Professional Documents
Culture Documents
Biotehnologija-
Biotehnologija-put ka svetlijoj budu}nosti
Biotechnology-way toward a brighter future
Biotechnologie- un chemin vers l’avenir plus lumineux
2008.
Biotehnologija-put ka svetlijoj budu}nosti
Biotechnology-way toward a brighter future
Biotechnologie- un chemin vers l’avenir plus lumineux
Rezime
Abstract
2
plants. Unfortunately,there is also dark side of biotechnology.Many ethical dilemmas are
opened.
Finally,in practical part of study,author presented PCR technique where amplification of
segment of DNA from the incompatibility gene of 3 plants was done.
Key words: Biotechnology,genetic engineering,PCR,RFLP,Southern blotting,DNA
sequencing,DNA chips,agriculture,lacteal acid bacteria,medicine,textile
industry,medicine,forensic science,evolution,bioremediation,ethics
Résumé
3
Uvod
1. Osnovne metode
Molekularno kloniranje
Molekularno
Molekularno kloniranje omogu}ava nau~nicima da dobiju vi{estruke kopije `eljenog
gena kao i kasnije ve}e koli~ine njegovog produkta. Zasnovano je na tehnici
rekombinovane DNK1 koja je sr` geneti~kog in`enjeringa. Nau~nici su stekli sposobnost
precizne integracije nizova DNK koje pripadaju razli~itim organizmima iste vrste ili ~ak
razli~itim biolo{kim vrstama.
Odvija se u 4 koraka:
1) Isecanje `eljenog fragmenta DNK iz molekula DNK donora pomo}u specifi~nih
enzima restrikcionih endonukleaza.
2) Spajanje dobijenog fragmenta DNK sa malim molekulom DNK koji ima sposobnost
replikacije (vektor za kloniranje). Hibridni molekul DNK, nastao spajanjem fragmenta
DNK sa vektorom (plazmid2 ili virusna DNK), naziva se rekombinovani molekul DNK.
Spajanje fragmenta DNK sa vektorom vr{i se pomo}u enzima DNK ligaze.
1
Rekombinovana DNK predstavlja molekul DNK ~iji se delovi, dobijeni iz razli~itih organizama, ve{ta~ki
spajaju.Neki geneti~ari umesto naziva rekombinovana DNK upotrebljavaju naziv himeri~na DNK po
gr~kom mitolo{kom monstrumu Himeri. Ve} vekovima Himera je smatrana simbolom nemogu}eg
biolo{kog jedinstva, kombinacijom delova tela razli~itih `ivotinja.
2
plazmid= cirkularni molekul DNK koji se nalazi u citoplazmi bakterijskih }elija, replicira se nezavisno od
hromozoma doma}ina.
4
3) Uno{enje rekombinovanog molekula DNK u }eliju doma}ina ~iji enzimi obezbe|uju
njegovu replikaciju.
4) Identifikacija }elija doma}ina u kojima se nalazi ispitivani fragment DNK i njegovo
izolovanje.
Izolovanje DNK
Restrikcioni enzimi
3
DNK palindromi-nizovi nukleotida u dvolan~anoj DNK koji su identi~ni kada se ~itaju u smeru 5’→ 3’
5
Na primer Eco RI prepoznaje slede}u sekvencu od 6 nukleotidnih parova:
5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
Do sada je u ~istom stanju izolovano nekoliko stotina razli~itih restrikcionih enzima.
Oni su dobili nazive po bakterijama iz kojih su izolovani (npr. Eco - izolovan iz E.
coli,...)
Neki restrikcioni enzimi seku dvolan~anu DNK tako da krajevi dobijenih fragmenata
ostaju ravni. Me|utim, ve}ina ovih enzima preseca 2 lanca na razmaku od 2 do 4
nukleotida, tako da krajevi dobijenih fragmenata ostaju jednolan~ani (“lepljivi krajevi”).
Ovakvi restrikcioni enzimi se koriste u geneti~kom in`enjeringu jer se 2 razli~ita
fragmenta DNK (donora i vektora) mogu lako spojiti pomo}u komplementarnih “lepljivih
krajeva”. Posle hibridizacije mogu}e je, pomo}u DNK ligaze, spojiti lance i dobiti
hibridni rekombinovani molekul DNK.
Naime, donorska DNK i vektorska DNK su najpre ise~ene pomo}u istog restrikcionog
enzima koji proizvodi lepljive krajeve, i onda pome{ane u test tubi da bi se lepljivi
krajevi donorske DNK sparili sa lepljivim krajevima vektorske DNK i obrazovali
rekombinantne DNK molekule. Zatim je dodata DNK ligaza koja stvara fosfodiestarske
veze (definitivno slepljuje krajeve).
Pojedini plazmidi osta}e nerekombinovani.
6
Gra|a plazmida
Sve bakterijske }elije kojima su ponu|eni plazmidi sa ugra|enim fragmentima DNK ne}e
biti transformisane. Prepoznavanje ili selekcija bakterija koje su transformisane vr{i se na
osnovu njihove rezistencije na antibiotik koju nosi gen ugra|enog plazmida.
Transformisane bakterije }e se razmno`avati i graditi kolonije na podlozi od agara u kojoj
je dodat odgovaraju}i antibiotik. One u koje nije u{ao plazmid bi}e ubijene jer nisu
rezistentne na odgovaraju}i antibiotik (nemaju gen za rezistentnost koji se nalazi na
plazmidu). Tako|e,u pojedine bakterije je u{ao nerekombinovani plazmid.Kolonije
bakterija sa nerekombinovanim plazmidom su plave jer proizvode funkcionalnu β-
galaktozidazu koja hidrolizuje X-gal u medijumu i daje plav prozivod. Kolonije sa
rekombinovanim plazmidom(koji je imao restrikciono mesto usred lacZ gena) ne
prozivode funkcionalnu β-galaktozidazu tako da }e kolonije biti bele.
7
Prilikom se~enja donorske DNK endonukleazom nastalo je na hiljade fragmenata koji su
ugra|eni u plazmide, ali samo neki plazmidi nose fragment sa genom od interesa. Da
bismo identifikovali koloniju sa tim genom,koristimo kao probu radioaktivnu
jednolan~anu DNK ili RNK koja je komplementarna tra`enom genu. Jedan broj }elija iz
svake bele kolonije posebno uzgajamo i denature{emo njihove DNK.Proba se hibridizuje
sa komplementarnom sekvencom(tra`eni gen) i obele`ava odgovaraju}e kolonije.
Prevazila`enje
Prevazila`enje problema funkcionisanja eukariotskog
eukariotskog gena u bakterijskom doma}inu
DNK biblioteka
Najva`niji cilj tehnologije rekombinovane DNK je da se klonira odre|eni genomski
fragment za koji je nau~nik zainteresovan.
Po{to geni predstavljaju veoma mali deo hromozoma jedini na~in da se izoluju
pojedina~ni geni jeste fragmentisanje celog genoma nekog organizma restrikcionim
enzimom. Dobija se veliki broj razli~itih fragmenata. Svaki od ovih fragmenata se
ugra|uje u vektor za kloniranje i tako se dobija “genomska biblioteka” odre|enih
organizama. Ovaj metod je nekad prikazivan kao “shotgun” (lova~ka pu{ka) kloniranje,
jer se umno`ava veliki broj fragmenata dok mo`da samo 1 od njih sadr`i `eljeni gen.
Zadatak je onda na}i taj odre|eni klon sa `eljenim genom. Tra`enje se obavlja pomo}u
probe, koja nalazi i markira tra`eni klon.
Postoje 2 vrste probi:
1) one koje prepoznaju DNK i
2) one koje prepoznaju protein
Postoji vi{e kriterijuma klasifikacije DNK biblioteka.
Prvi kriterijum je kori{}eni vektor za kloniranje.
Razli~iti vektori za kloniranje mogu da “nose” razli~ite koli~ine DNK, tako da odabir
vektora za biblioteku zavisi od veli~ine genoma ili drugog DNK uzorka ~ija se biblioteka
8
pravi. Plazmidi i fage su vektori koji nose male koli~ine DNK, kosmidi4 nose ve}e
koli~ine DNK dok BAC5-ovi i YAC6-ovi nose najve}e koli~ine DNK od navedenih.
Drugi kriterijum klasifikacije DNK biblioteka je prema izvoru DNK.
Veoma va`na odluka je da li praviti genomsku biblioteku (ime ka`e: sadr`i ceo genom
odre|enog organizma) ili cDNK biblioteku7(biblioteka koja sadr`i samo kodiraju}e
regione genoma i pre~i{}ena je od regulatornih sekvenci8 i introna, i time je znatno
manja od genomske biblioteke). Izbor izme|u genomske DNK i cDNK biblioteke zavisi
od namene.
Ako je konstruisanje biblioteke uvod u kloniranje celog genoma, onda }e biti potrebna
genomska biblioteka. Me|utim ukoliko je potreban specifi~ni gen, koji je aktivan u
specifi~nom tipu biljnog ili `ivotinjskog tkiva onda je logi~no napraviti cDNK biblioteku
iz tog uzorka.
PCR-
PCR-polymerase chain reaction
4
Kosmidi su vektori za kloniranje poput plazmida. Replikuju se autonomno sli~no plazmidima, s tim {to se
mogu spakovati in vitro u virusni omota~ ( sli~no DNK u λ fagu) i uneti u bakteriju infekcijom a ne
transformacijom.
5
BAC (Bacterial artificial chromosome). F plazmid izgra|en za ulogu kloniraju}eg vektora koji mo`e da
nosi velike inserte.
6
YAC(Yeast artificial chromosome)ve{ta~ki izgra|en vektor za kloniranje u kvascu.
7
cDNK ili komplementarna DNK je sintetisana DNK dobijena pomo}u mRNK(informaciona RNK) ,uz
dejstvo enzima RNK zavisne DNK polimeraze (reverzne transkriptaze) koji je izolovan iz retrovirusa.
Koriste}i mRNK kao kalup reverzna transkriptazasinteti{e jednolan~ani DNK molekul, koji se onda koristi
kao kalup za sintezu dvolan~anog DNK molekula.
8
regulatorni geni su geni koji imaju ulogu pokretanja i zaustavljanja transkripcije strukturnih gena.
9
prajmer je kratak oligonukleotidni lanac na ~iji 3’ kraj DNK polimeraza dodaje nukleotide u procesu
ekstenzije prajmera.
9
Jedan ciklus ~ine :
1) denaturacija DNK matrice
2) hibridizacija prajmera sa matricom
3) elongacija prajmera.
1) Denaturacija dvolan~ane
dvolan~ane DNK
10
3) Elongacija prajmera
Vreme trajanja elongacije prajmera zavisi od du`ine ciljne sekvence koju `elimo da
umno`imo, kao i od temperature na kojoj se izvodi korak elongacije. Posle vezivanja
prajmera enzim DNK-polimeraza katalizuje sintezu novih lanaca DNK dodaju}i
komplementarne nukleotide. Elongacija prajmera tj. ugradnja nukleotida na 3’ krajeve
prajmera se odvija na 720C i katalizovana je DNK- polimerazom. Broj DNK lanaca
udvostru~ava se posle svakog ciklusa. Broj ciklusa u PCR metodi se obi~no kre}e od 25
do 35.
Posle zavr{etka reakcija se obi~no analizira elektroforezom10 na gelu agaroze uz markere
poznate veli~ine tj. ispituje se da li du`ina nastalog PCR produkta odgovara predvi|enom
rastojanju izme|u prajmera.
Taq polimeraza
RFLP(restriction
RFLP fragment length polymorphisms) se zasniva na razlikama u
restrikcionim mestima na homolognim hromozomima ~ija je posledica i druga~ija
kombinacija fragmenata. Naime ukoliko je restrikciono mesto izmenjeno usled
mutacije,presecanja ne}e biti i fragment }e biti du`i.
10
Elektroforeza je metod za razdvajanje makromolekula po veli~ini,naelektrisanju ili nekim drugim
fizi~kim osobinama.Ve}i molekuli se sporije kre}u u elektri~nom polju usled zadr`avanja u matriksu gela.
Kako su nukleinske kiseline negativno naelektrisane,putuju ka anodi.
11
Slika 5. Southern blotting
Ovaj metod imitira sintezu DNK i proizvodi mno{tvo DNK lanaca koji su
komplementarni originalnom fragmentu. Svaki lanac }e po~eti sa istim prajmerom a
zavr{i}e se sa dideoksiribonukleotidom(formom nukleotida kojoj fail 3’-OH grupa tako
da se sinteza prekida).
Dideoksi metod zavr{etka lanca se odvija u 4 faze:
11
Pri hibridizaciji DNK proba hibridizuje sa komplementaranom RNK sekvencom.
12
Najzahtevnije mapiranje je svakako bilo sekvenciranje humanog genoma(Human Genome Project) koje
je trajalo od 1990. do 2003. godine.
12
1)fragment DNK koji sekvenciramo je denaturisan i inkubiran sa sastojcima neophodnim
za DNK sintezu: prajmerom, DNK polimerazom, 4 vrste deoksiribonukleotida i 4 vrste
dideoksiribonukleotida(svaki obele`en posebnim fluorescentnim molekulom).
2) Sinteza svakog novog lanca po~inje na 3’ kraju prajmera i nastavlja se dok slu~ajno
nije uba~en dideoksiribonukleotid umesto ekvivalentnog deoksiribonukleotida.
Elongacija se tu zavr{ava.Dobija se mno{tvo obele`enih DNK lanaca razli~itih du`ina sa
obojenim poslednjim nukleotidom.
3)Obele`eni lanci u sme{i se razdvajaju na poliakrilamidnom gelu u kapilarnoj tubi.Kra}i
lanci se kre}u br`e. Detektor bele`i fluorescentnu boju na lancima koji se kre}u. Lanci
koji se razlikuju po jednom nukleotidu u du`ini mogu se detektovati prilikom
~itanja.Rezultati su od{tampani a sekvenca komplementarna kalupnom lancu se ~ita
odozdo ka gore.
13
Analiza ekspresije gena DNK ~ipom
14
2. Primena biotehnologije
Poljoprivreda
Smart plants(pametne
plants biljke)
Genetski modifikovane “pametne biljke” obave{tavaju poljoprivrednika kada }e da
nastupi deficijencija odre|enog minerala ali PRE o{te}enja.Time se smanjuje upotreba
|ubriva.
Jedan tip ovih biljaka koristi promoter koji br`e vezuje RNK polimerazu(koja vr{i
transkripciju) kada koncentracija fosfora u biljnom tkivu po~ne da opada.Ovaj promoter
je povezan sa genom reporterom koji dovodi do proizvodnje plavog pigmenta tako da kad
li{}e po~ne da poprima plavu boju,farmer zna da je vreme da doda fosfatno |ubrivo.
13
vi{e o negativnim posledicama upotrebe GM hrane u odeljku o eti~kim dilemama
15
Slika 9. Upozorenje “pametne biljke” na deficijenciju fosfora
Slika 10. Levo: Genetski modifikovan pamuk otporan na insekte (levo) u pore|enju sa neza{ti}enim
pamukom (desno).
Desno: Transgena biljka duvana koja ispoljava gen za svetlost kod svica
16
Industrija
Proizvodnja piva Pivo je slabo alkoholno piće, koje se proizvodi u procesu alkoholnog
vrenja iz slada, hmelja, vode i pivskog kvasca. Pivski slad se dobija od žitarica, najčešće
od ječma i daje pivu sastojke od kojih zavisi punoća ukusa i koncentracija osnovnog
ekstrakta piva. Hmelj služi za konzervaciju piva i daje mu prijatan karakterističan miris i
gorak ukus, dok pivski kvasac izaziva alkoholno vrenje u kome šećer prelazi u etanol i
ugljen dioksid.
Proizvodnja vina. Vino je alkoholno pi}e koje se dobija naj~e{}e fermentacijom gro`|a
ili gro`|anog soka(mo`e se koristiti i drugo vo}e) uz pomo} kvasca.Prirodni balans
gro`|a je takav da mo`e da izazove vrenje bez ikakvog dodavanja {e}era,kiselina,enzima
i drugih supstanci koje izazivaju fermentaciju. Vino nastaje tako {to se gro`|e gnje~i i
dobija sok-{ira.U osnovi proizvodnje je proces fermentacije tokom kojeg pod uticajem
kvasca dolazi do razlaganja {e}era do etanola,pri ~emu se osloba|a ugljen-dioksid.
Proces vrenja traje vi{e nedelja, nakon ~ega se vino preta~e u ba~ve. Gro`|e sadr`i i
tanine koji su prirodni konzervansi i omogu}avaju starenje vina.
Lakti~ne bakterije (LAB). Lakti~ne bakterije(odnosno bakterije mle~ne kiseline) su
bakterije ~ije je osnovno svojstvo da obavljaju razgradnju ugljenih hidrata do mle~ne
kiseline14.Prirodna nalazi{ta LAB-a su:
1)Na biljkama(u manjem broju zbog prisustva kiseonika)
2)Kod ljudi i ostalih sisara na sluzoko`i usne duplje,gastrointestinalnog
trakta,vagine,mle~nim kanalima dojki.
3)U mednom `eludcu p~ela.Smatra se da asepti~ka svojstva meda omogu}avaju upravo
lakti~ne bakterije prisutne u `eludcu p~ela.
Danas se gaje u laboratorijama i one i njihovi produkti koriste u proizvodnji hrane i
pi}a. Fermentacijom laktoze i drugih ugljenih hidrata proizvode mle~nun kiselinu koja
doprinosi osve`avaju}em kiselom ukusu mle~nih proizvoda i inhibira rast patogenih i
saprofitnih mikroorganizama,a kod prozivodnje sira je va`na tokom koagulacije.
Probiotske lakti~ne bakterije proizvode biolo{ki aktivne supstance koje imaju pozitivan
efekat na zdravlje ljudi. One pru`aju mogu}nost da se putem ishrane vr{i stabilizacija
flore intestinalnog trakta,pobolj{ano usvajanje laktoze,sni`enje nivoa holesterola u
krvi,smanjenje nadutosti,za{tita od infekcija i stvaranja kancera debelog creva.
Bakteriocini su specifi~ni produkti metabolizma bakterija koji imaju antibakterijska
svojstva prema drugim vrstama bakterija. U novijim istra`ivanjima dobijeni su produkti
lakti~nih bakterija koji imaju antimikrobno dejstvo na
Staphylococcus,Enterococcus,Salmonella,Pseudomonas,Escherichia coli,Shigella itd
Klini~kim ispitivanjem dobijeni su dobri rezultati u saniranju te{kih infekcija i upale
ko`e.
14
Jedna od metoda identifikacije bakterija se upravo zasniva na ispitivanju fermentativnih sposobnosti
bakterija. API(Analytical Profile Index) koristi galeriju od 50 osu{enih {e}era na koje deluju(ili ne deluju)
dodate suspenzije bakterijske kulture. Rezultati se porede sa standardnim tablicama odakle se o~itava vrsta
iz bakterijske suspenzije.
17
Biogoriva(biofuels)
Biogoriva su goriva koja poti~u od mrtvih organizama.
U te svrhe se naj~e{}e gaje biljke: {e}erna repa,{e}erna trska,kukuruz,itd iz kojih se
proizvodi etanol koji se prodaje kao gorivo.Za razliku od fosilnih goriva koja neprestano
podi`u temperature na Zemlji osloba|aju}i nove koli~ine ugljenika,ugljenik u biogorivu
poti~e iz atmosfere tj biljke su ga ugradile tokom rasta.
Kukuruz se melje,me{a sa vodom i zagreva.Dodaju se enzimi koji skrob pretvaraju u
{e}er.U kazanu za fermentaciju kvasac pretvara {e}er u alkohol koji se destilacijom
odvaja od vode.
Biodizel.
Biodizel. Hemijskom modifikacijom biljnih ulja dobija se biodizel iz
soje,suncokreta,uljane repice.. Fabrika “Viktorija oil” AD [id za sada je jedini
proizvo|a~ biodizela u Srbiji.
Nastoji se i boljem iskori{}avanju bakterija za proizvodnju biogasa.
Tekstilna industrija
18
Slika 13. Farmerke
Medicina
Dijagnostikovanje bolesti.
bolesti. DNK tehnologija je omogu}ila stvaranje testova za
detektovanje nosilaca recesivno naslednih bolesti kao i individua pogo|enih naslednom
bole{}u.
Anemija srpastih }elija poga|a uglavnom Amerikance afri~kog porekla. Nastaje usled
promene gena za beta globin gde je valin zamenio glutaminsku kiselinu {to menja
konformaciju beta lanca. Izmenjeni molekuli hemoglobina interaguju jedni sa
drugim,povezuju se i grade stapi}astu strukturu koja deformi{e eritrocit u srpast oblik.
Mogu se javiti slabost,bol,o{te}enje organa.Potrebne su transfuzije krvi. Abnormalan gen
se detektuje Southern Blotting-om.
Usled mutacije,restrikciono mesto za enzim MstII je uni{teno,tako da kod normalnog
gena dobijamo 2 trake veli~ina 1.1kb i 0.2kb a kod gena za srpastu anemiju jednu traku
veli~ine 1.3kb.
19
Slika 14. Detekcija gena za srpastu anemiju Southern botting-om.
Han
Hantingtonova bolest(HB)
bolest(HB) je dominantno nasledni neurodegenerativni porem}aj. Na
kratkom kraku hromozoma 4 nalazi se gen za hantingtin. Gen sadr`i triplet nukleotida
CAG koji se ponavlja. Ako imate ispod 26 ponovaka,bi}ete dobro.Ako imate 39
ponovaka,demencija }e vas sti}i u sedamdeset petoj a prve simptome }ete osetiti u
{ezdeset {estoj.Ako imate 50 ponovaka,pamet }ete izgubiti u dvadeset sedmoj godini
`ivota. Pogor{anje po~inje blagim popu{tanjem intelektualnih sposobnosti,nevoljnim
20
pokretima mi{i}a i ide do duboke depresije,povremenih halucinacija i uobra`enja. Skala
je ovakva: da su va{i hromozomi dovoljno duga~ki da se protegnu oko ekvatora,razlika
izme|u zdravlja i ludila bila bi manja od jednog in~a. Bolest je neizle~iva, a njen tok traje
izme|u 15 i 25 u`asnih godina.
Najjednostavniji na~in dijagnostikovanja HB-a je amplifikacija regiona koji sadr`i
ponovke,i procena broja CAG ponovaka na osnovu du`ine PCR produkata. Za
dijagnostiku se mo`e koristiti periferna krv. Za prenatalnu dijagnostiku DNK iz }elija
amnionske te~nosti ili horionskih ~upica.
Di{enova mi{i}na distrofija.
distrofija. Di{enova mi{i}na distrofija je fatalna X- vezana recesivna
bolest. Fenotip je odumiranje mi{i}a. Prvi znaci su geganje,ote`ano penjanje uz
stepenice, i sklonost ka lakom saplitanju. Oko desete godine oboleli obi~no vi{e ne mo`e
da hoda i mora da koristi invalidska kolica. Bolest napreduje, bolesnik postaje vezan za
krevet i naj~e{}e umire pre dvadesete godine.
Mutacije u genu za distrofin(naj~e{}e delecije) mogu biti detektovane pomo}u multiplex
PCR-a(amplifikuje se 9 razli~itih regiona gena,pokriva 80% slu~ajeva). Za detaljniju
analizu koristi se Southern blotting.
Hemofilija.
Hemofilija. Od bolesti koje se prenose genom na X hromozomu prvo je otkrivena
hemofilija. Hemofilija nastaje usled nedostatka fibrina, {to dovodi do poreme}aja u
procesu zgru{avanja krvi. Bolest kontroli{u 2 vezana gena na X hromozomu, koji
reguli{u sintezu razli~itih faktora zgru{avanja. Hemofilija tipa A je izazvana nedostatkom
antihemofilnog globulina (AHG), dok je hemofilija tipa B rezultat nedostatka
tromboplastina. Oko 80% svih pacijenata sa ovom bole{}u imaju hemofiliju tipa A koja
se le~i davanjem AHG u transfuziji.
Hemofilija A je izazvana re|e delecijom a u najve}em broju slu~ajeva inverzijom. Za
detekciju se koristi Southern blotting koji otkriva inverzije i PCR za delecije.
Za detekciju hemofilije B se koristi PCR.
Cisti~na fibroza (CF) je autosomno recesivni poreme}aj. Normalni alel kodira
membranski protein koji funkcioni{e u transportu hlora izme|u odre|enih }elija i
van}elijske te~nosti. Ovi transportni kanali su odsutni ili nefunkcionalni kod dece koja su
nasledila oba defektna alela. Posledica je visoka koncentracija hlora u van}elijskoj
te~nosti, zatim lepljiva,jaka sluz koja se nagomilava u plu}ima,crevima,poreme}ena
funkcija pankreasa. Apsorpcija hranljivih materija u crevima je slaba,~est je
bronhitis,imunitet je znatno oslabljen. Ako se simptomi ne le~e,ova deca umiru do petog
ro|endana.Antibiotici,masa`a koja poma`e ~i{}enju sluzi mogu znatno produ`iti `ivot.
Delecija defektnog gena koji se nalazi na hromozomu 7 se mo`e detektovati PCR-om.
Slika 15. Analiza porodice obolelog od cisti~ne fibroze:otac heterozigot,oboleli sin,}erka heterozigot i
majka-heterozigot
21
Detekcija HIV-
HIV-a.
Farmaceutski produkti.
produkti. Pre razvi}a DNK tehnologije insulin koji se koristi u tretiranju
dijabetesa je dobijan iz pankreasa svinja. Morao je da bude pa`ljivo pre~i{}en,ali je i
pored toga ponekad izazivao alergijske reakcije kod pacijenata. Danas se koriste
mikroorganizmi za sintezu insulina iz humanog insulinskog gena. Gen se ubacuje u
bakterije u izmenjenoj formi,bez introna. Produkt je ~istiji,manja je verovatno}a biolo{ke
kontaminacije. U pro{losti kori{}enje hormona
hormona rasta iz le{eva je bilo povezano sa
Creutzfeldt-Jakob-ovom bole{}u16,a HIV se prenosio tretiranjem hemofilije
kontaminiranim faktorom VIII.
Protein Bolest
22
efekte vezane za infekciju. Mana upotrebe retrovirusa u genskoj terapiji je {to je mogu}e
ugraditi samo malu DNK sekvencu-manju od 7kb. Modifikovan virus ugra|uje svoj
genom u genom }elija doma}ina koje su gajene i prenosi mu zdravu verziju gena.
Promenjene }elije su vra}ene u organizam pacijenta.
Slika 16. Genska terapija A-le~enje dece sa SCID-om B-le~enje cisti~ne fibroze
1990. Anderson i Blez su le~ili trogodi{nju devoj~icu A{anti De Silvu od retke nasledne
bolesti SCID-a. Jaka kombinovana imunolo{ka deficijencija (SCID) je ~inila decu
nesposobnom da se imunolo{ki odbrane od infekcije, a uzrok je bila brza smrt belih
krvnih }elija. Takva deca su ~esto oboljevala i rano umirala. Bolest je uzrokovana
gre{kom u jednom genu na hromozomu 20, koji se zove ADA gen. Anderson i Blez su
uzeli bele krvne }elije iz krvi obolele devoj~ice , inficirali ih retrovirusima sa ADA
genom i vratili transfuzijom natrag u devoj~icino telo. Genska terapija je radila. Broj
devoj~icinih belih krvnih }elija se utrostru~io, njeni imunoglobulini su porasli i ona je
po~ela da proizvodi skoro ~etvrtinu one koli~ine ADA proteina koju proizvodi prose~na
osoba. Iako je nije skroz izle~ila, jer je devoj~ica i dalje primala PEG-ADA terapiju
(uno{enje gotovog ADA proteina u krv, proizvoda ekvivalentnog gena gove~eta), genska
terapija je pomogla. Ova procedura nije bila kraj le~enja,jer genetski modifikovana bela
krvna zrnca funkcioni{u nekoliko meseci,nakon ~ega se terapija mora ponoviti. I druge
23
bolesti }e se uskoro pridru`iti kombinovanoj imunolo{koj deficijenciji i le~iti genskom
terapijom.
Da bi efekti genske terapije bili trajni, }elije koje su primile normalni alel moraju da se
dele u toku `ivota pacijenta. Zato su }elije ko{tane sr`i,koje uklju~uju i stem }elije
primarni kandidati.
24
Radi se i na preobra`avanju }elija ko{tane sr`i u spermatozoide {to bi moglo omogu}iti
lezbejskim parovima da imaju decu18.
Forenzika
Analiza biolo{kih materijala sa mesta zlo~ina koji sadr`e DNK mo`e identifikovati
po~inioca sa ve}om sigurno{}u.DNK sekvenca svake osobe je jedinstvena(osim kod
jednojaj~anih blizanaca19).
DNK fingerprinting je tehnika razlikovanja individua iste vrste na osnovu DNK. Koriste
se VNTR(Variable Number Tandem Repeats) sekvence koje su visoko varijabilne u broju
ponavljanja u bloku.
Blokovi se mogu amplifikovati PCR-om i zatim porediti. CODIS je baza podataka koju
koristi FBI i zasnovana je na 13 razli~itih VNTR sekvenci.[ansa da dva ~oveka imaju isti
raspored traka,tj. da im se poklapaju du`ine blokova kod svakog VNTR-a je veoma mala.
Slika 18. Levo: Varijacija du`ine VTNR alela kod 6 osoba Desno:{ematski prikaz VNTR-a u 4 alela
Pre PCR-a tehnika RFLP-a se koristila za analizu VNTR blokova.Me|utim ova tehnika je
znatno sporija i potrebna je ve}a koli~ina DNK.
Slika 19. Analiza slu~aja ubistva. Na ode}i osumnji~enog je prona|ena krv koja pripada `rtvi,{to se vidi po
poklapanju rasporeda traka.
18
Nemogu}nost razvi}a normalnog embriona fuzionisanjem 2 jajne }elije ili 2 spermatozoida nastaje zbog
genomskog imprintinga.Spermatozoid i jajna }elija imaju razli~itu kombinaciju aktivnih i neaktivnih gena.
Za normalno razvi}e ponekad je potrebna samo jedna aktivna verzija a spajanjem 2 jajne }elije mogu se
dobiti npr. 2 aktivne verzije,a spajanjem 2 spermatozoida 0.
19
Pronalaze se na~ini za razlikovanje jednojaj~anih blizanaca-na osnovu bolovanja od razli~itih bolesti {to
dovodi do prisustva razli~itih antitela,zatim ugradnje latentne virusne DNK na razli~itim mestima u
genomu,kao i razli~itim mutacijama u mitohondrijalnoj DNK..
25
DNK fingerprinting se koristi i u dokazivanju o~instva(i materinstva). Poredi se DNK
majke,deteta i potencijalnog oca. Dete nasle|uje pola genetskog materijala od majke,a
pola od oca. Tako|e, mitohondrijalna DNK20 se mo`e koristiti za pra}enje `enskih
predaka, a Y hromozom za pra}enje mu{kih.
Bioinformatika
Slika 20. Upore|ivanje DNK sekvenci 2 vrste koje su nastale akumuliranjem mutacija i koje poti~u od
zajedni~kog pretka
20
Nasle|uje se uvek od majke
26
O~uvanje `ivotne sredine
Bioremedijacija predstavlja kori{}enje organizama za otklanjanje zaga|uju}ih supstanci
iz zemlji{ta,vode i vazduha. Na primer bakterije i archaea razla`u organsku materiju iz
kanalizacije ,stvaraju}i material koji se mo`e nakon hemijske sterilizacije koristiti za
popunjavanje zemlji{ta i proizvodnju |ubriva.
Druge primene bioremedijacije su razlaganje radioaktivnog otpada i ~i{}enje naftnih
mrlja. U rudarstvu prokarioti se koriste za ekstrakciju metala iz ruda.
Slika 21. Radnik prska |ubrivom zemlji{te zaga|eno naftom.\ubrivo stimuli{e rast bakterija koje }e
razlagati naftu.
27
Evolucija
28
I pored brojnih pozitivnih strana testiranja nosilaca i genske terapije,postoji i mra~na
strana. Kod genske terapije je potreban poseban oprez,da se gen ne bi ubacio na
pogre{nom mestu i blokirao funkcionisanje drugog gena,ili poremetio neki regulator {to
mo`e dovesti do raka. Eliminisanjem recesivnih alela, i dizajniranjem genoma
elimini{emo prirodnu raznovrsnost. U slu~aju anemije srpastih }elija,heterozigoti su
delimi~no za{ti}eni od najopasnijeg oblika malarije {to je doprinelo visokoj frekvenciji
alela. Neki geni pod jednim uslovima su {tetni,a pod druga~ijim korisni. Dalje,pitanje je
ko ima pravo da zna na{u genetsku osnovu?Da li }e osiguravaju}e kompanije i
poslodavci obele`avati nosioce ili one kod kojih simptomi bolesti tek treba da se razviju?
Problemi prenatalne dijagnostike su da li recimo dopustiti abortus zdravog deteta paru
koji boluje od nasledne bolesti,ali `eli da odr`i trudno}u samo ukoliko `ena nosi obolelo
dete?Ma koliko ~udno zvu~alo,primer mo`e biti ahondroplazija22,ili nasledna gluvo}a.
Rano dijagnostikovanje mo`e ponekad pomo}i u le~enju,kao kod
hiperholesterolemije,fenilketonurije23,celijakije24. Testiraju}i sebe,podnosilac zahteva
testira i porodicu. Pitanje je da li je ponekad bolje za pacijenta da ne zna istinu.Recimo u
slu~aju Hantingtonove bolesti,da li re}i ~oveku da }e oboleti od bolesti, kad ima jo{
nekoliko godina normalnog `ivota dok ne po~nu simptomi i progresivno ludilo?
[to se ti~e biogoriva, upotreba kukuruza,soje i drugih poljoprivrednih kultura za
proizvodnju etanola i biodizela je dovela do skoka cena ovih namirnica. Da li je moralno
tro{iti hranu na proizvodnju biogoriva kada u pojedinim mestima vlada glad? Tra`e se
alternativna re{enja(proizvodnja goriva pomo}u otpada,algi,bakterija).
Tako|e farmeri kr~e {ume ne bi li pove}ali obradivo zemlji{te {to negativno uti~e na
klimu i biodiverzitet.
Brojne su eti~ke debate vezane za stem }elije. Za istra`ivanje embrionalnih stem }elija
potrebna je destrukcija embriona. Me|utim potencijalna korist je velika.Nau~nici tra`e
na~in da navedu }eliju da se diferencira u potrebne specijalizovane }elije ~ime bi se le~ila
povreda mozga,ki~mene mo`dine,srca. 1997. Britanski geneti~ar Ian Wilmut i kolege su
najavile ro|enje jagnjeta Dolly- prvog sisara koji je kloniran iz telesne }elije adulta. Da li
je kloniranje ljudi eti~no? Kao slobodna individua vi posedujete svoj genom i nijedna
vlada ga ne mo`e nacionalizovati i nijedna kompanija kupiti ali da li vam to daje za pravo
da ga nametnete drugoj individui?Klon je druga individua.Ovca Dolly je umrla pre
vremena od bolesti plu}a.Jedni ka`u da to nema veze sa tim {to je klon. Drugi veruju da
su telomere25 ve} bile skra}ene,ona se “rodila stara” jer je klon starije ovce.
22
Patuljasti rast
23
U ishrani se koriste namirnice sa smanjenom koli~inom fenilalanina.
24
U ishrani se koristi hrana bez glutena.
25
Telomera je region repetitivne DNK na kraju hromozoma.Ona {titi gene,a tokom sukcesivnih deoba se
smanjuje.Nau~nici veruju da skra}enje telomera ima udela u starenju.
29
Slika 24.Ian Wilmut i Dolly
Ovo su samo neke od eti~kih dilema koje se neminovno pojavljuju kod primene
biotehnologije.
U nastavku rada bi}e prakti~no prezentovana PCR metoda kao i jedna od mnogobrojnih
njenih primena. Ura|ena je amplifikacija segmenta DNK (dela gena za gametofitnu
inkompatibilnost26) , kod 3 biljke , pomo}u specifi~nih prajmera.
Realizaciju je omogu}io Institut za molekularnu genetiku i geneti~ko in`enjerstvo27
(IMGGI) u Beogradu.
26
U nekim familijama biljaka tokom evolucije javila se sposobnost da se onemogu}i samooplodnja, koja
umanjuje geneti~ku raznovrsnost vrste. Tu sposobnost kontroli{u geni tzv. S-lokusa (odnosno njihovi aleli)
a prepoznavanje i odbacivanje sopstvenog polena se odigrava na nivou gametofitne generacije. Ti aleli
imaju veoma razli~itu sekvencu i du`inu, od jedinke do jedinke, tako da se S-lokus smatra za jedan od
najpolimorfnijih u prirodi.
27
[arac-Sto{i} J.:Amplification of specific sequence of DNA by PCR method, Republi~ka smotra mladih
talenata, Kladovo, 2003.
30
Materijal i metode rada:
Cilj rada:
1) Utvr|ivanje postojanja specifi~nih mesta vezivanja prajmera B i C za gen za
inkompatibilnost kod izabranih uzoraka biljaka.
2) Odre|ivanje du`ine amplifikovanog dela genoma.
Uzorci:
DNK iz 3 biljke iste vrste -Prunus tenella (stepski badem), obele`ene kao R1, R2, R3
31
TAE28 puferom. Kada se gel ohladio i postao `elatinast, u prethodno napravljena
udubljenja je sipan uzorak koji je, nakon {to je izva|en iz thermocycler-a , pome{an sa
bojom. Nakon {to je obojeni uzorak sipan u rupice u gelu, kadica sa gelom i puferom je
zatvorena , ure|aj je uklju~en i pristupilo se elektroforezi. Posle 30 minuta gel sa
uzorcima, koji su se u me|uvremenu udaljili od po~etnog polo`aja u zavisnosti od
veli~ine DNK molekula, je pregledan u mra~noj sobi pod UV svetlom. Zatim je CCD
kamerom fotografisan i rezultati su od{tampani ( sl.3. )[9].
28
TRIS-acetat-EDTA(TAE) pufer
32
Slika 3. Agarozna gel elektroforeza produkata PCR amplifikacije dela genoma uzoraka R1, R2 i R3
Zaklju~ak
Acknowledgment:
Special thanks to my family, friends and all my teachers for support and guidance
through the beautiful world of science. Special thanks to Marc Anderson who
demanded from me to do my best., and Sacha Martin :) ..qui a corrigé mon résumé en
français.
Literatura:
1)[arac-Sto{i} J.:Amplification of specific sequence of DNA by PCR method, Republi~ka smotra mladih
talenata, Kladovo, 2003.
2)[arac-Sto{i} J: Sex determination in human fetuses by PCR method, Republi~ka smotra mladih
talenata,Kladovo, 2004.
3)[arac-Sto{i} J: Lacteal Acid Bacteria (LAB) and their importance in nature, Republi~ka smotra mladih
talenata, Kladovo,2002.
4)[arac-Sto{i} J: Viruses,Republi~ka smotra mladih talenata,Kladovo, 2001.
5)[arac-Sto{i} J: Genetika I, Beograd,2005.
6)Campbell N.,Reece J.:Biology,7th ed, 2005.Pearson Education: Benjamin Cummings
7) Griffiths A. J. F., Miller J. H., Suzuki D. T., Lewontin R. C., Gelbart W. M.: An introduction to genetic
analysis,7th ed. New York,2000.,W. H. Freeman and Company
8)Tuci} N: Evolucija, ~ovek i dru{tvo. Beograd,1999.,Dosije, Alternativna akademska obrazovna mre`a.
9)Mueller R. F., Young I. D.: Emery’s elements of medical genetics.Churchill Livingstone 2001.
10)Ridli M.: Genom: Autobiografija vrste u 23 poglavlja. Beograd,2001.,Plato.
11)Romac S., Vukosavi} S., Stojkovi} O., ^uljkovi} B.: PCR u klini~koj dijagnostici. Beograd: Biolo{ki
fakultet 1999., PCR Centar.
12)Voet D.,Voet J.: Biochemistry,3rd ed.,USA 2004.,John Wiley&sons,inc.
13) Thibodeau A.G.,Patton T.P:Anatomy&Physiology,5th ed,2003.,Mosby
14) Mihailovi} M. B.: Biohemija, IV izdanje. Beograd,2000.,Nau~na.
15)D`. K. Born jr, National Geographic-Serbian ed., 10(2007)35
Tel +381644743419
33