je da HEPES - (4-(2-hydroxyethyl)-piperazineethanesulfonic acid) menja aktivnost jonskog kanala u plazma membrani pa mo`e biti embriotoksi~an. Zbog toga se gameti kasnije moraju isprati u medijumu kulture, koji ne sadr`i HEPES - (4-(2hydroxyethyl)-piperazineethanesulfonic acid), pre inseminacije. Medijumi koji su posebno osmi{ljeni za pranje spermatozoida su, tako|e, komercijalno dostupni. Tokom 1990-ih godina je veliki broj istra`ivanja doveo do razja{njenja metaboli~ke biohemije i molekularnih mehanizama koji u~estvuju u sazrevanju gameta, aktivaciji, oplodnji, genomskoj aktivaciji, deobi, kompakciji i formiranju blastociste. Zahtevi za hranljivim materijama razlikuju se tokom svih ovih razli~itih etapa. Neodgovaraju}i uslovi kulture izla`u embrione }elijskom stresu koji rezultuje usporenom deobom, zaustavljanjem deobe, pogor{anom proizvodnjom energije, neadekvatnom aktivacijom genoma i transkripcijom gena. Nakon formiranja blastociste sledi eksponencijalno pove}anje sinteze proteina, uz neosintezu glikoproteina, histona i novih povr{inskih antigena. Iako specifi~ne potrebe embriona tokom njihovog preimplantacionog razvoja nisu potpuno definisane, etapno-specifi~ni i hemijski definisani medijumi su dostupni za upotrebu u IVF - in vitro fertilisation sistemima. Oni imitiraju prirodnu in vivo situaciju prate}i zna~ajne promene fiziologije i metabolizma embriona koje se de{avaju tokom predimplantacionog perioda.
Serum
U po~etku se koristio filtriran maj~inski serum koji je dodavan u IVF - in vitro fertilisation medijume kulture. Maj~inski
serum se rutinski tretirao toplotom da bi se deaktivirali potencijalno {tetni sastojci, ali je ova procedura mogla da stvori embriotoksi~na jedinjenja. Albumin iz seruma je proteinski sastavni deo okru`enja embriona, on vezuje lipide i mo`e da pomogne u vezivanju i stabilizaciji faktora rasta. Va`an je u odr`avanju kvaliteta embriona i spre~avanju embriona i gameta da se zalepe za staklene ili plasti~ne povr{ine olak{avaju}i tako njihovu manipulaciju. Preparati albumina mogu biti veoma promenljivog kvaliteta i nedavna razmatranja o prenosu patogenih agenasa, kao {to su hepatitis i HIV - human immunodeficiency virusi i Krojcfeld-Jakobova bolest krvnim produktima, veoma su ote`ala pronala`enje pouzdanih izvora humanog serum albumina. Danas je ve}ina laboratorija po~ela da koristi komercijalne gotove preparate. Rekombinantna tehnologija se sada sve vi{e primenjuje na komercijalnu proizvodnju izvesnog broja fiziolo{kih proteina, a rekombinantni ljudski serum albumin mo`da }e biti dostupan u budu}nosti. Predstavljeni su medijumi bez seruma koji koriste zamene kao {to je PVA polivinil alkohol i hialuronat. Polivinilalkohol je sinteti~ki polimer i on je, iako se pokazalo da poma`e IVF - in vitro fertilisation kulturu, ne-fiziolo{ko jedinjenje, pa bilo koji dugoro~ni uticaji ili posledice mogu ostati neotkriveni du`e vreme. Hialuronat je glikosaminoglikan prona|en u povi{enim nivoima u materici u vreme implantacije i ljudski embrion ekspresuje njegov receptor tokom ~itavog predimplantacionog razvoja. Za njega se tako|e zna da formira antivirusni i antiimunogeni sloj oko embriona radi pove}anja angiogeneze i olak{avanja brze difuzije transferskog medijuma u viskozno
368
te~no okru`enje materice. Tako|e je mogu}e da je uklju~en u inicijalne faze spajanja blastociste sa endometrijumom. Hialuronat nema proteinske poddelove, pa se mo`e sintetizovati i izolovati u ~istom obliku. Preliminarna ispitivanja pokazuju da njegovo prisustvo, ne samo da zamenjuje albumin u kulturi, ve} zna~ajno pove}ava broj implantacija.
Faktori rasta
Faktori rasta igraju klju~nu ulogu u rastu i diferencijaciji od faze prelaska morule u blastocistu. Definisanje njihovih uloga i potencijala za pobolj{anje in vitro predimplantacionog razvoja je komplikovano dodatnim ~iniocima kao {to je genska ekspresija. Blastocista sisara ekspresuje ligande i receptore za nekoliko faktora rasta i veliki broj njih mo`e me|usobno da reaguje ote`avaju}i interpretiranje uticaja pojedinih faktora koji su dodati medijumu. Insulin, LIF - leukemia inhibitory factor, EGF - epidermal growth factor, TGF - transforming growth factor, TGF - transforming growth factor, PDGF - platelet derived growth factor, HB-EGF - heparin binding epidermal growth factor su prou~eni u IVF - in vitro fertilisation kulturi Uzgajanje embriona u grupama, umesto pojedina~no, pobolj{ava njihovu implantaciju. Mogu}e je da autokrini i parakrini uticaji trofi~nih faktora postoje me|u embrionima. Me|utim, prime}eni efekti kultivacije su zavisni od sastava medijuma kulture i fizi~kim uslova u toku kultivacije, naro~ito odnosa embrion/zapremina medijuma.
Ako je broj folikula mali, ili je procedura te{ka iz tehni~kih razloga, folikuli se mogu ispirati fiziolo{kim rastvorom. Balansirani rastvori soli, kao {to je Erlov rastvor EBSS - Earle's balanced salt solution, se mogu koristiti za folikularno ispiranje, uz dodavanje heparina sa koncentracijom od dve jedinice po ml. Za ispiranje se tako|e mogu koristiti i HEPES - (4-(2-hydroxyethyl)-piperazineethanesulfonic acid) medijumi. Temperatura i pH vrednost medijuma za ispiranje se moraju pa`ljivo kontrolisati, a oociti dobijeni iz medijuma za ispiranje se kasnije moraju oprati u medijumu kulture pre transfera u njihovu finalnu kulturu.
Folikularno ispiranje
Danas se ne koristi rutinski ispiranje folikula u toku punkcije.
369
zajedno sa uvo|enjem bilo kog novog metoda ili upotrebljenog materijala. Obavljen je jedan broj biolo{kih ispitivanja, radi detekcije toksi~nosti i suboptimalnih uslova kulture, kao {to je pre`ivljavanje humanih spermatozoida, linije somatskih }elija i kulture mi{jih embriona iz jedno}elijske ili dvo}elijske faze. Validnost ispitivanja mi{jih embriona je dovedena u pitanje kao pouzdano ispitivanje za ekstrapolaciju u klini~koj IVF - in vitro fertilisation. Ona pretpostavlja da su zahtevi za humane i mi{je embrione isti, a poznato je da ova pretpostavka nije ta~na. Mi{ji embrion ne mo`e da reguli{e svoju endogenu metaboli~ku rezervu pre kasne dvo}elijske etape, sto ne va`i za humane embrione. Mi{ji embrioni }e se razvijati iz dvo}elijske etape u velikom broju medijuma kulture, bez diskriminacije. Nijedan trenutno dostupan sistem ne mo`e da garantuje detekciju niskih nivoa toksi~nosti, ali mo`e pomo}i u identifikaciji specifi~nih problema. Nove serije medijuma, ulja, materijala ili zaliha kori{}enih u sistemu kulture, ako nisu ranije testirani, treba da budu testirani pre upotrebe. U rutinskoj IVF - in vitro fertilisation kulturi je o~ekivan broj oplodnje >70%, a stepen deoba >95%. Stepen deoba je va`an po{to arest u fazi dva pronukleusa ukazuje na ozbiljan problem. Minimalno 65% inseminiranih oocita treba da rezultuje embrionima u deobi drugog dana. Fizi~kohemijska ograni~enja testiranja kulture medijuma su, tako|e, veoma va`na. Osmolarnost mora da bude unutar granica 275-305 mOsm sa ukupnom varijacijom ne ve}om od 30 mOsm. Vrednost pH mora da bude unutar granica 7.2-7.5 sa maksimalnom varijacijom od 0.4 jedinice pH. Ve}e varijacije bilo kog parametra ukazuju na
lo{u tehnologiju i neadekvatnu kontrolu tokom proizvodnje {to vodi ka lo{oj reproduktibilnosti. Plasti~ne posude kulture tkiva su povremeno bile promenljivog kvaliteta, pa ispiranje posuda medijumom pre upotrebe mo`e biti korisna predostro`nost. Studije su pokazale da ulje mo`e da stupi u interakciju sa razli~itim plasti~nim posudama {to uti~e na razvoj embriona. Kvalitet plastike koja se koristi za kulturu tkiva mo`e se promeniti i takve promene u proizvodnji {priceva, filtera i posuda ponekada mogu da budu embriotoksi~ne. Ako je osmolarnost kulture niska, veli~ina embriona se pove}ava u odnosu na zapreminu citoplazme, a citoplazmi~ni blebovi se formiraju u cilju kompenzacije i dostizanja adekvatnog odnosa nukleus citoplazma za ulazak u mitozu. Embrion gubi, ne samo citoplazmu, ve} i mRNK messenger ribonucleic acid i proteine koji su neophodni za dalji razvoj.
Predlo`ena korisna rutinska procedura kontrole kvaliteta uklju~uje: Test pre`ivljavanja spermatozoida
Odabrati normalan uzorak ispranih pripremljenih spermatozoida i proceniti brojnost, pokretljivost i progresivnost. Podeliti odabrani uzorak na ~etiri jedaka dela: dodati materijal za testiranje u dva dela i istu koli~inu kontrolnog materijala koji se trenutno koristi u druga dva dela. Inkubirati jedan kontrolni i jedan probni uzorak na 37C i po jedan od svakog na sobnoj temperaturi. Proceniti svaki uzorak po brojnosti, pokretljivosti i progresivnosti nakon 24 do 48 ~asova. Probni i kontrolni uzorci treba da pokazuju jednako pre`ivljavanje. Ako postoji bilo kakva sumnja, test treba ponoviti.
370
pomo}u zagrejanih mikroskopskih etapa i grejnih blokova ili platformi. Dopuna uravnote`enog ulja kao dela tkivnog sistema kulture donosi specifi~ne prednosti: 1. Ulje se pona{a kao fizi~ka barijera i odvaja kapljice medijuma od atmosfere i vazdu{nih ~estica i patogena; 2. Ulje spre~ava isparavanje i odla`e difuziju gasa ~ime odr`ava stabilnim pH vrednost, temperaturu i osmolarnost medijuma tokom manipulisanja gametima, {tite}i embrione od zna~ajnih kolebanja njihove mikrosredine; 3. Ulje spre~ava isparavanje: ovla`eno i unapred uravnote`eno ulje dozvoljava upotrebu inkubatora bez ovla`iva~a koji su lak{i za ~i{}enje i odr`avanje. Bilo je sugestija da bi ulje moglo da pobolj{a razvoj embriona tako {to }e iz medijuma ukloniti toksine rastvorljive u lipidima. Ulje ima i neka negativna svojstva . Ono spre~ava slobodnu difuziju metaboli~kih nusprodukata kao {to je amonijak, a akumuliranje amonijaka u medijumu kulture je toksi~no po embrion. Upotreba ulja tako|e, uti~e na koncentrisanje kiseonika u medijumu uz rezultuju}e uticaje na osetljivu ravnote`u metabolizma embriona.
Priprema ulja
Mineralno, parafinsko ili silikonsko ulje treba da pri isporuci bude sterilno i da ne zahteva sterilizaciju ili filtraciju. Visoka temperatura sterilizacije mo`e da bude {tetna po samo ulje, a procedura mo`e da oslobodi potencijalne toksine iz kontejnera. Provo i Her su izvestili da izlaganje mineralnog ulja direktnoj sun~evoj svetlosti u trajanju od 4 ~asa rezultuje izuzetnom embriotoksi~no{}u, pa preporu~uju da se ulje {titi od svetlosti i tretira kao fotoreaktivno jedinjenje.
371
Grejne povr{ine za mikroskop i podru~ja za manipulaciju Grejni blok za epruvete Laminarija Sistem za krioprezervaciju Fri`ider Centrifuga Medijumi za kulturu Aspiracioni set Kateteri za transfer Potro{ni materijal za jednokratnu upotrebu
372
Prednosti Spindle ViewTM PolscopeTM Imaging systema pominjanom u poglavlju o PGD - preimplantation genetic diagnosis, su slede}e: - visok kontrast slike, - direktan prikaz na kompjuterskom monitoru, - digitalna obrada i pregled slika, - posedovanje step by step software. Sistem ~ini integrisani set mikroskopskih dodataka koji se sastoji od jedinstvene kristalne te~nosti polarizovane tehnologijom svetlosnog kontrasta, elektronske kontrole, polarizacionih algoritama, video
373
uglovima {aljuci sve informacije u ra~unar koji ih prera|uje u slike, upotrebom algoritama. Daljom obradom dobijaju se slike birefringentnih delova uzorka i svih polarizacionih uglova koji su proizvedeni pomeranjem informacija prikupljenih u kristalnoj te~nosti. Mnoge materije u biomedicini su providne. Pojavljuju se homogeno i bezstrukturno kada su povratno osvetljene belom svetlo{}u. Kada se smeste izme|u dva polarizatora strukture postaju vidljive. Ako je uzorak kroz koji prolazi svetlost opti~ki anizotropan on menja polo`aj polarizovane svetlosti. Opti~ka svojstva koja produkuju ovaj efekat nazvana su birefrigence. Anizotropne celularne strukture kao {to su tubulin, aktin, kolagen, miozin, su birefrigentne. Birefrigence pru`a jedinstvenu mogu}nost da se izmeri i analizira strukturni red uzorka, bez tretiranja egzogenim bojama, fluorescentnim markiranjima, bojenjem ili pribegavanja destruktivnom i skupom elektronskom mikroskopu. Birefringence se javlja kod molekularnog reda, kada prose~na molekularna orijentacija nije anizotropne }elijske stukture, ve} na odgovaraju}i na~in ure|ena. Anizotropne strukture sadr`e dve opti~ke ose sa indeksom prelamanja du` jedne ose, razli~itog od
indeksa prelamanja druge ose. Polarizovana svetlost paralelna sa jednom osom kre}e se razli~itom brzinom kroz uzorak za razliku od polarizovane svetlosti paralelne sa ortogonalnom osom. Ako su ove dve svetlosne komponente u fazi kada ulaze u uzorak one }e u uzorku iza}i iz faze. Merenje promene faze mo`e biti upotrebljeno za determinaciju birefrigence koji mo`e da se koristi za analizu i merenje molekularnog reda uzorka. Kvantitativno birefrigence prikazivanje se odnosi na merenje 2-D reda ta~aka, koji je u ovom slu~aju izvr{en pomo}u kristalne te~nosti univerzalnog kompenzatora i drugih elemenata Polscope sistema. Ova tehnika je zasnovana na merenju birefringence zaostatka koji je uzrokovan svojstvima uzorka. Zaostatak je proizvod birefrigence uzorka, koji dovodi u vezu ovaj zaostatak sa veli~inom i orjentacijom molekularnog reda. Birefrigence orjentacija se odnosi na opti~ku osu u uzorku koja ima ve}i indeks prelamanja. Ova osa je nazvana spora osa. Birefrigence orijentacija je u koleraciji sa molekularnom orijentacijom, koja tipi~no menja ta~ku po ta~ku u uzorku. Upotreba Polscope olak{ava analizu uzoraka, automatizaciju procesa merenja i obezbe|uje visoku osetljivost i visoku prostornu rezoluciju.
374
Azimut prikazuje strukturnu orijentaciju uzorka. Na donjoj slici mo`emo videti razli~ite boje primenjene u predstavljanju uzorka. Fibrili vretena su orjentisani radijalno u unutra{njem, kao i u spolja{njem sloju zone pelucide. Mo`e se videti i u vektor formatu kao azimut polo`en preko znatno uveli~ane slike dela zone pelucide.
Na slici se vidi pored tankog unutra{njeg sloja deblji radijalni i spolja{nji tangencijalni sloj.
Metafaza je okarakterisana potpuno oformljenim deobnim vretenom i linearno raspore|enim hromozomima u ekvatorijalnom delu deobnog vretena.
Zahvaljuju}i upotrebi polskopa mo`e se u in vitro uslovima klini~ki predvideti kvalitet i starost oocita. Istra`ivanja se zasnivaju na prou~avanju uspe{nosti fertilizacije oocita u zavisnosti od morfolo{kih osobina njihovog mejoti~kog vretena druge metafaze. Pregled promena u mejoti~kom vretenu je od velikog zna~aja, jer znamo da je mejoti~ko vreteno klju~no za normalni hromozomski raspored i deljenje maj~inskih hromozoma tokom mejoze. O{te}enje mejoti~kog vretena rezultuje u reorganizaciji, ili rasutosti kroz citoplazmu i dovodi do aneuploidije posle oplo|enja. Aneuploidija je uzrok abnormalne fertilizacije sa posledicama rane smrti embriona, spontanog
375
abortusa i nastajanja naslednih bolesti. Konvencionalne metode za prikazivanje mejoti~kog vretena, imunolo{ko bojenje i elektronska mikroskopija koriste fiksaciju i tako ograni~avaju prou~avanja dinamike vretena zbog destrukcije }elije. Upotreba polskopa je dovela do velikog pomaka u preimplantacionoj dijagnostici omogu}avaju}i kompletnu analizu dinami~kih }elijskih struktura u in vitro uslovima. Posmatranjem strukture vretena `ivog oocita i utvr|ivanjem rasporeda hromozoma predstavlja va`an deo preimplantacione dijagnostike koja je danas nezabiolazni deo
u programima asistirane reprodukcije. Polscop se tako|e koristi za procenu razvojne kompetentnosti ljudskih oocita kod `ena koje se pribli`avaju perimenopauzi, za izbor najboljih oocita iz kohorta oocita dobijenih od starijeg pacijenta, o ~emu je bilo govora u delu o procesu starenja i njegovom zna~aju za metode asistirane reproduktivne tehnologije. Polscope - spindle view imaging system koristimo od 2003. godine. Zbog relativno malog broja tretiranih pacijenata statisti~ka analiza rezultata je predvi|ena u narednom periodu.
376
Tipovi stem }elija Totipotentne stem }elije imaju potencijal razvi}a u }elije celog organizma, kao i sve }elije u prvih par dana brazdanja. Pluripotentne stem }elije su }elije koje mogu dati derivate sva tri klicina lista mezoderma, endoderma i ektoderma. Odgovaraju po funkciji }elijama jednog dela humane blastociste od 5 do 14 dana, }elijama ICM - inner cell mass. Teoretski, pluripotentne stem }elije mogu dati svaki }elijski tip organizma i proliferisati beskona~no. Tokom razvoja stem tehnologije definisana su tri tipa pluripotentnih stem }eliskih linija:
U narednih 20 godina usledili su poku{aji definisanja in vitro uslova za izvo|enje prve humane ES - embryonic stem }elijske linije.
377
- Embrionalne karcinoma EC - embryonic stem }elije. Izvode se iz gonadalnih tumora teratokarcinoma koji sadr`e derivate sva tri klicina lista; - Embrionalne stem ES - embryonic stem }elije. Izvode se iz blastociste preimplantacionog embriona; - Embrionalne germinativne EG }elije. Izvode se iz primordijalnih germinativnih }elija postimplantacionog embriona. Ova tri tipa }elija nisu jednaka po svojoj sposobnosti proliferacije i diferencijacije.
se diferenciraju u }elije jednog ili nekoliko }elijskih tipova. Potreba za ovim slo`enim izrazom dolazi usled sposobnosti nekih adultnih }elija da daju isklju~ivo jedan izvedeni }elijski tip, na primer spermatogonije koje daju spermatozoide, dok druge adultne stem }elije mogu dati nekoliko specijalizovanih derivata, primer hematopoeti~na stem }elija. Dodatno, istra`ivanja su pokazala plasti~nost stem }elija i sposobnost adultne stem }elije jednog tkiva da generi{e specijalizovani }elijski tip ili tipove drugog tkiva.
378
Adultne stem }elije su nespecijalizovane }elije sposobne da proizvode svoje identi~ne kopije i da se diferenciraju u specijalizovane }elijske tipove tkiva iz kojih poti~u. Nalazimo ih u ko{tanoj sr`i, krvi, kornei i retini oka, mozgu, skeletnim mi{i}ima, pulpi zuba, jetri, ko`i, pankreasu i du` gastrointestinalnog trakta. Adultne stem }elije su retke, te{ke za identifikovanje i izolaciju. Novije studije pokazuju da one imaju potencijal za produkciju {ireg raspona }elijskih tipova uz ne{to ve}u efikasnost. Tehnologija kultivacije adultnih stem }elija susre}e se sa problemom njihove umanjene proliferativne sposobnosti. ]elije gube sposobnost diferencijacije i obrnuto. Su{tinski problemi su stepen reprogramiranja jedra i odr`avanje stabilnog kariotipa. hESC - human embryonic stem cell
Nakon izolacije }elija ICM - inner cell mass iz blastociste petog dana i njihove kultivacije u posebnim uslovima, uspe{nom proliferacijom istih, mogu se dobiti }elije specifi~nih karakteristika, koje ih defini{u kao ES - embryonic stem }elije: - zadr`avaju sposobnost beskona~ne proliferacije simetri~nim deobama bez diferencijacije hESC-human embryonic stem cell, - pokazuju i odr`avaju pun diploidan i normalan komplement hromozoma, kariotip, - zadr`avaju razvojni potencijal formiranja izvedenih derivata sva tri klicina lista, - klonogene su, pojedina~na ES - embryonic stem }elija mo`e dati koloniju geneti~ki identi~nih }elija sa zadr`anim karakteristikama originalne }elije. Sve ES embryonic stem }elijske linije ne pokazuju ovu osobinu, - nemaju G1 fazu }elijskog ciklusa, ve}inu `ivota provode u S fazi sinteti{u}i
DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu, regulisane su unutra{njom signalizacijom i spoljnim faktorima, - ne pokazuju X inaktivaciju, - pokazuju ekspresiju transkripcionog faktora Oct-4 - octamer -4, klju~ni faktor za odr`avanje proliferacije i nediferenciranog stanja }elija i visok nivo alkalne fosfataze - poseduju stalnu i visoku aktivnost telomeraze, enzima koji odr`ava du`inu telomera hromozoma. Relativno duge telomere indikacija su sposobnosti za dugi niz deoba, - odlikuju ih slede}i povr{inski }elijski markeri: SSEA-1 izostaje SSEA-3 prisutan SSEA- 4 prisutan TRA-1-60 prisutan TRA-1-81 prisutan.
379
faktorima rasta u cilju dobijanja }elija odre|enog tipa, - biti ostavljene da se spontano diferenciraju unutar embrioidnih tela u cilju dobijanja ve}e koli~ine razli~itih tipova }elija u odmakloj diferencijaciji. Dodavanje nekog faktora rasta u cilju usmerene diferencijacije samo indukuje ekspresiju vi{e }elijskih markera. Rezultat nikad nije homogena }elijska populacija koja bi se sa sigurno{}u proglasila funkcionalnim }elijama `eljenog tipa i bila kao takva primenjena u isra`ivanjima ili terapiji.
Na svakih nekoliko pasa`a testira se pluripotentnost ES - embryonic stem }elija, njihova sposobnost za diferencijaciju i kariotip.
380
vitro sistem za studije sa ubacivanjem reprogramiranih gena u }elije u kojima su dati geni disfunkcionalni, kao i sistem za otkrivanje novih endogenih uzroka nepravilnog razvi}a.
bi se mogle transplantirati u tretmanu slede}ih oboljenja: Parkinsonova bolest, dijabetes mellitus, o{te}enja srca, traume ki~mene mo`dine, mi{i}ne distrofije i drugih. ES - embryonic stem }elije bi mogle biti neograni~ena zaliha za humanu transplantaciju pod uslovom da se prevazi|e problem dobijanja dovoljne koli~ine ES embryonic stem }elija za detaljnu karakterizaciju istih, testiranja pre terapije i samu transplantaciju. Realni problemi u kultivaciji ES - embryonic stem }elija s kojim se od po~etka susre}u istra`iva~i su relativno spor rast hESC - human embryonic stem cell, tendencija ka diferencijaciji i niska klonogena sposobnost. Opravdanost stava da su hESC - human embryonic stem cell i pored realnih problema u njihovoj kultivaciji, mogu}e re{enje za bezbednu transplantaciju, bazira se na osnovu dosada{njih potvr|enih otkri}a da se transferom jedra somatske }elije u enukleisanu jajnu }eliju dobijaju normalne ES embryonic stem }elije sa `eljenim genetskim materijalom, potvr|eno na ES embryonic stem }elijama mi{a, zatim da su humane ES - embryonic stem }elije vijabilne, netransformisane, sa zadr`anom sposobno{}u diferencijacije i nakon vi{e stotina pasa`a. Isto tako je dokazano da su hESC - human embryonic stem cell telomeraza - pozitivne, klonabilne i kariotipski stabilne. U okviru 150 pasa`a dovoljno je prostora za zamenu jedra, genetsko manipulisanje, klonalnu selekciju, testiranje kvaliteta i kreiranje banke }elija za naknadnu diferencijaciju, po standardizovanim procedurama. Ako na sve ovo potro{imo 80 pasa`a, u preostalih 70 pasa`a, jedna }elija da}e 10 21 }elija i sa samo 1% efikasnosti diferencijacije bi}e obezbe|ena koli~ina }elija za tretman 10 miliona pacijenata sa po 1012 }elija (1kg).
381
Preduslovi za primenu u terapijske svrhe: - nu`nost kontrolisane diferencijacije i dobijanje homogene populacije }elija, - obezbe|ivanje efikasnosti transplantiranih }elija, jer se nakon transplantacije moraju uklopiti u tkivo o{te}ene oblasti i funkcionisati dovoljno dugo odgovaraju}e diferencirane, - fizi~ka izolacija specifi~nog }elijskog tipa za transplantaciju iz sudova za kulturu u kojima je sprovo|ena njihova diferencijacija, primenom }elijskih sortera, kori{}enje selektivnih }elijskih markera za obele`avanje `eljenog ili ne`eljenog tipa }elije i specifi~ni uslovi kulture, kori{}enje promotera tipi~nih za jedan }elijski tip ili tkivo. Obezbe|ivanje biolo{ke sigurnosti za pacijenta podrazumeva nekoliko ispo{tovanih uslova: - hESC - human embryonic stem cell ne smeju biti tumor, - diferencijacija ovih }elija i nakon transplantacije mora biti odgovaraju}a, - pretpostavljeno prisustvo infektivnih agenasa u }elijama izvedenim na gove|em serumu mora se eliminisati kao faktor rizika. Za potrebe terapije izvodi}e se nove hESC - human embryonic stem }elijske linije bez animalnih elemanata u medijumu, medijum sa humanim serumom, problem transpozonskih skokova sa nehumanih feedera re{en je upotrebom humanih feeder }elija, - nu`nost histokompatibilnosti. S obzirom da je u transplantacionoj terapiji uslov da transplantat ne bude odba~en, mogu}e pristupe u re{enju ovog problema na hESC - human embryonic stem cell treba posebno naglasiti.
Imunosupresivna terapija kao klasi~an pristup u spre~avanju odbacivanja transplantata varira u ja~ini zavisno od toga koliko je stran upotrebljeni }elijski materijal. Ukoliko se oforme banke sa nekoliko osnovnih histokompatibilnih tipova hESC human embryonic stem cell koji pokrivaju celu ljudsku populaciju, imunosupresivna terapija bi bila primenjena u ne{to bla`oj formi. Mogu}nost transplantacije hESC human embryonic stem cell originalnog donora, IVF - in vitro fertilisation blastocista, histolo{ki potpuno udaljenom pacijentu se danas ne smatra realnim pristupom. hESC - human embryonic stem cell potpuno histokompatibilne recipijentu mogu se obezbediti transferom jedra somatske }elije pacijenta u enukleisanu jajnu }eliju. Iniciranjem takve jajne }elije na deobu, standardnom IVF - in vitro fertilisation kultivacijom, dobija se blastocista sa genomom gotovo identi~nim pacijentu, SCNT - somatic cell nuclear transfer blastocista. Obavezni koraci u ovom procesu su: 1) Reprogramiranje nukleusa pacijentovih adultnih }elija, 2) Nukleotransfer u jajnu }eliju i izvo|enje ES - embryonic stem }elijske linije iz rezultuju}e blastociste, 3) Transgeneza u kulturi It, 4) Ubiranje transgenih }elija koje su se diferencirale u stem }elije `eljenog tkiva, 5) Transfer }elija u pacijenta, autotransplantacija. Ako postoji i najmanja mogu}nost da se primenom hESC - human embryonic stem cell pomogne bolesnom ~oveku, svakako treba u~initi sve da stem tehnologija ne bude samo eksperimentalna praksa velikih svetskih instituta, ve} istinska klini~ka realnost.
382
Embriocid Dozvoljen je u dogovoru sa pacijentom. Selekcija pola Iz medicinskih razloga kod postojanja rizika za preno{enje naslednih bolesti. Surogat roditeljstvo Odobreno gestaciono surogat roditeljstvo, u kojem surogat majka nije i genetska majka. Tretman starijih `ena
Bez postavljanja limita godinama starosti. Jedini limit je zdravstveno stanje `ene.
383
SKRA]ENICE
ACC - aminocyclopropane 1 carboxylic acid Ach - acetylcholine ACRP 30 - adiponektin-adipocyte comple ment related protein of 30kDa ADAMTS 1 - a disintegrin and metallopro teinase with 0ska kiselina, DNA- deoxyribonucleic acid Dnmt - deoxyribonucleic acid methyltransferase EBM - evidenciono bazirana medicina EBSS - Earle's balanced salt solution ECGF - epithelial cell growth factor ECM - extra-cellular matrix EDTA - ethylenediaminetetraacetic acid EG - ethylene glycol EGF - epidermal growth factor EIM - european IVF- monitoring programme ELISA- enzyme linked immunosorbent assay EPO - eritropoetin ES - embryonic stem ES - embryonic stem eSET - elective single embryo transfer ESHRE - european society for human reproduction and embryology ET - embryo transfer EUFA - early unilateral folicular aspiration EUFA - early unilateral folicular aspiration FbM - filled by mass tehnika FCS - fetal calt serum FER - frozen embryo replacement FF - follicle fluid FF-MAS - folicular fluid meiosis activating sterol FGF - fibroblast growth factor FGFR - fibroblast growth factor receptor FI - flow index
FISH - fluorescence in situ hybridization FIZ3 - found inflammatory zone 3 FN - follicle number FNA - fine needle aspiration FOXL - forkhead transcription factore gene FRP - follicle regulatory peptide FSH - follicle stimulating hormone FSHR - follicle stimulating hormone receptor FSP - fallopian tube sperm perfusion G-CSF - granulocyte colony stimulating factor GDF - growth differentiation factor GIFT - gamete intrafallopian transfer GM-CSF - granulocyte macrophage colony stimulating factor GM-CSF - granulocyte macrophage colony stimulating factor GNAS - guanine nucleotide binding protein alpha stimulating GnRH antagonista - gonadotropin releasing hormon antagonista GnRH - gonadotropin releasing hormon GSH - glutathione GTP - guanosine triphosphate GV - germinal vesicle GVBD - germinal vesicle breakdown H - hystocompatibility gen HA - hyaluronic acid HAES - hydroxyethyl starch rastvor HAH - hemoaglutinacije test HB-EGF - heparin binding epidermal growth factor HBGF - heparin binding growth factor HBV - hepatitis B virus HCG - human chorionic gonadotropin HCMV - human cytomegalo virus
384
HCV - hepatitis C virus HDAC - histone deacetylase HEPA - high efficiency particulate air HEPES -(4 - (2-hydroxyethyl) - piperazinee thanesulfonic acid) hESC - human embryonic stem cell hESC - human embryonic stem cell HIG - hemolysis in gel test HIV - human immunodeficiency virus HLA - human leukocyte antigen HMG - human menopausal gonadotrophin HOS - hypoosmotic swelling test HOS - hypoosmotic swelling test HOX - homeobox gene HOXA10 - homeobox A10 gene HP U-FSH - high purity - urinarni folikul stimulirajuci hormon HPLC - high performance liquid chro matography HPV - human papilloma virus HSD - hydroxysteroid dehydrogenaze HSET - kinesin related protein HSP - hydrosalpinx HspA2 - heat shock 70kDa protein 2 HSV - herpes simplex virus IAP - intracisternal A particle ICI - intracervikalna inseminacija ICM - inner cell mass ICSI - intra citoplasmatic sperm injection IFI - intrafolikularna inseminacija Ig - immunoglobulin IGF - insulin like growth factor IGFB - insulin like growth factor binding IGT - impaired glucose tolerance IL - interleucin IMB - immunobead test IMC - inseminating motile count IPI - intraperitonalna inseminacija ITI - intratubarna inseminacija IUI - intra uterina insemination IUI - intrauterina inseminacija IVF - in vitro fertilisation IVI - intravaginalna inseminacija IVM - in vitro maturation KGF - keratinocyte growth factor LH - luteinizing hormone LHR - luteinizing hormone receptor
LIF - leukemia inhibitory factor LIF - leukocytes inhibitory factor LIT 1 - latroinsectotoxins LOS - large offspring syndrome LTMD - long term moderate dosis LUFS - luteinizing unruptured follicle MAD - mitotic arrest deficiency protein MAP - mitogen activated protein MAR - mixed antiglobulin reaction test MAS - meiosis activating sterol MBD - methyl cytosine guanine binding domain MDS - mijelodisplastini sindrom MeCP - methyl cytosine guanine binding protein MESA - microsurgical epididymal sperm aspiration mESC - mouse embryonic stem cell MEST - PEG - mesoderm specific transcript - paternally expressed MHC - major histocompatibility complex MISS - meiotic spindle stability protein MMP - matrix metalloproteinase MMR - measles,mumps,rubella MOS - serine /threonine protein mPBR - mitochondrial peripheral benzodi azepine receptor MPF - maturation promoting factor mRNK - messenger ribonucleic acid MTHFR - 5, 10 methylenetetrahydrofolate reductase MTOC - microtubule organizing center mucus penetration test NAD - nicotinamide adenine dinucleotide NADP - nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Ndn - nectin-encoding NGF - nerve growth factor NK - natural killer NPY - neuropeptida Y NRY - non recombining segment Y chromo some gene NT3 - neurotrofin OA - ovarian area OAT - oligo-astheno-teratozoo-spermia OCP - oral contraceptive pill Oct-4 - octamer -4 OD - ovum donation OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome
385
OV - ovarijalni volumen PAF - platelet activating factor PB1 - polar body PBR - polar body removal PCO - polycystic ovarian PCOS - polycystic ovarian syndrome PCR - polymerase chain reaction PCT - postkoitalni test PCT - postkoitalni test PDGF - platelet derived growth factor PDT - population doubling time Peg - paternally expressed PEG - polyethylene glycol PEPCK - phosphenolpyruvate carboxykinase PESA - percutaneous sperm aspiration PETG - polyethylene terephtalate glycol PG - prostaglandins PGC - primordial germ cells PGD - preimplantation genetic diagnosis PGD-AS-preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening PGS - preimplantation genetic screening PGWB - psychological general Well-Being index PI - pulsatility index POF - premature ovarian failure POMC - pro opiomelanokortin PPAR - peroksizom proliferatorno aktivi rani receptor PR - progesteronski receptor PSA - prostate cancer screening PT - prothrombin time PTX3 - pentraxin related gene PVA - polyvinyl alcohol PVC - polyvinyl chloride PVP - polyvinyl pyrrolidone PVP - polyvinylpyrolidone PWS - Prader-Willi syndrome PZD - partial zona dissectio RBB - retinoblastoma binding gene RBMX - RNK binding motif X chromo some gene RCT - randomized controlled trial r-FSH - rekombinantni folikul stimulirajuci hormon RI - resistence index RIA - radioimmunoassay r-LH - rekombinantni luteinizirajuci hormon
RNK - ribonukleinska kiselina ili RNA ribonucleic acid ROC - reciever operator characteristic ROS - reactive oxygen species RPS4X - ribosomal protein S4 X chromo some gene RSK - ribosomal S6 kinase SCMPT - standardized determinations of the sperm-cervical SCNT - somatic cell nuclear transfer blastocista SCSA - sperm chromatin structural assay SHBG - sex hormone binding globulin SIFI - sperm intrafallopian insemination SN - surrounded nucleolus SNP - single nucleotide polymorphism SNP - sodium nitroprusside Snrpn - small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N SOX3 - sulfur oxidation gene SPA - sperm penetration assay SRY - sex determining region (gen) ST - syncytiotrophoblast STAT - signal transducers and activator of transcription STS - sequenced tagged sites SUZI - subzonska inseminacija TALP- termination analysis of loqic programs TAT - tray agglutination test TCM - traditional chinese medicine TDF - testis determining factor TEFNA - testicular fine needle aspiration TEM - transmission electron micrograph TESE - testicular sperm extraction TGF - transforming growth factor T-MAS - testis meiosis activating steroid TNF - tumor necrosis factor TP - thymidine phosphorylase TPO Abs - thyroid peroxidase antibodies TSH - thyroid stimulating hormone TZP - transzonal projections UCP2 - uncoupling protein UFE - uterusna fibroidna embolizacija U-FSH - urinarni folikul stimulirajuci hormon USP9 Y - ubiquitin specific protease 9 Y chromosome gene VEGF - vascular endothelial growth factor VFI - vascularisation flow index
386
VI - vascularisation index VIN - vulvarna intraepitelna neoplazija VIP - vasoactive intestinal polypeptide VOCAL - virtual organ computer-aided analysis Wnt-4 - wingless-int WT - Wilms tumors
YAC - yeast artifitial chromosome YAG - neodymium doped yttrium alumini um garnet YCS - yeast artificial chromosome ZFX - zink finger X chromosome gene Znf - zink finger gene
387
LITERATURA
Abdul-Jalil, A., Child, T., Phillips, S., et al., (2001). Ongoing twin pregnancy after ICSI of PESA-retrieved spermatozoa into in-vitro matured oocytes: Case report. Hum. Reprod. 16: 1424-1426. Aboulghar, M., Mansour, R. Serour, G. et al. (1999). Elevated levels of interleukin-2, soluble interleukin-2 receptor alpha, interleukin-6, soluble interleukin-6 receptor and vascular endothelial growth factor in serum and ascitic fluid of patients with severe ovarian hyperstimulation syndrome. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 87: 81-85 Abraham IM, Han SK, Todman MG, Korach KS, Herbison AE, Estrogen receptor beta mediates rapid estrogen actions on gonadotropin-releasing hormone neurons in vivo, J Neurosci 23:5771, 2003. Acker, T., Beck, H. and Plate, K. (2001). Cell type specific expression of vascular endothelial growth factor and angiopoietin-1 and -2 suggests an important role of astrocytes in cerebral vascularization. Mech. Dev. 108: 45-57. Ackert CL, Gittens JE, O'Brien MJ, Eppig JJ, Kidder GM, Intercellular communication via connexin43 gap junctions is required for ovarian folliculogenesis in the mouse, Dev Biol 233:258, 2001. Acosta, A., Elberger, L., Borghi, M., Calamera, J. et. al. (2000). Endometrial dating and determination of the window of implantation in healthy fertile women. Fertil. Steril. 73: 788-798. Adams, R., Wilkinson, G., Weiss, C. et al., (1999). Roles of ephrinB ligands and EphB receptors in cardiovascular development: demarcation of arterial/venous domains, vascular morphogenesis, and sprouting angiogenesis. Genes and Develop.. 13: 295-306. AgcaY. and Crister J. (2002). Cryopreservation of spermatozoa in assisted reproduction. Semin. Repro. Med. 20: 15-24. Aihua, L., Dubey, S., Varney, M. and Singh, R. (2002). Interleukin-8- induced proliferation, survival and MMP production in CXCR1 and CXCR2 expressing human umbilical vein endothelial cells. Microvas. Res. 64: 476-481. Aihua, L., Dubey, S., Varney, M. and Singh, R. (2002). Interleukin-8- induced proliferation, survival and MMP production in CXCR1 and CXCR2 expressing human umbilical vein endothelial cells. Microvas. Res. 64: 476-481. Akande, V., Fleming, C.F., Hunt, L.. et al. (2002). Biological versus chronological ageing of oocytes, distinguishable by raised FSH levels in relation to the success of IVF treatment. Hum. Reprod. 17: 2003-2008. Akiyama, H., Saito, M., Qiu, G. et al. (1994). Analytical studies on hyaluronic acid synthesis by normal human epidermal keratinocytes cultured in serum-free medium. Biol. Pharm.Bull. 17: 361-364. Ali, J., Shahata, M.., Al-Natsha, S. (2000) Formulation of a protein-free medium for human assisted reproduction. Hum. Reprod, 15: 145-156. Alikani, M, Cohen J., Tomkin G. et. al., (1999). Human embryo fragmentation in vitro and its implications for pregnancy and implantation. Fertil. Steril. 71: 836-842. Alikani, M., Calderon, G. Tomkin, G. (2000). Cleavage anomalies in early human embryos and survival after prolonged culture in-vitro. Hum. Reprod. 15: 2635- 2643. Alon, R. and Feigelson, S. (2002). From rolling to arrest on blood vessels: leukocyte tap dancing on endothelial integrin ligands and chemokines at sub-second contacts. Semin. Immunol. 14:93-104. an indispensable subunit of the IL-21 receptor complex. J. Immunol. 167: 1-5. Andersen, C, Morineau, G., Fukuda, M., et al. (1999). Assessment of the follicular cortisol cortisone ratio. Hum. Reprod. 14: 1563-1568.
388
Antczak, M., (2001). Possible ramifications of the identification of ovarian follicular granulosa cells as specialized endothelial-like cells: a speculative treatise. RMB Online 2: 188-197. Antczak. M., and Van Blerkom, J. (2000). The vascular character of ovarian follicular granulosa cells: phenotypic and functional evidence for an endothelial-like cell population. Human Reprod. 15: 2306-2318. Apparao, K. Lovely, L. Gui, Y. et. al. (2002). Elevated endometrial androgen receptor expression in vomen with polycystic ovarian syndrome. Biol. Reprod. 66: 297-304. Artini, P. Monti, M., Fasciani, A. et al., (2002). Vascular endothelial cell growth factor, interleukin-6 and interleukin-2 in serum and follicular fluid of patients with ovarian hyperstimulation syndrome. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 101: 169-174. Asao, H., Okuyama, C, Kumaki, S. et al., (2001). Cutting edge: the common gamma-chain is Azghani, A., Baker, J. W., Shetty, S. et al. (2002). Pseudomonas aeruginosa elastase stimulates ERK signaling pathway and enhances IL-8 production in alveolar epithelial cells in culture. Inflamm. Res. 51: 506-510. Baggiolini, M., Balaban,B., Urman.B-, Alatas,C, et ai., (2001c). Blastocyst-stage transfer of poor-qua cleavage stage embryos results in higher implantation rates. Fertil. Steril. 75: 514-518. Baltz, J. (2001). Osmoregulation and cell volume regulation in the preimplantation embryo.Curr. Top. Dev. Biol. 52: 55-106. Barak, V., Mordel, N., Zajicek, G., et al. (1992). The correlation between interleukin 2 and soluble interleukin 2 receptors to oestradiol, progesterone, and testosterone levels in periovulatory follicles of in-vitro Fertilization. Hum. Reprod. 7: 926-929. Baranao, R., Dain, L., Palak de Fried, E. and Rumi, L. (1995). Human granulosa cells are express HLA-DR antigen and are capable of synthesizing interleukin-1. Horm. Metab. Res.27: 495-498. Barnes RB, Namnoum AB, Rosenfield RL, Layman LC, The role of LH ird FSH in ovarian androgen secretion and ovarian foilicular development: . linical studies in a patient with isolated FSH deficiency and multicystic -. aries, Hum Reprod 17:88, 2002. Barrit, J. Brenner, C, Willadsen, S. and Cohen, J. (2000). Spontaneous and artificial changes in human ooplasmic mitochondria. Hum. Reprod. 15 (Suppl. 2): 207-217. Barritt J., Brenner, C, Maker, H. and Cohen, J. (2001b) Mitochondria in human offspring derived from ooplasmic transplantation. Hum. Reprod. 16: 513-516. Barritt, J, Tomkin, G., Cohen, J. and Brenner, C. (2001a). Age-related quantification of mitochondrial DNA in human oocytes. In: Barlow DH, editor. 17th Annual Meeting the European Society of Human Reproduction and Embryology; Lausanne: Oxford University Press, p. 68, abstract 0-165. Barritt, J., Willadsen, S., Brenner, C. et al. (2001). Cytoplasmic transfer in assisted reproduction. Hum. Reprod. Update 7: 428-435. Beagley, K and Timms, P. (2000) Chlamydia trachomatis infection : Incidence, health costs and prospects for vaccine development. Journal of Reproductive Immunology 48 : 47-68. Bean, C, Hassold, T., Judis, L. et al. (2002). Fertilization in vitro increases nondisjunction during early cleavage divisions in a mouse model system. Hum. Reprod. 17: 2362-2367. Beebe, D., Wheeler, M., Zeringue, H. et. al. (2002). Microfluidic technology for assisted reproduction. Theriogenology 57: 1 Special Issue SI) 125-135. Bielanska,M.,Tan,S. and Ao,A. (2000). Significance of mosaicism in the huma-preimplantation embryo. Abstracts of the 16th Meeting of ESHRE, Bologna, June 2000-Hum Reprod 15 (Abstract Book 1): O-030. Biggers, J. and Raeowsky, C. (2002). The development of fertilized human ova to the blastocyst stage in medium KSOMAA: Is a two-step protocol necessary? Reprod. BioMed Online. 5: 133-140. Biggers, J. McGinnis, L. and Raffin, M. (2000). Amino acids and preimplantation developmc of the mouse in protein-free potassium simplex optimized medium. Biol. Reprod. 63: 281- 293. Bjarnason K, Cerin A, Lindgren R, Weber T, the Scandinavian Long Cycle Study Group, Adverse endometrial effects during long cycle hormone replacement therapy, Maturitas 32:151, 1999.
Literatura
389
Blumenfeld Z, Response of human fetal pituitary cells to activin, inhibin, hypophysiotropic and neuroregulatory factors in vitro, Early Pregnancy 5:41, 2001. Bodetti, T., Jacobson, E., Wan, C., Pospischil, A., Hafner, L., Rose, K. and Timms, P. (2003) Host range of the human pathogen Chlamydia pneumoniae expanded to include reptiles and amphibians. Veterinary Microbiology (in press) Boiso, I. (2002). Fundamentals of human embryonic growth in vitro and the selection of high quality embryos for transfer. Reprod. Bio.Med. Online 5: 328- 350. Boiso, I., Marti, M., Santalo, J. et al. (2002). A confocal microscopy analysis of the spindle and chromosome configurations of human oocytes cryopreserved at the germinal vesicle and metaphase II stage. Hum. Reprod. 17, 1885-1891. Bravo, J. and Heath, J. (2000). Receptor recognition by gpl30 cytokines. EMBO J. T9: 2399-2411. Brockhurst, V and Timms, P (2002) Application of the ligase-assisted spacer addition (LASA) method for human genotyping using polymorphisms at the dinucleotide locus, D1S191. Biotechniques (submitted) Bruckner, K., Pasquale, E. and Klein, R. (1997). Tyrosine phosphorylation of transmembrane ligands for Eph receptors. Science 275: 1640-1643. Brunet, S. and Vernos, I. (2001). Chromosome motors on the move. From motion to spindle checkpoint activity. EMBO Rep. 2: 669-673. Buonomo, S., Clyne, R., Fuchs, J. et al. (2000). Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell 103: 387-398. Burger HG, Dudley E, Manners P, Groome N, Robertson DM, Early follicular phase serum FSH as a function of age: the roles of inhibin B, inhibinAand estradiol, Climacteric 3:17, 2000. Byskov AG, Andersen CY, Leonardsen L, Role of meiosis activating sterols, MAS, in induced oocyte maturation, Molec Cellular Endocrino 187:189,2002. Calogero, A., Burrello, N. and Ossino, A. (1998) Endothelin (ET)-l and ET-3 inhibit estrogen and cAMP production in rat granulosa cells in vitro. J. Endocrinol. 157: 209- 215. Calogero, A., Nicoletti, F., Palumbo, M. et al. (1998). Macrophage-derived cytokines in the follicular fluids of women with infertility due to immunological causes. Elevated levels of interleukin 6 and low levels of granulocyte-macrophage colongy stimulating factor. Cytokine 10: 814-818. Camenisch, T., Spicer, A. P., Brehm-Gibson, T. et al. (2000). Disruption of hyaluronan synthase2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. J. Clin. Invest. 106: 349-360. Cavilla, J., Kennedy, C, Baltsen, M, et al. (2001). The effects of meiosis activating sterol on in vitro maturation and fertilization of human oocytes from stimulated and unstimulated ovaries. Hum. Reprod. 16: 547-555. Cha, K., Han, S., Chung, H., et al. (2000). Pregnancies and deliveries after in vitro maturation culture followed by in vitro fertilization and embryo transfer without stimulation in women with polycystic ovary syndrome. Fertil. Steril. 73: 978-983 Chang, C, Wang, T., Horng, S. et al. (2002). The concentration of inhibin B in follicular fluid: relation to oocyte maturation and embryo development. Hum. Reprod. 17: 1724-1728. Chang, R., Gougeon, A. and Erickson, G. (1998). Evidence for a neutrophil-interleukin-8 system in human folliculogenesis. Am. J. Obstet. Gynecol. 178: 650-657. Child T, Abdul-Jalil A, Gulekli B. and Tan S-L. (2001) In vitro maturation and fertilization of oocytes from unstimulated normal ovaries, polycystic ovaries and women with polycystic ovary syndrome. Fertil Steril 76: 936-942. Chou C-S, Tai C-J, MacCalman CD, Leung PCK, Dose-dependent effects of gonadotropin releasing hormone on matrix metalloproteinase (MMP)-2, and MMP-9 and tissue specific inhibitor of metalloproteinases-1 messenger ribonucleic acid levels in human decidual stromal cells in vitro, J Clin Endocrinol Metab 88:680, 2003.
390
Chow, D.. Ho, J., Pharn. T. et al. (2001). In vitro reconstruction of recognition and activation complexes between interleukin-6 and gpl30. Biochemistry 40: 7593-7603. Christensen JH, Siggaard C, Corydon TJ, deSanctis L, Kovacs L, Robertson GL, Gregersen N, Rittig S, Six novel mutations in the arginine vasopressin gene in 15 kindreds with autosomal dominant familial neurohy-pophyseal diabetes insipidus give further insight into the pathogenesis, Eur J Hum Genet 12:44, 2004. Chung, J., Park, Y., Paek. S. et al. (1999). Effect of Na-hyaluronan on stromal and endothelial healing in experimental corneal alkali wounds. Ophthalmic Res. 31: 432- 439. Cioffi, J., Van Blerkom, J., Antczak, M. et al., (1997). The expression of leptin and its receptors in pre-ovulatory human follicles. Mol. Hum. Reprod. 3: 467-472. Clyde, J., Gosden, R., Rutherford, A. et al. (2001). Demonstration of a mechanism of aneuploidy in human oocytes using Multifluor fluorescence in situ hybridization. Fertil. Steril. 76: 837-840. Cohen, T., Gluzman-Poltorak, Z., Brodzky, A. et al. (2001). Neurocndocrine cells along the digestive tract express neuropilin-2. Biochem. Biophys. Res. Commun. 284: 395-403. Cohen, T., Nahari, D., Cerem, L. et al. (1996). Interleukin 6 induces the expression of vascular endothelial growth factor. J. Biol. Chem., 271: 736-741. Cohen-Kaminsky, S. and Berrih-Aknin, S. (1988) Production of interleukin 1 (IL 1) by thymic epithelial cells (TEC). Adv. Exp. Med. Biol. 237: 299-305. Coskun, S., Uzumcu, M., Jaroudi, K. et al. (1998). Presence of leukemia inhibitory factor and interleukin-12 in human follicular fluid during follicular growth. Am. J. Reprod. Immunol. 40: 13-18. Coulthard, M, Lickliter, J., Subanesan, N. et al. (2001). Characterization of the Ephal receptor tyrosine kinase: expression in epithelial tissues. Growth Factors, 18: 303-317. Cox, G., Burger, J., Lip, V. et. al. (2002). Intracytoplasmic sperm injection may increase the risk of imprinting defects. Am. J. Hum. Genet. 71: 162-164. Cram, D., Ma, K., Bhasin, S. et. al. (2000). Y chromosome analysis of infertile men and their sons conceived through intracytoplasmic sperm injection: vertical transmission of deletions and rarity of de novo deletions. Fertil. Steril. 74: 909-915. Daly DC, Maier D, Soto-Albors C, Hysteroscopic metroplasty: six years experience, Obstet Gynecol 73:201, 1989. Damario, M., Lesnick, T.. Lessey, B. et. al. (2001). Endometrial markers of uterine receptivity utilizing the donor oocyte model. Hum. Reprod. 16: 1893-1899. Danesh J, Whincup P, Walker M, Lennon L, Thomson A, Appleby P, Daniel, T., Stein, E., Cerretti, D.. et al. (1996) ELK and LERK-2 in developing kidney and microvascular endothelial assembly. Kidney Int. Suppl. 57: S73-S81. Dantes TK, Yao Z, Sorokina K, Kotsuji F, Seger R, Amsterdam A, Down regulation of steroidogenic response to gonadotropins in human and n preovulatory granulosa cells involves mitogenactivated protein kinase acti vation and modulation of DAX-1 and steroidogenic factor-1, J Cli Endocrinol Metab 88:2288, 2003. Davy, A., Gale, N. W., Murray, E. et al. (1999) Compartmentalized signaling by GPI-anchored ephrin-A5 requires Fyn tyrosine kinase to regulate cellular adhesion. Genes Dev. 13:3125-3135. De Geyter C, De Geyter M, Huber PR, Nieschlag E, Holzgreve W, Progesterone serum levels during the follicular phase of the menstrual cycle orginate from the crosstalk between the ovaries and the adrenal cortex, Hum Reprod 17:933, 2002. De Gooyer ME, Deckers GH, Schoonen WGEJ, Verheul HAM, Kloosterboer HJ, Receptor profiling and endocrine interactions of tibolone, Steroids 68:21, 2003. De Hondt, A., Peeraer, K., Meuleman, C. et al (2005) Endometriosis and subfertility treatment: a review. Minerva Ginecologica 57(3), 257-267. De Neubourg, D., Mangelschots, K., Van Royen, E. et. al. (2002). Impact of patients' choice for single embryo transfer of a top quality embryo versus double transfer in the first IVF/ICSI cycle.
Literatura
391
Hum. Reprod. 17: 2621-2625. Deed, R., Rooney, P., Kumar, P., et al. (1997). Early-response gene signaling is induced by angiogenic oligosaccharides of hyaluronic acid in endothelial cells. Inhibition by non- angiogenic, high-molecular-weight hyaluronic acid. Internat. J. Cancer 71: 251-256. Dickson SE, Fraser HM, Inhibition of early luteal angiogenesis b\ gonadotropin-releasing hormone antagonist treatment in the primate, J Clin Endocrinol Metab 85:2339, 2000. Dorling AA, Todman MG, Korach KS, Herbison AE, Critical role for estrogen receptor alpha in negative feedback regulation-of gonadotropin-releasing hormone mRNA expression in the female mouse, Neuroendocrinology 78:204, 2003. Downs, S. (2001) A gap-junction-mediated signal, rather than an external paracrine factor, predominates during meiotic induction in isolated mouse oocytes. Zygote 9: 71-82. Duffy DM, Chaffin CL, Stouffer RL, Expression of estrogen receptor alphi and beta in the rhesus monkey corpus luteum during the menstrual cycle regulation by luteinizing hormone and progesterone, Endocrinology 141:1711,2000. Durlinger AL, Gruijters MJ, Kramer P, Karels B, Ingraham HA, Nachtigal MW, Uilenbroek JT, Grootegoed JA, Themmen AP, Anti-Miillerian hormone inhibits initiation of primordial follicle growth in the mouse ovary, Endocrinology 143:1076, 2002. Durlinger ALL, Visser JA, Themmen APN, Regulation of ovarian function: the role of antiMtillerian hormone, Reproduction 124:601, 2002. Ecochard R, Gougeon A, Side of ovulation and cycle characteristics in normally fertile women, Hum Reprod 15:752, 2000. Eichenlaub-Ritter, U. and Peschke, M. (2002). Expression in in vivo and in vitro growing anc maturing oocytes: focus on regulation of expression at the translational level. Hum. Reprod Update 8:21-41. Eisinger SH, Meldrum S, Fiscella K, le Roux HD, Guzick DS, Low-dose mifepristone for uterine leiomyomata, Obstet Gynecol 101:243, 2003. Ellis, I., Banyard, .1. and Schor, S. (1997). Differential response of fetal and adult fibroblasts to cytokincs: cell migration and hyaluronan synthesis. Development, 124: 1593-1600. Endo, T., Kitajima, Y., Nishikawa, A., et al. (2001). Cyclic changes in expression of mRNA of vascular endothelial growth factor, its receptors Fit-1 and KDR/Flk-1, and Ets-1 in human corpora lutea. Fertil. Steril 76: 762-768. Endo, T., Kitajima, Y., Nishikawa, A., et al. (2001). Cyclic changes in expression of mRNA of vascular endothelial growth factor, its receptors Fit-1 and KDR/Flk-1, and Ets-1 in human corpora lutea. Fertil. Steril 76: 762-768. Erickson GF, Shimasaki S, The role of the oocyte in folliculogenesis, Trends Endocrinol Metab 11:193, 2000. Erickson GF, Shimasaki S, The role of the oocyte in folliculogenesis Fabbri, R., Porcu. E., Marsella, T. et. al. (2001). Human oocyte cryopreservation: new perspectives regarding oocyte survival. Hum. Reprod. 16: 411-416. Fauconnier A, Chapron C, Babaki-Fard K, Dubuisson J-B, Recurrence of leiomyomata after myomectomy, Hum Reprod Update 6:595, 2000. Feng, G., Laskowski, M. B., Feldheim, D, et al. (2000). Role of ephrins in positionally selective synaptogenesis between motor neurons and muscle fibers. Neuron 25: 295-306. Filicori M, Cognigni GE, Ciampaglia W, Effects of LH on oocyte yield and developmental competence, Hum Reprod 18:1357, 2003. Filicori M, Cognigni GE, Tabarelli C, Pocognoli P, Taraborrelli S, SpettoL D, Ciampaglia W, Stimulation and growth of antral ovarian follicles by selective LH activity administration in women, J Clin Endocrinol Metab 87:1156, 2002. Filicori, M., Cognini, G., Tabrelli, C. et. al. (2002). Stimulation and growth of antral follicles by selective luteinizing hormone administration in women. J. Clin. Endocrinol. Metab. 87: 1156-1161.
392
Fowkes, R., Chandras, C, Chin, E., et al. (2001). Relationship between the production of prostaglandins and progesterone by luteinizing human granulosa cells. J. Endocr. 171: 455- 462. Frattarelli JL, Lauria-Costab DF, Miller BT, Bergh PA, Scott RT, Basal antral follicle number and mean ovarian diameter predict cycle cancellation and ovarian responsiveness in assisted reproductive technology cycles, Fertil Steril 74:512, 2000. Freeman, S., Yang, Q. and Allran, K. (2000). Women with a reduced ovarian complement may have an increased risk for a child with Down syndrome. Am. J. Hum. Genet. 66: 1680-1683. Gentili, M, Obermuller, N., Schleich, H. (2001). Distinct expression of endothelin receptor subtypes A and B in luteinized human granulosa cells. Horm. Metab. Res. 33: 573-576. Gianaroli, L., Plachot, M., van Kooij, R. et. al. (2000). ESHRE guidelines for good practice in 1VF laboratories. Hum. Reprod. 15: 2241-2246. Glasgow, I., Zeringue ,H., Beebe, D. et. al. (2001). Handling individual mammalian embryos using microfluidics. IEEE Trans. Biomed. Engin. 48:570-578. Gluzman-Poltorak, Z., Cohen, T., Herzog, Y. and Neufeld, G. (2000). Neuropilin-2 is a receptor for the vascular endothelial growth factor (VEGF) forms VEGF-145 and VEGF-165. J. Biol. Chem. 275: 18040-18045. Goodman RL, Gibson M, Skinner DC, Lehman MN, Neuroendocrine control of pulsatile GnRH secretion during the ovarian cycle: evidence from the ewe, Reprod Suppl 59:41, 2002. Graham H, Eternal Eve, The History of Gynaecology & Obstetrics, Doubleday & Company, Inc., Garden City, NY, 1951. Granot I, Dekel N, The ovarian gap junction protein connexin43: regulation by gonadotropins, Trends Endocrinol Metab 13:310, 2002. Greisen S, Ledet T, Ovesen P, Effects of androstenedione, insulin and luteinizing hormone on steroidogenesis in human granulosa luteal cells, Hum Reprod 16:2061, 2001. Grigorieva V, Chen-Mok M, Tarasova M, Mikhailov A, Use of a levonorgestrel-releasing intrauterine system to treat bleeding related to uterine leiomyomas, Fertil Steril 79:1194, 2003. Grimbizis GF, Camus M, Tarlatzis BC, Bontis JN, Devroey P, Clinical implications of uterine malformations and hysteroscopic treatment results, Hum Reprod Update 7:161, 2001. Hardy, K. and Spanos, S. (2002) Growth factor expression and function in the human and mouse preimplantation embryo. J. Endocrinol. 172: 221-236. Hardy, K., Spanos, S., Becker, D., lannelli, P. et al. (2001). From cell death to embryo arrest: Mathematical models of human preimplantation embryo development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1655-1660. Hardy, K.., Wright, C, Franks, S. and Winston, R. (2000). In vitro maturation of oocytes. Br. Me.d Bull. 56: 588-602. Harper, S.. Xing, C, Whittle, C, et al. (2001). Expression of neuropilin-1 by human glomerular epithelial cells in vitro and in vivo. Clin. Sci. (Lond) 101: 439-446. Harris, S., Smith, R. and Phipps, R. (2002). 15-deoxy-Delta 12, 14-PGJ2 induces IL-8 production in human T cells by a mitogen-activated protein kinase pathway. J. Immunol. 168: 1372-1379. Haslinger, B., Mandl-Weber, S., Sellmayer, A. and Sitter, T. (2001) Hyaluronan fragments induce the synthesis of MCP-1 and IL-8 in cultured human peritoneal mesothelial cells. Cell Tissue Res. 305: 79-86. Hawes, S., Sapienza, C. and Latham, K. (2002). Ooplasmic donation in humans - The potential forepigenic modifications. Hum. Reprod. 17: 850-852. Hazzard, T., Molskness. T, Chaffin, C. and Stouffer, R. (1999). Vascular endothelial growth factor (VEGF) and angiopoietin regulation by gonadotropin and steroids in macaque granulosa cells during peri-ovulatory interval. Mol. Hum. Reprod. 5: 1115- 1121. Hewitt SC, Korach KS, Oestrogen receptor knockout mice: roles for oestrogen receptors alpha and beta in reproductive tissues. Reproduction 125:143, 2003. Hewitt SC, Korach KS, Oestrogen receptor knockout mice: roles for
Literatura
393
Hippenstiel, S., Soeth, S., Kellas, B., et al. (2000). Rho proteins and the p38-MAPK pathway are important mediators of LPS-induced interleukin-8 expression in human endothelial cells. Blood 95: 3044-3051. Hosokawa K, Ottander U, Wahlberg P, Ny T, Cajander S, Olofsson IJ. Dominant expression and distribution of oestrogen receptor beta over oestrogen receptor alpha in the human corpus luteum, Mol Hum Reprod 7:137,2001 Hosokawa K, Ottander U, Wahlberg P, Ny T, Cajander S, Olofsson IJ. Dominant expression and distribution of oestrogen receptor beta over oestrogen receptor alpha in the human corpus luteum, Mol Hum Reprod 7:137,2001 Hu, Y., Betzendahl, I., Cortvrindt, R. et al. (2001). Effects of low 0(2) and ageing on spindles and chromosomes in mouse oocytes from pre-antral follicle culture. Mol. Hum. Reprod. 16: 737-748. Huhtaniemi I, Jiang M, Nilsson C, Pettersson K, Mutations and polymorphisms in goandotrophin genes, Mol Cell Endocrinol 151:89, 1999. Hwang, J., Lin, Y. and Tsai, Y. (2000). In vitro maturation and fertilization of immature oocytes: A comparative study of fertilization techniques. J. Assist. Reprod. Genet. 17: 39-43. Inki P, Hurskainen R, Palo P, Ekholm E, Grenman S, Kivela A, Kujansuu E, Teperi J, Yliskoski M, Paavonen J, Comparison of ovarian cyst formation in women using the levonorgestrel-releasing intrauterine system vs. hysterectomy. Ultrasound Obstet Gynecol 20:381, 2002. Jewell, D.P. (2003) Endometriosis. In: Warrell, D.A., Cox, T.M., Firth, J.D. and Benz, E.J. (Eds.) Oxford textbook of medicine (volume 2). 4th edn. Oxford: Oxford University Press. Section 14.22 Kausche, A., Jones, G., Trounson A., et al., (2001.) Sex ratio and birth weights of infants born as a result of blastocyst transfers compared with early cleavage stage embryo transfers. Fertil. Steril. 76: 688-693. Kennedy, S., Bergqvist, A., Chapron, C. et al (2005) ESHRE guideline for the diagnosis and treatment of endometriosis. Human Reproduction 20(10), 2698-2704 Kezele, P., Nilsson, E. and Skinner, M. (2002). Insulin but not insulin-like growth factor-1promotes the primordial to primary follicle transition. Mol. Cell. Endocrinol. 192: 37-43. Khalaf, Y, Taylor, A. and Braude, P. (2000). Low serum estradiol concentrations after five days of controlled ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization are associated with poor outcome. Fertil. Steril. 74: 63-66. Khalaf, Y., El-Toukhy, T., Taylo, A. et al. (2002). Increasing the gonadotrophin dose in the course of an in vitro fertilization cycle does not rectify an initial poor response. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 103: 146-149. Khan-Dawood FS, Oxytocin in intercellular communication in the corpus /Jteum, Seminars Reprod Endocrinol 15:395, 1998. Klein NA, Harper AJ, Houmard BS, Sluss PM, Soules MR, Is the short follicular phase in older women secondary to advanced or accelerated dominant follicle development?, J Clin Endocrinol Metab 87:5746, 2002. Koenig W, Markers of inflammation in women on different hormone replacement therapies, Ann Med 35:353, 2003. Koga, K., Osuga, Y., Tsutsumi, 0. et al. (2000). Evidence for the presence of angiogenin in human follicular fluid and the up-regulation of its production by human chorionic gonadotropin and hypoxia. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85: 3352-3355. Koh, S. W. (2002). Ciliary neurotrophic factor released by corneal endothelium surviving oxidative stess ex vivo. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43: 2887-2896. Kol, S., Ruutiainen-Altman, K., Scherzer, W., et al. (1999). The rat intraovarian intraovarian interleukin (IL)-l system: cellular localization, cyclic variation and hormonal regulation of Il-lbetaandoftype I and type II 11-1 receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 149: 115-128. Kuliev, A., Cieslak, J. lllkevitch, Y. and Verlinsky, Y. (2003). Y chromosomal abnormalities in
394
a series of 6733 human oocytes in preimplantation diagnosis for age-related aneuploidies. Reprod. BioMed. Online 6: 577-583 Loutradis, D., Drakakis, P. Kallianidis, K., et al. (2000). Biological factors in culture media affecting in vitro fertilization, preimplantation embryo development, and implantation. Ann. N.Y. Acad. Sci. 900: 325-335. Macklon, N., Pieters, M, Hassan, M. et al. (2002). A prospective randomized comparison of sequential versus monoculture systems for in-vitro human blastocyst development. Hum. Reprod. 17: 2700-2705. Manna PR, Wang XJ, Stocco DM, Involvement of multiple transcription factors in Ihe regulation of steroidogenic acute regulatory protein gene expression. Steroids 68:1125, 2003. Martinez, F., Rienzi, L., lacobelli, M. et al. (2002). Caspase activity in preiniplantation human embryos is not associated with apoptosis. Hum. Reprod. 17: 1584-1590. Maston GA, Ruvolo M, Chorionic gonadotropin has a recent origin within primates and an evolutionary history of selection, Mol Biol Evol 19:320, 2002. Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q., et al. (2000). Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis. Nat. Cell Biol. 2: 318-325. May-Panloup P., Chretien M., Savagner F., et al.,(2003) Increased sperm mitochondrial DNA content in male infertility. Hum Reprod. 18: 550-556. Mayr-Wohlfart, U., Waltenberger, J., Hausser, H., et al. (2002). Vascular endothelial growth factor stimulates chemotactic migration of primary human osteoblasts. Bone 30: 472-477. McCartney CR, Gingrich MB, Hu Y, Evans WS, Marshall JC, Hypothalamic regulation of cyclic ovulation: evidence that the increase in gonadotropin-releasing hormone pulse frequency during the follicular phase reflects the gradual loss of the restraining effects of progesterone, J Clin Endocrinol Metab 87:2194, 2002. Mikkelsen, A. Andersson, A., Skakkebaek, N. and Lindenberg, S. (2001). Basal concentrations of oestradiol may predict the outcome of in-vitro maturation in regularly menstruating women. Hum. Reprod. 16: 862-867. Mikkelsen, A., Smith, S. and Lindenberg, S. (1999). In vitro maturation of human oocytes from regularly menstruating women may be successful without follicle stimulating hormone priming. Hum. Reprod. 14: 1847-1851. Mikkelsen, A., Smith, S. and Lindenberg, S. (2000). Impact of oestradiol and inhibin A. Hum. Reprod. 15: 1685-1690. Milki, A., Hinckle, M., Fisch, J. et. al. (2000). Comparison of blastocyst transfer with day 3 embryo transfer in similar patient populations. Fertil. Steril. 73:126-129. Minaretzis, D., Harris, D., Alper, M. et. al. (1998). Multivariate Analysis of Factors Predictive of Successful Live Births in In Vitro Fertilization (IVF) Suggests Strategies to Improve IVF Outcome. J. Assist. Reprod. Genet. 15: 365-371. Mora S, Diehl T, Stewart EA, Prolactin is an autocrine growth regulator for human myometrial and leiomyoma cells, J Soc Gynecol Invest 2:396, 1995. Motta PM, Makabe S, Nottola SA, The ultrastructure of human reproduction. I. The natural history of the female germ cell: origin, migration and differentiation inside the developing ovary, Hum Reprod Update 3:281, 1997. Munne, S, Magli, C, Adler, A. et. al. (1997). Treatment-related chromosome abnormalities in human embryos. Hum. Reprod. 12: 780-784. Munne, S. and Wells, D. (2002). Preimplantation genetic diagnosis. Cur. Opin. Obstet. Gynec.14: 239-244. Munne, S., Sandalinas, M., Escudero, T. et. al. (2002). Chromosome mosaicism in cleavagestage human embryos: evidence of a maternal age effect. Reprod. Biomed. Online 4:223-232. Nacharaju, V.. Muneyyirci-Delale, O. and Khan, N (1997). Presence of 11beta- hydroxysteroid
Literatura
395
dehydrogenase in human semen: evidence of correlation with semen characteristics. Steroids 62:311-314. Nagao, Y., Totsuka, Y., Atomi, Y. et. al. (1997). Heterogenous mitochondria DNA introduced by nuclear transfer influences the developmental ability of mouse embryos in vitro. Theriogenology 47: 233-239. Nagy, Z., Cecile, J., Liu, J., et al. (1996). Pregnancy and birth after intracytoplasmic sperm injection of in vitro matured germinal vesicle oocytes: case report. Fertil. Steril. 65: 1047-1050. Nasseri, A., Mukherjee, T., Grifo, J. et al. (1999) Elevated day 3 serum follicle stimulating hormone and/or estradiol may predict fetal aneuploidy. Fertil. Steril. 71: 715-718. Naviaux, R. and and McGowan, . (2000). Organismal effects of mitochondrial dysfunction. Hum. Reprod. 15 (Suppl. 2): 44-56. Nayak NR, Critchley HOD, Slayden OD, Menrad A, Chwalisz K, Baird DT, Brenner RM, Progesterone withdrawal up-regulates vascular endothe-lial growth factor receptor type 2 in the superficial zone of the human and macaque endometrium: potential relevance to menstruation, J Clin Endocrinol Metab 85:3442, 2000. Ng, E., Lan Lau, E., Yeung, W. and Ho, P. (2001). HMG is as good as recombinant human FSH in terms of oocyte and embryo quality: a prospective randomised trial. Hum. Reprod.16: 319-325. Niemann, H. and Wrenzycki, C. (2000). Alteration of expression of developmentally important genes in preimplantation bovine embryos by in vitro culture conditions: implications for subsequent development. Theriogenology 53: 21-34. Nikolettos, A., Al-Hasani, S., Felberbaum, R. et. al. (2000). Comparison of cryopreservation outcome with human pronuclear stage oocytes obtained by the GnRH antagonist, cetrorelix, and GnRH agonists. Eur. J. Obstet Gynecol. Reprod. Biol. 93: 91-95. Nilsson, E., Kezele, P. and Skinner, M. (2002) Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol. Cell. Endocrinol. 188, 65-73. Nilsson, S., Haylock, D. Johnston, H., et al. (2003). Hyaluronan is synthesized by primitive hemopoietic cells, participates in their lodgment at the endosteum following transplantation,and is involved in the regulation of their proliferation and differentiation. Blood 101: 856-862. Nilsson, S., Haylock, D. Johnston, H., et al. (2003). Hyaluronan is synthesized by primitive hemopoietic cells, participates in their lodgment at the endosteum following transplantation,and is involved in the regulation of their proliferation and differentiation. Blood 101: 856-862 Noci, I., Maggi, M., Fuzzi, B., et al. (2000). Effects of low day 3 luteinizing hormone levels on in vitro fertilization treatment outcome. Gyn. Endocr. 14: 321-326. Norwitz ER, Xu S, Jeong KH, Bedecarrats GY, Winebrenner LD, Chin WW, Kaiser UB, Activin A augments GnRH-mediated transcriptional activ-itation of the mouse GnRH receptor gene, Endocrinology 143:985, 2002. Oktay K, Newton H, Mullan J, Gosden RG, Development of human primordial follicles to antral stages in SCID/hpg mice stimulated with follicle stimulating hormone, Hum Reprod 13:1133, 1998. Oktay, K. and Yih, M. (2002). Preliminary experience with orthotopic and heterotopic transplantation of ovarian cortical strips. Semin. Repro. Med. 20: 63-74. Oktay, K. and Karlikaya, G. (2000). Ovarian function after transplantation of frozen, banked autologous tissue. N. Eng. J. Med. 342:1919. Oktay, K., Economos, K., Kan, M. et al (2002). Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. JAMA 286: 1490-1493. Olive, D.L. (2004) Optimizing gonadotropin-releasing hormone agonist therapy in women with endometriosis. Treatments in Endocrinology 3(2), 83-89. O'Loughlin, E., Pang, G., Noltorp, R., et al. (2001). Interleukin-2 modulates ion and cell proliferation in cultured human small intestinal enterocytes. Gut 49: 636-643. O'Loughlin, E., Pang, G., Noltorp, R., et al. (2001). Interleukin-2 modulates ion and cell prolif-
396
eration in cultured human small intestinal enterocytes. Gut 49: 636-643. Omodei U, Ferrazzia E, Ruggeri C, Palai N, Fallo L, Dordoni D, Peruginoa G, Endometrial thickness and histological abnormalities in women on hormonal replacement therapy: a transvaginal ultrasound/hystero-scopic study, Ultrasound Obstet Gynecol 15:317, 2000. O'Shaughnessy PJ, Fleming LM, Jackson G, Hochgeschwender U, Reed P, Baker PJ, Adrenocorticotropic hormone directly stimulates testosterone production by the fetal and neonatal mouse testis, Endocrinology 144:3279, 2003. Osterlund MK, Gustafsson J-A, Keller E, Hurd YL, Estrogen receptor B (ER6) messenger ribonucleic acid (mRNA) expression within the human forebrain: distinct distribution pattern to ERa mRNA, J Clin Endocrinol Metab 85:3840. 2000. Pall M, Friden BE, Brannstrom M, Induction of delayed follicular rupture in the human by the selective COX-2 inhibitor rofecoxib: a randomized double-blind study, Hum Reprod 16:1323, 2001. Palmert MR, Hayden DL, Mansfield MJ, Crigler JF, Jr., Crowley \V1 Jr., Chandler DW, Boepple PA, The longitudinal study of adrenal mature tion during gonadal suppression: evidence that adrenarche is a gradu^ process, J Clin Endocrinol Metab 86:4536, 2001. Palomba S, Orio F, Jr., Morelli M, Russo T, Pellicano M, Nappi C, Mastrantonio P, Lombardi G, Colao A, Zullo F, Raloxifene administration in women treated with gonadotropin-releasing hormone agonist for uterine leiomyomas: effects on bone metabolism, J Clin Endocrinol Metab 87:4476, 2002. Palomba S, Orio F, Jr., Morelli M, Russo T, Pellicano M, Zupi E, Lombardi G, Nappi C, Panici PL, Zullo F, Raloxifene administration in premenopausal women with uterine leiomyomas: a pilot study, J Clin Endocrinol Metab 87:3603, 2002. Palomba S, Russo T, Orio F, Jr., Tauchmanova L, Zupi E, Panici PLB, Nappi C, Colao A, Lombardi G, Zullo F, Effectiveness of combined GnRH analogue plus raloxifene administration in the treatment of uterine leiomyomas: a prospective, randomized, single-blind, placebo-controlled clinical trial, Hum Reprod 17:3213, 2002. PanY,Anthony M, Clarkson TB, Effect of estradiol and soy phytoestrogens on choline acetyltransferase and nerve growth factor mRNAs in the frontal cortex and hippocampus of female rats, Proc Soc Exp Biol Med 221:118, 1999. Pasquino AM, Passed F, Pucarelli I, Segni M, Municchi G, Spontaneous pubertal development in Turner's syndrome. Italian Study Group foi Turner's Syndrome, J Clin Endocrinol Metab 82:1810, 1997. Penotti M, Fabio E, Modena AB, Rinaldi M, Omodei U, Vigano P, Effect of soy-derived isoflavones on hot flushes, endometrial thickness, and the pulsatility index of the uterine and cerebral arteries, Fertil Steril 79:1112. 2003. Pernasetti F, Vasilyev VV, Rosenberg SB, Bailey JS, Huang HJ, Miller WL, Mellon PL, Cellspecific transcriptional regulation of follicle-stimulating hormone-beta by activin and gonadotropin-releasing hormone in the LbetaT2 pituitary gonadotrope cell model, Endocrinology 142:2284, 2001. Piccinni, M., Scaletti, C, Mavilia, C, et al. (2001). Production of IL-4 and leukemia inhibitory factor by T cells of the cumulus oophorus: a favorable microenvironment pre-implantation embryo development. Eur. J. Immunol. 31: 2431-2437. Pickar JH, Yeh IT, Wheeler JE, Cunnane MF, Speroff L, Endometrial effects of lower doses of conjugated equine estrogens and medroxy-progesterone acetate: two-year substudy results, Fertil Steril 80:1234, 2003. Pritts EA, Fibroids and infertility: a systematic review of the evidence, Obstet Gynecol Survey 56:483, 2001. Pron G, Bennett J, Common A, Wall J, Asch M, Sniderman K, for the Ontario Uterine Fibroid Embolization Collaborative Group, The Ontario Uterine Fibroid Embolization Trial. Part 2. Uterine
Literatura
397
fibroid reduction and symptom relief after uterine artery embolization for fibroids, Fertil Steril 79:120,2003. Raga F, Bauset C, Remohi J, Bonilla-Musoles F, Simon C, Pellicer A, Reproductive impact of congenital Mullerian anomalies, Hum Reprod 12:2277, 1997. Raga F, Casafl EM, Wen Y, Huang H-Y, Bonilla-Musoles F, Plan ML, Independent regulation of matrix metalloproteinase-9, tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1), and TIMP-3 in human endoraetrial stromal cells by gonadotropin-releasing hormone: implications in early human implantation, J Clin Endocrinol Metab 84:636, 1999. Raga F, Casan EM, Druessel JS,Wen Y, Huang HY, Nezhat C, Polan ML, Quantitative gonadotropin-releasing hormone gene expression and immunohistochemical localization in human endometrium throughout the menstrual cycle, Biol Reprod 59:661, 1998. Rossi G, Diamond MP, Myomas, reproductive function, and pregnancy, Seminars Reprod Endocrinol 10:332, 1992. Salmassi, A., Lu, S., Hedderich, J., et al. (2001). Interaction of interleukin-6 on huma-granulosa cell steroid secretion. J. Endocr. 170: 471-478. Scarman, van Daal, A., Kelly, G. and Timms, P. (2002) DNA-based diagnosis of Chlamydia pneumoniae - the significance of sample type and preparation. J Clinical Microbiology (submitted) Scarman, van Daal, A., Kelly, G. and Timms, P. (2003) DNA-based diagnosis of Chlamydia pneumoniae - the significance of sample type and preparation. (in preparation) Schairer C, Adami H-O, Hoover R, Persson I, Cause-specific mortality in women receiving hormone replacement therapy, Epidemiology 8:59, 1997. Schieve, L., Meikle, S., Ferre, C. et. al. (2002). Low and very low birth weight in infants conceived with the use of assisted reproductive technology. N. Engl. J. Med. 346: 731-737. Schipper I, de Jong FH, Fauser BC JM, Lack of correlation between maximum early follicular phase serum follicle stimulating hormone concentrations and menstrual cycle characteristics in women under the age of 35 years, Hum Reprod 13:1442, 1998. Schipper I, Hop WCJ, Fauser BCJM, The follicle-stimulating hormone (FSH) threshold/window concept examined by different interventions with exogenous FSH during the foilicular phase of the normal menstrual cycle: duration, rather than magnitude, of FSH increase affects follicle development, JClin Endocrinol Metab 83:1292, 1998. Schlaff, W.D., Carson, S.A., Luciano, A. et al (2006) Subcutaneous injection of depot medroxyprogesterone acetate compared with leuprolide acetate in the treatment of endometriosis-associated pain. Fertility and Sterility 85(2), 314-325. Schoolcraft, W. and Gardner, D. (2001). Blastocyst versus day 2 or 3 transfer. Seminars in Reprod. Med. 19: 259-268. Schwartz M. and Vissing J. (2002) Paternal inheritance of mitochondrial DNA. N. Eng. J. Med. 347:576-579. Sealfon SC, Weinstein H, Millar RP, Molecular mechanisms of ligand interaction with the gonadotropin-releasing hormone receptor, Endocr Rev 18:180, 1997. Sebastian S, Bulun SE, A highly complex organization of the regulatory region of the human CYP19 (aromatasc) gene revealed by the human genome project, J Clin Endocrinol Metab 86:4600, 2001. Seifer D., DeJesus V., and Hubbard, K. (2002). Mitochondrial deletions in luteinized granulosa cells as a function of age in women undergoing in vitro fertilization. Fertil. Steril. 78:1046-1048 Senn, A., Vozzi, C. and Chanson, A. (2000). Prospective randomised study of two cryopreservation policies avoiding embryo selection: the pronucleate stage leads to higher cumulative delivery rate than the early cleavage stage. Fertil. Steril. 74: 946-952. Shibanuma K, Tong Z-B, Vanderhoof VH, Vanevski K, Nelson LM, Investigation of KIT gene mutations in women with 46,XX spontaneous premature ovarian failure, BMC Women s Health 2:8, 2002.
398
Shiloh, H. and Dirnfeld, M. (2001). Study of zona pellucida thickness of embryos before their transfer and relation to age and follicle-stimulating hormone. Reprod. Tech. 10: 307-310. Shoubridge, E. (2000). Mitochondrial segregation in the developing embryo. Hum. Reprod. 15 (Suppl. 2): 229-234. Silvestri A, Gebara O, Vitale C, Wajngarten M, Leonardo F, Ramieres JA, Fini M, Mercucro G, Rosano GM, Increased levels of C-reactive protein after oral hormone replacement therapy may not be related to an increased inflammatory response, Circulation 107:3165, 2003. Sinclair, K., Young, L., Wilmut, I. and McEvoy, T. (2000). In-utero overgrowth in ruminants following embryo culture: lessons from mice and a warning to men. Hum. Reprod. 15 (Suppl. 5): 68-86. Smith TP, Suliman AM, Fahie-Wilson MN, McKenna TJ, Gross variability in the detection of prolactin in sera containing big big prolactin (macroprolactin) by commercial immunoassays, J Clin Endocrinol Metab 87:5410, 2002. Smith, M., Mathur, R., Keay, S., Hall, L., et al. (2000) Periovulatory human oocytes, cumulus cells, and ovarian leukocytes express type 1 but not type 2 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase RNA. Fertil. Steril. 73: 825-830. Smith, S., Mikkelsen, A. and Lindenberg, S. (2000). Development of human oocytes matured in vitro for 28 or 36 hours. Fertil. Steril. 73: 541-544. Strehler, E., Abt, M., El-Danasouri, I. et. al. (2001). Impact of recombinant follicle-stimulating hormone and human mcnopausal gonadotropins on in vitro fertilization outcome. Fertil. Steril. 75: 332-336. Su, Y.. and Eppig, J. (2002). Evidence that multifunctional calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaM KII) participates in the meiotic maturation of mouse oocytes. Mol. Reprod. Dev. 61:560-569 Suh, C, Jee, B., Choi, Y. et al. (2002). Prognostic implication of apoptosis in human luteinized granulosa cells during IVF-ET. J. Assist. Reprod. Genet 19: 209-214. Suikkari, A., Tulppala, M., Tuuri, T., et al. (2000). Luteal phase start of low-dose FSH priming of follicles results in an efficient recovery, maturation and fertilization of immature human oocytes. Hum. Reprod. 15: 747-751. Sullivan MW, Stewart-Akers A, Krasnow JS, Berga SL, Zeleznik AJ. Ovarian responses in women to recombinant follicle-stimulating hormon and luteinizing hormone (LH): a role for LH in the final stages of follicuir maturation, J Clin Endocrinol Metab 84:228, 1999. Suzuki, H., Jeong, B. and Yang, X. (2000). Dynamic changes of cumulus-oocyte cell communication during in vitro maturation of porcine oocytes. Biol. Reprod. 63: 723-739. Sykes, D., Out, H., Palmer, S. and van Loon, J. (2001). The cost-effectiveness of IVF in the UK: a comparison of three gonadotrophin treatments. Hum. Reprod. 16: 2557-2562. Takashima, S., Kitakaze, M., Asakura, M, ct al. (2002). Targeting of both mouse neuropilin-1 and neuropilin-2 genes severly impairs developmental yolk sac and embryonic angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99: 3657-3662. Takeuchi, T., Gong, J., Veeck, L. et. al. (2001). Preliminary findings in germinal vesicle transplantation of immature human oocytes. Hum. Reprod. 16: 730-736. Tamura, K.., Kawaguchi, T., Hara, T., et al. (2000). Interleukin-6 decreases estrogen production and messenger ribonucleic acid expression encoding aromatase during in vitro cytodifferentiation of rat granulosa cell. Mol. Cell Endocrinol. 170:103-111. Tan, S., Child, T. and Gulekli, B. (2002). In vitro maturation and fertilization of oocytes from unstimulated ovaries: predicting the number of immature oocytes retrieved by early follicular phase ultrasonography. Am. J. Obstet. Gynecol. 186: 684-689. Tanenbaum DM, Wang Y, Williams SP, Sigler PB, Crystallographic comparison of the estrogen and progesterone receptors ligand binding domains, Proc Natl Acad Sci USA 95:5998, 1998. Tazuke SI, Giudice LC, Growth factors and cytokines in endometrium, embryonic development, and maternal.'embryonic interactions, Seminars Reprod Endocrinol 14:231, 1996.
Literatura
399
Tease, C, Hartshorne, G. and Hulten, M. (2002). Patterns of meiotic recombination in human fetal oocytes. Am. J. Hum. Genet. 70: 1469-1479. Terada ,Y., Luetjens, C, Sutovsky, P. and Schatten, G.(2000). Atypical decondensation of the sperm nucleus, delayed replication of the male genome, and sex chromosome positioning following intracytoplasmic human sperm injection (ICSI) into hamster eggs: Does ICSI itself introduce chromosomal anomalies? Fertil. Steril. 74: 454-460. Tesarik, J. (2002). Reproductive semi-cloning respecting biparental embryo origin: Embryos from syngamy between a gamete and a haploidized somatic cell. Hum. Reprod. 17: 1933-1937. Tesarik, J., Junca, A., Hazout, A. et. al. (2000). Embryos with high implantation potential after intracytoplasmic sperm injection can be recognized by a simple, non-invasive examination of pronuclear morphology. Hum. Reprod. 15: 1396-1399. Tesarik, J., Mendoza, C, Anniballo, R. and Greco, E. (2000b). In-vitro differentiation of germ cells from frozen testicular biopsy specimens. Hum. Reprod. 15: 1713-1716. The European Recombinant Human LH Study Group, Recombinant human luteinizing hormone (LH) to support recombinant human follicle-stimulating hormone (FSH)-induced follicular development in LH- and FSH-deficient anovulatory women: a dose-finding study, J Clin Endocrinol Metab 83:1507, 1998. The Women's Health Initiative Steering Committee, Effects of Thurston, L., Norgate, D., Jonas, K, et al (2002a) Endogenous ovarian modulators of ll betahydroxysteroid dehydrogenase (11betaHSD) activity correlate cortisol/cortisone ratios in human follicular fluid (hFP"). Reproduction Suppl) Abstract Series No.28: Abstract 25 Thurston, L., Norgate, D., Jonas, K.. et al. (2002b). Endogenous modulators of 11beta- hydroxysteroid dehydrogenase (11betaHSD) activity and cortisol/cortisone ratios in human follicular fluid (hFF) correlate with the outcome of in vitro fertilizsation-embryo transfer (IVF-ET). Reproduction (Suppl.) Abstract Series No.28: Abstract 26. Tiitinen, A., Halttunen, M., Harkki, P. et. al. (2001). Elective embryo transfer: the value of cryopreservation. Hum. Reprod. 16: 1140-1144 Tilford, C, Kuroda-Kawaguchi, T., Skaletsky, H., et al. (2001). A physical map of the human Y chromosome. Nature 409: 943-945. Utian WH, Shoupe D, Bachmann G, Pinkerton JV, Pickar JH, Relief of vasomotor symptoms and vaginal atrophy with lower doses of conjugated equine estrogens and medroxyprogesterone acetate, Fertil Steril 75:1065, 2001. Van Blerkom, J., Davis, P. and Alexander, S. (2000). Differential mitochondrial distribution in human pronuclear embryos leads to disproportionate inheritance between blastomeres: relationship to microtubular organization, ATP content and competence. Hum. Reprod. 15: 2621-2633. Van Blerkom, J., Davi, P., Mathwig, V. et al. (2002). Domains of high-polarized and low-polarized mitochondria may occur in mouse and human oocytes and early embryos. Hum. Reprod. 17:393-406. Van Blerkom, J., Davis, P. and Alexander, S. (2000). Differential mitochondrial inheritance between blastomeres in cleavage stage human embryos: Determination at the pronuclear stage and relationship to microtubular organization, ATP content and developmental competence. Hum. Reprod. 15: 2621-2633. Van Blerkom, J., Davis, P. and Alexander, S. (2001). A microscopic and biochemical study of fragmentation in stage-appropriate human embryos. Hum. Reprod. 16: 719-729. Van den Bosch T, Van Schoubroeck D, Ameye L, De Brabanter J, Van Huffel S, Timmerman D, Ultrasound assessment of endometrial thickness and endometrial polyps in women on hormonal replacement therapy, Am J Obstet Gynecol 188:1249, 2003. Van Golde, R., Wetzels, A., de Graaf, R., et al. (2001). Decreased fertilization rate and embryo quality after 1CSI in oligozoospermic men with microdeletions in the azoospermia factor c region
400
of the Y chromosome. Hum. Reprod 16: 289-292. van Montfrans, J., Lambalk, C, van Hooff, M. et al. (2001). Are elevated FSH concentrations in the pre-conceptional period a risk factor for Down's syndrome pregnancies? Mol. Hum. Reprod, 16: 1270-1273. van Zonneveld P, Scheffer GJ, Broekmans FJ, Blankenstein MA, de Jong FH, Looman CW, Habbema JD, te Velde ER, Do cycle disturbances explain the age-related decline of female fertility? Cycle characteristics of women aged over 40 years compared with a reference population of young women, Hum Reprod 18:495. 2003. Varila E, Wahlstrom T, Rauramo I, A 5-year follow-up study on the use of a levonorgestrel intrauterine system in women receiving hormone replacement therapy, Fertil Steril 76:969, 2001. Verlinsly, Y. and Kuliev, A. (2000). Atlas of Preimplantation Genetic Diagnosis. Parthenon, N.Y. London, pp. 174. Vidaeff, A. and Racowsky, C. (2000). Blastocyst transfer in human in vitro fertilization. A solution to the multiple pregnancy epidemic. J. Reprod. Med. 45: 529-540. Vigano, P., Fusi, P., Gaffuri, B., et al. (1998). Soluble intercellular adhesion molecule-1 in ovarian follicles: production by granulosa luteal cells and levels in the follicular fluid. Fertil. Steril. 69: 774-779. Vitt, U , Nayudu P., Rose U, and Kloosterboeeer, H. (2001). Embryonic development after follicle culture is influenced by follicle stimulating hormone isoelectric point range. Biol Reprod 65:1542-1547. Viville B, Charnock-Jones DS, Sharkey AM, Wetzka B, Smith SK, Distribution of the A and B forms of the progesterone receptor messenger ribonucleic acid and protein in uterine leiomyomata and adjacent myometrium, Hum Reprod 12:815, 1997. Wang, W., Meng, L., Hackett, R. ct. al. (2002). Rigorous thermal control during intracytoplasmic sperm injection stabilizes the meiotic spindle and improves fertilization and pregnancy rates. Fertil. Steril. 77: 1274-1277. Wang, X., Chen, H., Yin, H. et al. (2002). Fertility after intact ovary transplantation. Nature 415: 385. Welt CK, Martin KM, Taylor AE, Lambert-Messerlian GM, Crowley WF, Jr., Smith JA, Schoenfeld DA, Hall JE, Frequency modulation of follicle-stimulating hormone (FSH) during the luteal-follicular transition: evidence for FSH control of inhibin B in normal women, J Clin Endocrinol Metab 82:2645, 1997. Welt CK, McNicholl DJ, Taylor AE, Hall JE, Female reproductive aging is marked by decreased secretion of dimeric inhibin, J Clin Endocrinol Metab 84:105, 1999. Welt CK, Pagan YL, Smith PC, Rado KB, Hall JE, Control of follicle-stimulating hormone by estradiol and the inhibins: critical role of estradiol at the hypothalamus during the luteal-follicular transition, J Clin Endocrinol Metab 88:1766, 2003. White RB, Eisen JA, Kasten TL, Fernald RD, Second gene for gonadotropin-releasing hormone in humans, Proc NatlAcadSci USA 95:305, 1998. WHO (2004) Low-dose combined oral contraceptives (COCs). Medical eligibility criteria for contraceptive use. World Health Organization. http://www.who.int/ [Accessed: 20/09/2006]. Woelfer B, Salim R, Banerjee S, Elson J, Regan L, Jurkovic D, Reproductive outcomes in women with congenital uterine anomalies detected by three-dimensional ultrasound screening, Obstet Gynecol 98:1099,2001. Wu, J., Zhang, L. and Wang, X. (2001). In vitro maturation, fertilization and embryo development after ultrarapid freezing of immature human oocytes. Reprod. 121: 389-393. Wulff C, Wilson H, Largue P, Duncan WC, Armstrong DG, Fraser H Angiogenesis in the human corpus luteum: localization and change> -angiopoiedns, tie-2, and vascualr endothelial growth factor messer.p ribonucleic acid, J Clin Endocrinol Metab 85:4302, 2000. Wulff C, Wilson H, Wiegand SJ, Rudge JS, Fraser HM, Prevention thecal angiogenesis, antral
Literatura
401
follicular growth, and ovulation in the primate -treatment with vascular endothelial growth factor Trap R1R2, Endocrinolog 143:2797, 2002. Wylie C, Germ cells, Cell 96:165, 1999. Yang M, Lei ZM, Rao C, The central role of human chorionic gonadotropir in the formation of human placental syncytium, Endocrinology 144:1108 2003. Yang M, Lei ZM, Rao C, The central role of human chorionic gonadotropir in the formation of human placental syncytium, Endocrinology 144:1108 2003. Yap, C., Furness, S. and Farquhar, C. (2004) Pre and post operative medical therapy for endometriosis surgery (Cochrane review). The Cochrane Library. Issue 3. Chichester, UK: John Wiley & Sons, Ltd. www.nelh.nhs.uk/cochrane.asp [Accessed: 13/03/2006 Young KA, Chaffin CL, Molskness TA, Stouffer RL, Controlled ovulation of the dominant follicle: a critical role for LH in the late follicular phase the menstrual cycle, Hum Reprod 18:2257, 2003. Yuan, L., Liu, J.., Hoja, M. et al. (2002). Female germ cell aneuploidy and embryo death of mice lacking the meiosis-specific protein SCP3. Science 296: 1115-1118. Yuasa, H., Takakura, N., Shimomura, T., et al. (2002). Analysis of human TIE2 function on hematopoietic stem cells in umbilical cord blood. Biochem. Biophys. Res. Commun. 298:731-737. Zacharias L, Wurtman RJ, Blindness: its relation to age of menarche. Science 144:1154, 1964. Zacharias L, Wurtman RJ, Blindness: its relation to age of menarche. Science 144:1154, 1964. Zaneveld LJD, Polakoski KL, Williams WL, Properties of a proteolytic enzyme from rabbit sperm acrosomes, Biol Reprod 6:30, 1972. Zaneveld LJD, Polakoski KL, Williams WL, Properties of a proteolytic enzyme from rabbit sperm acrosomes, Biol Reprod 6:30, 1972. Zarifian T, Olivares A, Soderlund D, Mendez JP, Ulloa-Aguirre A,Changes in the biologicakimmunological ratio of basal and GnRH-releasable FSH during the follicular, pre-ovulatory and luteal phases of the human menstrual cycle, Hum Reprod 16:1611, 2001. Zarifian T, Olivares A, Soderlund D, Mendez JP, Ulloa-Aguirre A,Changes in the biologicakimmunological ratio of basal and GnRH-releasable FSH during the follicular, pre-ovulatory and luteal phases of the human menstrual cycle, Hum Reprod 16:1611, 2001. Zawin M, McCarthy S, Scoutt LM, Comite F, High-field MRI and US evaluation of the pelvis in women with leiomyomas, Mag Reson Imaging 8:371, 1990. Zawin M, McCarthy S, Scoutt LM, Comite F, High-field MRI and US evaluation of the pelvis in women with leiomyomas, Mag Reson Imaging 8:371, 1990. Zeeman GG, Khan-Dawood FS, Davvood MY, Oxytocin and its receptor in pregnancy and parturition: current concepts and clinical implications, Obstet Gynecol 89:873, 1997. Zeeman GG, Khan-Dawood FS, Davvood MY, Oxytocin and its receptor in pregnancy and parturition: current concepts and clinical implications, Obstet Gynecol 89:873, 1997. Zeitzer JM, Daniels JE, Duffy JF, Klerman EB, Shanahan TL, Dijk DJ. Czeisler CA, Do plasma melatonin concentrations decline with age?, Am J Med 107:432, 1999. Zeitzer JM, Daniels JE, Duffy JF, Klerman EB, Shanahan TL, Dijk DJ. Czeisler CA, Do plasma melatonin concentrations decline with age?, Am J Med 107:432, 1999. Zhang J, Salamonsen LA, tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP)-l, -2, and -3 in human endometrium during the menstrual cycle, Mol Hum Reprod 3:735, 1999.
402
INDEX
A
Adultne stem }elije, 377, 378 AIH - artificial insemination by husband, 356 alelomorfa, 243 Alternativne metode le~enja, 100, 173 AMH - anti-Mullerian hormone, 295, 304 Analiza ejakulata, 162 aneuploidnost, 31,32,186,188,189,190, 192,193,194,208,209,221,233,246,256, 275,276,288,289,291,292,296,299,301, 301, 302, 303,304,305,306, Angelman-ovog sindroma, 4,75, 222, 223 Anomalije kariotipa prenatalne dijagnoze, 245 APC - anaphase promoting complex, 297, 299 apoptoze oocita, 303 ARDS - acute respiratory distress syndrome, 326 Arteficijalna inseminacija, 213, 214 Asistirani hatching, 204 Asistirani hatching laserom, 204 ATP - adenosine triphosphate, 49, 50, 51, 189, 295, 300 Autoreinfuzije aspirisane te~nosti, 325 AZF - azoospermia factors, 220, 236, 237 AZFc-azoospermia factors, 237, 240, 241
Centrozoma spermatozoida, 165 CFTR cystis fibrosis transmembrane conductance regulator gen, 220 checkpoint control, 297, 299 Citokini, 40, 87, 88, 101, 113 CK kreatin kinaze, 189, 195 CL - corpus luteum, 42, 54, 55, 56, 79, 80, 178, 180, 211, 254, 259, 260, 327 Coasting tehnika, 327 COS - kontrolisana stimulacija ovarijuma, 180, 181 Cryoloop, 285, 286 CSF - cytostatic factor, 298, 299 CVS - chorionic villus sampling, 208, 221
D
DAZ - deleted in azoospermia homolog gen, 236, 237, 239, 240, 241, 242, 248 DAZ - deleted in azoospermia homolog genski cluster, 236 DBY - dead box Y chromosome gen, 237, 238, 242 delecija, 217, 236, 237, 242, 243, 245, 248, 333, 340 DMAP - 6-dimetilaminopurina, 38, 228 DMSO dimethyl sulfoxide, 281, 283 Donacija gameta i embriona, 313, 314,382 Down-ov sindrom, 207, 292, 333, 339
B
balansirane translokacije, 245, 246, 335 birefrigence, 373 Body mass index, 113, 181, 307, 308 BWS - Beckwith Wiedemann syndrome, 74, 75, 222, 223
E
E mi1, 299 EBM - evidenciono bazirana medicina, 167 EBSS - Earle's balanced salt solution, 368 EDTA- ethylenediaminetetraacetic acid, 190 EG - ethylene glycol, 283, 284 EGF - epidermal growth factor, 86, 87, 88, 229, 230, 231, 253, 368 EIM - european IVF- monitoring programe, 355
C
CBAVD - congenital bilateral absence of the vas deferens, 217, 218, 220 CBG - corticosteroid binding globulin, 250, 261, 262
Index
403
ejakulirani spermatozoidi, 217 ekspresije i raspodele genskih produkata, 301 Ekstra-peritonealna insuflacija gasa, 158 Ektopi~na trudno}a, 317 Elektivna redukcija fetusa, 331, 352 Elektrokauterizacija ili laser vaporizacija jednog ili oba ovarijuma, 328 embrionski markeri implantacije, 250 Embriotransfer, 186, 208, 210, 211, 280, 317, 345, 354, 356 equilibrium freezing, 277 eSET elective single embryo transfer, 354 Estradiol, 35, 41, 55, 57, 58, 60, 79, 83, 118, 121, 126, 183,184, 186, 207, 214 EUFA- early unilateral folicular aspiration, 327 evolucije X homologih gena Y hromozoma, 243 evolucije X i Y hromozoma, 239, 242, 244 evolucioni mehanizam degeneracije Y hromozoma, 243
254, 255, 301, 302, 303, 304, 307, 309, 310, 311, 319, 328
G
Gasna embolija, 156, 159 GDF-9 - growth differentiation factor 9, 304 gene chip tehnology, 304 GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor, 260 GnRH agonisti, 124, 125, 179, 180, 184, 186, 211, 303, 327 GnRH antagonisti, 100, 180, 186 Gradijentna separacija, 192, 193 GTP - guanosine triphosphate, 295 gustinski gradijent, 189, 190, 191 GVBD - germinal vesicle breakdown, 37, 38, 39, 118, 226, 228, 232, 294
H
HA hyaluronic acid, 189, 193, 194, 195 HAES - hydroxyethyl starch rastvor, 325 HB-EGF - heparin binding epidermal growth factor, 87, 368 HCG Humani horionski gonadotropin, 34, 56,87,118,127,179,180,184,186,187,211, 214,215,228,229,230,231,233,251,252, 253,255,259,265,267,306,318,319,320, 323,327,328, HEPA-high efficiency particulate air filtraciju, 362, 363 hESC - human embryonic stem cell, 378, 379, 380, 381 heterotopi~ne autotransplantacije, 282 hialuronat, 367, 368 Hidrosalpinks, 329, 330 high response, 307 Hirur{ki pristup OHSS, 326 Histerosalpingogram, 329 Histeroskopija, 161 HMG- humani menopauzalni gonadotropin, 179, 180, 214, 255, 302 HOS- hypoosmotic swelling test, 275 HPLC - high performance liquid chromatography, 181 HSET - kinesin related protein, 295 HSP70 - heat shock protein, 303 HspA2 - heat shock 70kDa protein 2, 188, 190 Humani X hromozom, 234 Humani Y hromozom, 235, 243
F
Faktori rasta, 39,40, 49, 53, 86, 87, 88, 229, 251, 300, 368 FbM - filled by mass tehnika, 181 Fertilizacija, 57, 177,178, 188, 197, 252, 254, 267, 276, 318 Fetus, 35, 69, 77, 106,107,110, 118, 119, 128,147,187,289, 300, 302, 331, 352, 376 FF - follicle fluid, 259 FF - MAS - follicular fluid meiosis activating sterol, 231, 232, 301 FI - flow index, 152, 260 FISH - fluorescence in situ hybridization, 31, 32, 33, 191, 192, 195, 207, 296 fizikalne metode le~enja, 173 Flexipet-denuding pipette, 285 Flow index, 309, 310 FNA - fine needle aspiration, 219 folikularni markeri implantacije, 250,251 follicle dysfunction, 311 FOXL2 - forkhead transcription factore gene, 304 fragmentacija, 53, 166, 198, 199, 200, 201, 259, 286 fresh embrio transfer, 280 FSH - follicle stimulating hormone, 35,37,47, 48, 51, 54, 55, 57, 58, 116,117, 121,124, 126,136,137,138,140,142,143, 144, 153,171,178,179,180,181,182,186, 205,207,214,228,228, 230, 231,251, 252,
404
I
ICSI - intra citoplasmatic sperm injection, 34,50,75,131,188,194,195,196,197,207, 209,210,213,216,217,218,219,220,221, 222,223,224,225,228,229,234,235,238, 244,246,247,249,255,256,272,274,275, 276,278,282,287,342,345,347,350,351, 352,353,354,355,361 Identifikacija oocita, 187 IGF - insulin like growth factor, 253 IL - interleucin, 260 IMC - inseminating motile count, 213 In vitro fertilizacija, 177, 188, 318 Index vaskularizacije, 309 Inhibin, 54, 138, 182, 253, 254, 300, 302, 307, 309 Integrin, 52, 82, 88, 185 Interleukini, 261 Inverziona petlja, 336 IUI - intrauterina inseminacija, 213,214,215 IVF laboratorija, 359 IVM - in vitro maturation, 226, 227, 228, 229, 230, 232, 233, 278, 281
LH -luteinizing hormone, 34,35,37,48,54, 56,57,58,79,81,82,100, 116,117,118,121, 124,126,127,136,137,138,142,143,153, 178,179,182,186,187,207,211,226,228, 230, 251, 252, 265, 267, 319, 327, 328 LIF - leukemia inhibitory factor, 185, 368, 378 Louise Joy Brown, 177, 178 LTMD - long term moderate dosis, 328 Luteal support, 178, 184, 211, 215
M
MAD 2 - mitotic arrest deficiency 2 protein, 299 MAP - mitogen activated protein kinaze, 38, 295, 299 MAS - meiosis activating sterol, 231, 232 Medijastinalni emfizem, 158 Mehani~ki asistirani hatching, 204 menopauza, 27, 42, 89, 97, 179, 288, 301, 302, 304, 305, 306, 308, 311, 382 MESA - microsurgical epididymal sperm aspiration, 219, 224, 234 mikrodelecija, 237, 246, 248, 249 MISS - meiotic spindle stability protein, 295 Mitohondrija spermatozoida, 165 mitohondrije, 51, 64, 164, 200, 206, 274, 284, 293, 295, 299, 300 mitohondrijske respiracije, 299 monopolin, 298 mPBR - mitochondrial peripheral benzodiazepine receptor, 299 MPF - maturation promoting factor, 295, 297 mtDNK - mitochondrial DNK, 300 MTOC - microtubule organizing center, 294, 295
K
Kariotip ~oveka, 332, 333, 334, 335 kateteri za embrio transfer, 210 Klasifikacija blastociste, 201 Klinefelter-ov sindrom, 135, 141, 142, 209, 245, 290, 333, 334 kompetencija oocita, 186 Konvencionalna krioprezervacija oocita, 277, 278 Konvencionalna krioprezervacija humanog ovarijalnog tkiva, 277, 281 kortizol, 133, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 271 Krioprezervacija, 208, 272, 277 Krioprezervacija spermatozoida, 272 Krioprezervacija blastociste, 280 Krioprezervacija nezrelih oocita, 278 Krioprezervacija testikularnih spermatozoida, 197 Krioprotektanti, 273, 277, 283
N
NAD - nikotinamide adenine dinukleiotide, 265 NADP- - nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, 265 nepravilne embriogeneze, 379
L
Laparoskopija, 99, 155, 157, 158, 171 Leptin, 51,113,114,116,117,118,119, 260
O
OCP - oral contraceptive pill, 182 ODI - ovarijalni dehidrogenazni inhibitor, 270
Index
405
ODS -ovarijalni dehidrogenazni stimulus, 270 OHSS - ovarian hyperstimultion syndrome, 211, 233, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328 Oncosis, 200 Open pulled straws, 285 ortotopi~ne autotransplantacije, 281, 282 Osnove eti~kog pristupa, 382 Ovarijalni stromalni protok, 309
PTX3 pentraxin related gene, 304 Punkcija ascitesa, 324 PVC - polyvinyl chloride, 274 PVP - polyvinyl pyrolidone, 196, 216, 284 PZD - partial zona dissectio, 188
R
Razvojni arest embriona, 200 RBB - retinoblastoma binding gen, 241 RBM - RNK binding motif gen, 237, 241 RBMX - RNK binding motif X chromosome gen, 243 RBMY - RNK binding motif Y chromosome gen, 243 remodeliranje membrane, 189 retransplantacije tumorskih }elija, 287 rFSH - rekombinantni FSH, 186, 227, 228, 255, 309, 320 RI - resistance index, 260 Robert Edwards, 14, 177 ROC - reciever operator characteristic,123,260 ROS - reactive oxygen species, 166,196, 299 RPS4X - ribosomal protein S4 X chromosome gen, 244
P
Parametri normalne sperme, 162 Patrick Steptoe, 14, 177 PCOS - polycystic ovarian syndrome, 94, 119, 126, 153, 228, 233, 319, 328 PCR - polymerase chain reaction, 31,207,236 PCT - postkoitalni test, 131, 132, 166 PDGF - platelet derived growth factor, 39, 40, 368 PEG -polyethylene glycol, 284 Penetrak test -cervical mucus test, 166 perifolikularni vaskularitet, 254, 255,256,259 peritoneovensko premo{}avanje, 325 Perzistencija X gena na Y genu, 244 PESA - percutaneous sperm aspiration, 219 PETG - polyethylene terephtalate glycol, 274 PGD - preimplantation genetic diagnosis, 206, 207, 208, 209, 210, 305, 353, 355, 372 PGD - AS - preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening, 209 PI - pulsatility index, 260, 288 Pinopode, 185 Pleuralna punkcija, 323, 325 Pneumotoraks, 158 POF - premature ovarian failure, 302, 303, 304, 311 Poliploidni embrion, 198 Polivinil-alkohol, 367 Polscope, 372, 373, 375 poor response, 307 primena ES - embryonic stem celija, 380 Procena ovarijalne rezerve, 307 Proces starenja, 288 Progesteron, 54,56,57,58,79,80,82,83,88, 98,118,125,126,127,180,183,184,185,186, 211,212,251,252,259,260,261,262,263, 268,271, 328 Prolaktin, 100, 128, 129, 250, 251, 253 protokola stimulacije, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 214, 233, 308, 368
S
SCNT - somatic cell nuclear transfer blastocista, 381 SCSA - sperm chromatin structural assay, 166 Sertoly cell syndrom, 141, 196 SHBG - sex hormone binding globulin, 262 Sistemi obrade vode, 364 slow freezing, 277, 281 Sonohisterosalpingografija, 153, 162 SOX3 - sulfur oxidation 3 gen, 239, 241 SPA - sperm penetration assay, 166 spermatidi, 190, 195, 276, 218 spermatozoidi iz epididimisa, 217, 218 SRY - sex determining region Y chromosome gen, 239, 240, 241 Stem }elija, 25, 89, 90, 225, 376, 377, 378, 379, 380, 381 sticanje kompetentnosti, 301, 305 Stimulacija folikulogeneze, 178 subendometrijalni protok krvi, 260 Surogat majka, 315, 316, 382 susceptibilni hromozomi, 305 SUZI - subzonska inseminacija, 188 swim-up metode, 147, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 274, 357
406
T
TCM - traditional chinese medicine, 173 TDF testis determining factor, 340 TEFNA - testicular fine needle aspiration, 224, 225 TESE - testicular sperm extraction, 196, 219, 224, 225, 234 Te{ki oblik OHSS - ovarian hyperstimultion syndroma, 333 testikularni spermatozoidi, 195, 196, 197, 218, 219, 222, 272,274, 275, 276 TGF - transforming growth factor, 231, 253, 368 Torakocenteza, 326 Torzija ovarijuma, 321 transfer citoplazme, 293, 305 transfer jedra somatske }elije, 380, 381 Translokacije, 208, 220, 235, 329, 245, 246, 248, 249, 333, 335, 337, 338, 339 Transvaginalna punkcija folikula, 187 tranziciona pora permeabilnosti, 299 Trizomija 13 - Patauov sindrom, 289, 290 Trizomija 15, 289, 293 Trizomija 16, 290 Trizomija 18 - Edwardsov sindrom, 290 Tromboembolijske komplikacije, 322 Turner - ov sindrom, 243, 244, 333, 334 Tyrode rastvor, 204
V
vanished fetus, 331 Vaskularni flow index, 309, 310 VEGF - vascular endothelial growth factor, 40, 256, 257, 258, 259, 260, 300, 318, 319, 320, 325 Veresova kanila 156, 157, 158, 159, 160 VFI - vaskularnI indeks protoka, 152, 260 VI - vascularization index, 260 vitrifikacija, 273, 283, 285 Vitrifikacija blastociste, 286 Vitrifikacija embriona, 286 Vitrifikacija oocita, 283, 285 Vitrifikacija ovarijalnog tkiva, 287
X
X - Y homologija, 241
Y
YAC - yeast artifitial chromosome, 237
Z
Zamrzavanje embriona, 280 Zapremina jajnika, 308 ZFX - zink finger X chromosome gen, 243, 244 Zigot, 57, 64, 66, 197, 286, zink finger Y chromosome gen, 243 ZPTV - zona pellucida thickness, 205
U
ubikvitinske ligaze, 297 uklanjanje zone pelucide pronazom, 205 ultra~iste vode, 364, 365 Ultrazvu~na folikulometrija, 181, 214