P. 1
Biotehnologija

Biotehnologija

4.4

|Views: 4,649|Likes:
Published by Andrej Sarac

More info:

Published by: Andrej Sarac on Jul 22, 2008
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

06/07/2013

pdf

text

original

[ESTA BEOGRADSKA GIMNAZIJA

Autor: [arac Sa{a

BiotehnologijaBiotehnologija-put ka svetlijoj budu}nosti
Biotechnology-way toward a brighter future Biotechnologie- un chemin vers l’avenir plus lumineux

2008.

Biotechnology-way toward a brighter future Biotechnologie- un chemin vers l’avenir plus lumineux
Rezime Biotehnologija ima {iroku primenu. Vekovima su metaboli~ke aktivnosti mikroorganizama kori{}ene u proizvodnji piva,vina i mle~nih proizvoda. Poslednjih godina,biotehnologija ubrzano evoluira,naro~ito sa novim metodama DNK analize,i boljim razumevanjem na{eg genoma,nakon Projekta Humanog Genoma. Genetski in`enjering nam omogu}ava da preme{tamo gene izme|u vrsta tako da mo`emo da dobijemo otporne biljke, biljke ve}e nutritivne vrednosti kao i pametne biljke koje upozoravaju farmera da je vreme da doda |ubrivo. Nau~nici koriste bakterije ili ovce u proizvodnji deficijentnih humanih proteina(hormon rasta,insulin itd.)u velikim koli~inama. U genskoj terapiji normalna verzija gena se ubacuje u genom pacijenta koji sadr`i nefunkcionalan gen,{to bi moglo pru`iti mogu}nost potpunog izle~enja od pojedinih naslednih poreme}aja.Policija pomo}u DNK analize re{ava slu~ajeve ubistva i silovanja.Test za o~instvo je tako|e od velikog zna~aja na sudu. Pore|enje genoma razli~itih vrsta daje nam nove informacije o evoluciji. Razli~iti organizmi se koriste i u ~i{}enju `ivotne sredine(od nafte,radioaktivnih metala itd.) Biljke se koriste u proizvodnji biogoriva. Na`alost,postoji i mra~na strana biotehnologije.Nastale su brojne eti~ke dileme. Najzad,u prakti~nom delu rada autor je detaljnije predstavio PCR metodu gde je ura|ena amplifikacija dela gena za inkompatibilnost kod 3 biljke. Klju~ne re~i: Biotehnologija,genetski in`enjering,PCR,RFLP,Southern blotting,DNK sekvenciranje,DNK ~ipovi,poljoprivreda,lakti~ne bakterije,tekstilna industrija,medicina,forenzika,evolucija,bioremedijacija,etika Abstract Biotechnology has many applications. Metabolic activities of some microorganisms were used for centuries for production of beer,wine and dairy products.Recent years biotechnology is rapidly evolving,especially with development of new methods for DNA analysis,and better understanding of our genome,after Human Genome Project. Genetic engineering enables us to transfer genes between different species so that we can create resistant crops,crops with higher nutritional value or smart plants that “tell” farmer when it’s time to add fertilizer.Scientists use bacteria or sheeps for production of deficient human proteins(human growth hormone,insulin etc) in high quantities.In gene therapy one can insert normal version of nonfunctional gene into genome of patient and permanently cure some genetic disorders. Police use DNA analysis in solving murder or rape cases. DNA paternity testing can be used in court. Comparing genomes of different spieces has great impact on study of evolution, revealing new facts. People use organisms for environmental clean-up(oil spills,radioactive metals etc).Biofuels are produced from

Biotehnologija-put ka svetlijoj budu}nosti

2

plants. Unfortunately,there is also dark side of biotechnology.Many ethical dilemmas are opened. Finally,in practical part of study,author presented PCR technique where amplification of segment of DNA from the incompatibility gene of 3 plants was done. Key words: Biotechnology,genetic engineering,PCR,RFLP,Southern blotting,DNA sequencing,DNA chips,agriculture,lacteal acid bacteria,medicine,textile industry,medicine,forensic science,evolution,bioremediation,ethics
Résumé La biotechnologie a de nombreuses applications. Les activités métaboliques de certains microorganismes ont été utilisés pendant des siècles pour la production de bières, de vins et des produits laitiers. Depuis quelques années les biotechnologies évoluent rapidement, particulièrement avec le développement de nouvelles méthodes concernant l'analyse de l'A.D.N., et une meilleure compréhension de notre génome, grâce au Projet du Génome Humain. Le génie génétique nous permet de transférer des gènes entre des espèces différentes pour créer des cultures résistantes, des cultures ayant une plus forte valeur nutritionnelle, ou des plantes qui signalent aux agriculteurs quand il est temps d'ajouter des engrais. Les scientifiques utilisent des bactéries ou des animaux (moutons) pour la production de protéines humainement compatibles lorsqu'elles sont insuffisantes chez l'homme(hormones de croissance, insuline, etc...) en fortes quantités. Grâce à la thérapie génie il est possible d'insérer une version saine du gène au patient qui possède un génome non fonctionnel de façon permanente et guérir ainsi certaines maladies génétiques. D'autre part la police utilise l'analyse de l'A.D.N. pour résoudre des meurtres et des viols. Les tests de paternité sont utilisés au tribunal. La comparaison des génomes des différentes espèces a une grande influence sur l'étude de l'évolution, révélant des faits nouveaux. Les gens utilisent certains organismes pour nettoyer l'environnement (les déversements de pétrole, les métaux radioactifs, etc...) Les biocarburants sont produits par les plantes. Malheureusement, il y a aussi côté obscur de la biotechnologie. De Nombreux dilemmes éthiques sont ouverts. Enfin, dans le cadre de la pratique de l'étude, l'auteur présente ici la technique P.C.R., ou l'amplification du segment de l'A.D.N. du gène d'incompatibilité de 3 plantes.

Mots-clés: la biotechnologie, le génie génétique, P.C.R., R.F.L.P.,Southern blot, séquençage de l'A.D.N., des puces à l'A.D.N., l'agriculture, acides lactéaux bactériens, médecine, industrie textile, médecine légale, évolution, biorestauration, éthique

3

Uvod
Biotehnologija predstavlja primenu biolo{kih aktivnosti za dobijanje ili modifikovanje korisnih proizvoda i procesa. Praktikovana je vekovima u prozivodnji piva, vina,sira i drugih namirnica kao i prilikom oplemenjivanja biljaka i `ivotinja gde se dugo oslanjala na prirodne mutacije i rekombinacije. Za razliku od tradicionalne,moderna biotehnologija je zasnovana na manipulaciji DNK gde nau~nici modifikuju odre|ene gene i ubacuju ih u razli~ite organizme.

1. Osnovne metode

Molekularno kloniranje

Molekularno Molekularno kloniranje omogu}ava nau~nicima da dobiju vi{estruke kopije `eljenog gena kao i kasnije ve}e koli~ine njegovog produkta. Zasnovano je na tehnici rekombinovane DNK1 koja je sr` geneti~kog in`enjeringa. Nau~nici su stekli sposobnost precizne integracije nizova DNK koje pripadaju razli~itim organizmima iste vrste ili ~ak razli~itim biolo{kim vrstama. Odvija se u 4 koraka: 1) Isecanje `eljenog fragmenta DNK iz molekula DNK donora pomo}u specifi~nih enzima restrikcionih endonukleaza. 2) Spajanje dobijenog fragmenta DNK sa malim molekulom DNK koji ima sposobnost replikacije (vektor za kloniranje). Hibridni molekul DNK, nastao spajanjem fragmenta DNK sa vektorom (plazmid2 ili virusna DNK), naziva se rekombinovani molekul DNK. Spajanje fragmenta DNK sa vektorom vr{i se pomo}u enzima DNK ligaze.

Rekombinovana DNK predstavlja molekul DNK ~iji se delovi, dobijeni iz razli~itih organizama, ve{ta~ki spajaju.Neki geneti~ari umesto naziva rekombinovana DNK upotrebljavaju naziv himeri~na DNK po gr~kom mitolo{kom monstrumu Himeri. Ve} vekovima Himera je smatrana simbolom nemogu}eg biolo{kog jedinstva, kombinacijom delova tela razli~itih `ivotinja.
2 plazmid= cirkularni molekul DNK koji se nalazi u citoplazmi bakterijskih }elija, replicira se nezavisno od hromozoma doma}ina.

1

4

3) Uno{enje rekombinovanog molekula DNK u }eliju doma}ina ~iji enzimi obezbe|uju njegovu replikaciju. 4) Identifikacija }elija doma}ina u kojima se nalazi ispitivani fragment DNK i njegovo izolovanje.

Slika 1. [ematski prikaz procesa kloniranja gena

Izolovanje DNK Prvi korak u pravljenju rekombinovane DNK je izolovanje donorske i vektorske DNK. Ekstrahovana DNK iz donora mo`e biti ili jedarna genomska DNK eukariota ili “glavna” genomska DNK prokariota. Kao uobi~ajeni vektori koriste se plazmidi bakterija koji najpre moraju biti pre~i{}eni od bakterijske genomske DNK pomocu ultracentrifugiranja. Bakteriofagi se tako|e mogu koristiti kao vektori za kloniranje DNK. Restrikcioni enzimi Tehnologija rekombinovane DNK bi bila nemogu}a bez otkri}a restrikcionih enzima. Restrikcioni enzimi su produkti bakterija i imaju ulogu odbrane bakterije od bakteriofaga. Enzimi deluju poput makaza i seku DNK fage i time je inaktivi{u. [to je veoma va`no, restrikcioni enzimi ne seku nasumi~no, ve} na specifi~nim ciljnim DNK sekvencamarestrikcionim mestima, {to je jedna od klju~nih odlika koja ih ~ini pogodnim za DNK manipulaciju. Ova mesta naj~e{}e su DNK palindromi3 Mnogi razli~iti restrikcioni enzimi prepoznaju i seku specifi~ne palindrome.
3

DNK palindromi-nizovi nukleotida u dvolan~anoj DNK koji su identi~ni kada se ~itaju u smeru 5’→ 3’

5

Na primer Eco RI prepoznaje slede}u sekvencu od 6 nukleotidnih parova: 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ Do sada je u ~istom stanju izolovano nekoliko stotina razli~itih restrikcionih enzima. Oni su dobili nazive po bakterijama iz kojih su izolovani (npr. Eco - izolovan iz E. coli,...) Neki restrikcioni enzimi seku dvolan~anu DNK tako da krajevi dobijenih fragmenata ostaju ravni. Me|utim, ve}ina ovih enzima preseca 2 lanca na razmaku od 2 do 4 nukleotida, tako da krajevi dobijenih fragmenata ostaju jednolan~ani (“lepljivi krajevi”). Ovakvi restrikcioni enzimi se koriste u geneti~kom in`enjeringu jer se 2 razli~ita fragmenta DNK (donora i vektora) mogu lako spojiti pomo}u komplementarnih “lepljivih krajeva”. Posle hibridizacije mogu}e je, pomo}u DNK ligaze, spojiti lance i dobiti hibridni rekombinovani molekul DNK. Naime, donorska DNK i vektorska DNK su najpre ise~ene pomo}u istog restrikcionog enzima koji proizvodi lepljive krajeve, i onda pome{ane u test tubi da bi se lepljivi krajevi donorske DNK sparili sa lepljivim krajevima vektorske DNK i obrazovali rekombinantne DNK molekule. Zatim je dodata DNK ligaza koja stvara fosfodiestarske veze (definitivno slepljuje krajeve). Pojedini plazmidi osta}e nerekombinovani.

Slika 2.Stvaranje molekula rekombinovane DNK

6

Gra|a plazmida Plazmidi koji se koriste kao vektori za kloniranje, naj~e{}e su modifikovani da bi najbolje zadovoljili potrebe eksperimentisanja. Tipi~an plazmidni vektor se sastoji od: 1) replikativnog po~etka 2) bar jednog gena koji obezbe|uje rezistentnost (otpornost) }elije doma}ina na odre|eni antibiotik(npr ampicilin-AmpR) 3) restrikciona mesta (naj~e{}e ih ima vi{e razli~itih koncentrisanih u jednom delu DNK plazmida- polilinker da bi se jedan tip plazmida mogao koristiti za kloniranje fragmenata polilinker, DNK dobijenih razli~itim restrikcionim enzimima) 4)LacZ gena koji kodira β-galaktozidazu,enzim koji hidrolizuje laktozu kao i sinteti~ku zamenu X-gal.U lacZ genu je i restrikciono mesto za endonukleazu.

Slika 3. Gra|a plazmida

Transformacija ili uno{enje rekombinovane DNK u bakteriju Slede}i korak je uno{enje rekombinovane DNK u bakterije(koje imaju mutaciju u lacZ genu) i koje su pripremljene tako da mogu da je prime. Ovaj postupak se naziva transformacija. Identifikacija }elija doma}ina u kojima se nalazi ispitivani fragment DNK Sve bakterijske }elije kojima su ponu|eni plazmidi sa ugra|enim fragmentima DNK ne}e biti transformisane. Prepoznavanje ili selekcija bakterija koje su transformisane vr{i se na osnovu njihove rezistencije na antibiotik koju nosi gen ugra|enog plazmida. Transformisane bakterije }e se razmno`avati i graditi kolonije na podlozi od agara u kojoj je dodat odgovaraju}i antibiotik. One u koje nije u{ao plazmid bi}e ubijene jer nisu rezistentne na odgovaraju}i antibiotik (nemaju gen za rezistentnost koji se nalazi na plazmidu). Tako|e,u pojedine bakterije je u{ao nerekombinovani plazmid.Kolonije bakterija sa nerekombinovanim plazmidom su plave jer proizvode funkcionalnu βgalaktozidazu koja hidrolizuje X-gal u medijumu i daje plav prozivod. Kolonije sa rekombinovanim plazmidom(koji je imao restrikciono mesto usred lacZ gena) ne prozivode funkcionalnu β-galaktozidazu tako da }e kolonije biti bele. 7

Prilikom se~enja donorske DNK endonukleazom nastalo je na hiljade fragmenata koji su ugra|eni u plazmide, ali samo neki plazmidi nose fragment sa genom od interesa. Da bismo identifikovali koloniju sa tim genom,koristimo kao probu radioaktivnu jednolan~anu DNK ili RNK koja je komplementarna tra`enom genu. Jedan broj }elija iz svake bele kolonije posebno uzgajamo i denature{emo njihove DNK.Proba se hibridizuje sa komplementarnom sekvencom(tra`eni gen) i obele`ava odgovaraju}e kolonije. Prevazila`enje eukariotskog Prevazila`enje problema funkcionisanja eukariotskog gena u bakterijskom doma}inu Ne bi li se prevazi{le razlike u promoterima i drugim kontrolnim sekvencama,nau~nici su konstruisali vektor ekspresije koji sadr`i visoko aktivni prokariotski promoter iznad restrikcionog mesta gde }e biti uba~en eukariotski gen.Bakterijski doma}in }e prepoznati promoter i ispoljavati strani gen vezan za taj promoter. Drugi problem u ispoljavanju eukariotskih gena u bakterijama su nekodiraju}i regioni(introni) koji spre~avaju pravilnu ekspresiju jer bakterije ne sadr`e ma{ineriju za obradu primarnog transkripta.Ovaj problem se re{ava kori{}enjem cDNK forme gena koja uklju~uje samo kodiraju}e regione(egzone). Molekularni biolozi mogu izbe}i inkompatibilnost izme|u prokariota i eukariota kori{}enjem eukariotskih }elija npr. kvasca kao doma}ina.]elije kvasca se lako uzgajaju i imaju plazmide. Mogu se koristiti i YAC-ovi. Ve}ina eukariotskih proteina ne}e funkcionisati ukoliko nije modifikovana nakon translacije(npr dodatkom odgovaraju}ih ugljenih hidrata ili lipidnih grupa).Bakterije ne mogu izvesti takve modifikacije,a ukoliko se gen za ovaj process nalazi kod sisara,ni }elija kvasca ne}e mo}i da proizvede funkcionalan protein.U tom slu~aju se koristi `ivotinjska }elija kao doma}in.

DNK biblioteka
Najva`niji cilj tehnologije rekombinovane DNK je da se klonira odre|eni genomski fragment za koji je nau~nik zainteresovan. Po{to geni predstavljaju veoma mali deo hromozoma jedini na~in da se izoluju pojedina~ni geni jeste fragmentisanje celog genoma nekog organizma restrikcionim enzimom. Dobija se veliki broj razli~itih fragmenata. Svaki od ovih fragmenata se ugra|uje u vektor za kloniranje i tako se dobija “genomska biblioteka” odre|enih organizama. Ovaj metod je nekad prikazivan kao “shotgun” (lova~ka pu{ka) kloniranje, jer se umno`ava veliki broj fragmenata dok mo`da samo 1 od njih sadr`i `eljeni gen. Zadatak je onda na}i taj odre|eni klon sa `eljenim genom. Tra`enje se obavlja pomo}u probe, koja nalazi i markira tra`eni klon. Postoje 2 vrste probi: 1) one koje prepoznaju DNK i 2) one koje prepoznaju protein Postoji vi{e kriterijuma klasifikacije DNK biblioteka. Prvi kriterijum je kori{}eni vektor za kloniranje. Razli~iti vektori za kloniranje mogu da “nose” razli~ite koli~ine DNK, tako da odabir vektora za biblioteku zavisi od veli~ine genoma ili drugog DNK uzorka ~ija se biblioteka

8

pravi. Plazmidi i fage su vektori koji nose male koli~ine DNK, kosmidi4 nose ve}e koli~ine DNK dok BAC5-ovi i YAC6-ovi nose najve}e koli~ine DNK od navedenih. Drugi kriterijum klasifikacije DNK biblioteka je prema izvoru DNK. Veoma va`na odluka je da li praviti genomsku biblioteku (ime ka`e: sadr`i ceo genom odre|enog organizma) ili cDNK biblioteku7(biblioteka koja sadr`i samo kodiraju}e regione genoma i pre~i{}ena je od regulatornih sekvenci8 i introna, i time je znatno manja od genomske biblioteke). Izbor izme|u genomske DNK i cDNK biblioteke zavisi od namene. Ako je konstruisanje biblioteke uvod u kloniranje celog genoma, onda }e biti potrebna genomska biblioteka. Me|utim ukoliko je potreban specifi~ni gen, koji je aktivan u specifi~nom tipu biljnog ili `ivotinjskog tkiva onda je logi~no napraviti cDNK biblioteku iz tog uzorka. PCRPCR-polymerase chain reaction Reakcija lan~anog umno`avanja DNK omogu}ava brzu, specifi~nu i visoko senzitivnu amplifikaciju (umno`avanje) `eljenog segmenta DNK. Osnovna prednost PCR-a je mogu}nost dobijanja ve}e koli~ine `eljenog produkta iz materijala. drasti~no malih koli~ina polaznog materijala Pokazano je da se PCR mo`e uspe{no primeniti i za umno`avanje sekvenci sa jednog jedinog polaznog molekula. Po{to za reakcije PCR-a nije potrebna visokokvalitetna i pre~i{}ena DNK, PCR je mogu} gotovo na svim DNK izolatima. Da bismo analizirali neki gen pomo}u PCR-a, moramo imati bar neke informacije o sekvenci datog gena, na osnovu kojih se sinteti{u tzv. “prajmeri9”.Te informacije se mogu dobiti na primer na osnovu sekvence aminokiselina u proteinu koji taj gen kodira. Osnovni princip PCR amplifikacije `eljenog segmenta DNK predstavlja imitaciju replikacije DNK. Replikacija DNK je proces u kome se od jednog molekula DNK dobijaju dva nova, identi~na molekula DNK. Upro{}eno re~eno, za replikaciju DNK je potrebna DNK matrica, prajmer, gradivni blokovi-nukleotidi i enzim koji katalizuje ugradnju nukleotida po principu komplementarnosti sa matricom (DNK zavisna DNK polimeraza). U PCR-u, s obzirom da sami biramo prajmere, imamo dirigovanu sintezu ta~no odre|enog dela DNK ograni~enog prajmerima. Prajmerima ograni~eni deo DNK koji se umno`ava produkuje pribli`no 228 tj. preko milijardu kopija. PCR reakcija se odvija u mikrotubi, gde se podvrgava preciznim, cikli~nim promenama temperature, {to ima za posledicu amplifikaciju ta~no odre|enog gena ili dela gena, milion do milijardu puta.

Kosmidi su vektori za kloniranje poput plazmida. Replikuju se autonomno sli~no plazmidima, s tim {to se mogu spakovati in vitro u virusni omota~ ( sli~no DNK u λ fagu) i uneti u bakteriju infekcijom a ne transformacijom. 5 BAC (Bacterial artificial chromosome). F plazmid izgra|en za ulogu kloniraju}eg vektora koji mo`e da nosi velike inserte. 6 YAC(Yeast artificial chromosome)ve{ta~ki izgra|en vektor za kloniranje u kvascu. 7 cDNK ili komplementarna DNK je sintetisana DNK dobijena pomo}u mRNK(informaciona RNK) ,uz dejstvo enzima RNK zavisne DNK polimeraze (reverzne transkriptaze) koji je izolovan iz retrovirusa. Koriste}i mRNK kao kalup reverzna transkriptazasinteti{e jednolan~ani DNK molekul, koji se onda koristi kao kalup za sintezu dvolan~anog DNK molekula. 8 regulatorni geni su geni koji imaju ulogu pokretanja i zaustavljanja transkripcije strukturnih gena. 9 prajmer je kratak oligonukleotidni lanac na ~iji 3’ kraj DNK polimeraza dodaje nukleotide u procesu ekstenzije prajmera.

4

9

Jedan ciklus ~ine : 1) denaturacija DNK matrice 2) hibridizacija prajmera sa matricom 3) elongacija prajmera.

Slka 4. Shematski prikaz procesa DNK amplifikacije PCR-om.

1) Denaturacija dvolan~ane DNK dvolan~ane Denaturacija dvolan~ane DNK mo`e se posti}i pomo}u vi{e fizi~kih i hemijskih sredstava, a naj~e{}e se upotrebljava zagrevanje na 950C. Zagrevanje smese tokom 3-5 minuta na 95°C je dovoljno za kompletnu denaturaciju DNK.DNK ima sposobnost i da se renaturi{e, postepenim hla|enjem. 2) Hibridizacija prajmera sa matricom (aniling) Najkriti~niji korak u optimizaciji PCR-a je izbor temperature za hibridizaciju prajmera sa matricom. Po{to su prajmeri za PCR obi~no du`ine oko 20 nukleotida, mo`e se o~ekivati da se sekvenca komplementarna prajmerima na|e samo na jednom mestu u genomu jednog organizma.Na disocirani lanac DNK se vezuju prajmeri kada se PCR smesa ohladi do temperature hibridizacije. Optimalna temperatura hibridizacije se kre}e u rasponu 420C-650C.

10

3) Elongacija prajmera Vreme trajanja elongacije prajmera zavisi od du`ine ciljne sekvence koju `elimo da umno`imo, kao i od temperature na kojoj se izvodi korak elongacije. Posle vezivanja prajmera enzim DNK-polimeraza katalizuje sintezu novih lanaca DNK dodaju}i komplementarne nukleotide. Elongacija prajmera tj. ugradnja nukleotida na 3’ krajeve prajmera se odvija na 720C i katalizovana je DNK- polimerazom. Broj DNK lanaca udvostru~ava se posle svakog ciklusa. Broj ciklusa u PCR metodi se obi~no kre}e od 25 do 35. Posle zavr{etka reakcija se obi~no analizira elektroforezom10 na gelu agaroze uz markere poznate veli~ine tj. ispituje se da li du`ina nastalog PCR produkta odgovara predvi|enom rastojanju izme|u prajmera. Taq polimeraza Taq polimeraza je termostabilna DNK zavisna DNK-polimeraza, koja je prvi put izolovana iz bakterije Thermus aquaticus , koja raste na temperaturi od 700C do 750C u toplim izvorima Jeloustonskog nacionalnog parka u SAD. Taq DNK- polimeraza ima ograni~enu sposobnost da sinteti{e DNK iznad 900C, enzim je relativno stabilan i nije denaturisan nepovratno pri izlaganju visokoj temperaturi. RFLP,Southern blotting,Northern blotting i Western blotting RFLP(restriction fragment length polymorphisms) se zasniva na razlikama u RFLP restrikcionim mestima na homolognim hromozomima ~ija je posledica i druga~ija kombinacija fragmenata. Naime ukoliko je restrikciono mesto izmenjeno usled mutacije,presecanja ne}e biti i fragment }e biti du`i. Southern blotting je tehnika za izolaciju i identifikaciju specifi~nog fragmenta DNK . DNK je ise~ena restrikcionim enzimom i dobijeni fragmenti su izlo`eni elektroforezi na agaroznom gelu. Elektroforeza razdvaja fragmente po veli~ini- manji fragmenti migriraju br`e od ve}ih. Zatim su DNK fragmenti denaturisani bazom- postaju jednolan~ani. Napravljena je trajna kopija DNK fragmenata preno{enjem na nitrocelulozni filter koji vezuje jednolan~anu DNK. Specifi~na DNK proba radioaktivno obele`ena(radioizotopom) je dodata. Ona hibridizuje sa komplementarnom sekvencom na filteru i mo`e se uo~iti autoradiografijom.

10 Elektroforeza je metod za razdvajanje makromolekula po veli~ini,naelektrisanju ili nekim drugim fizi~kim osobinama.Ve}i molekuli se sporije kre}u u elektri~nom polju usled zadr`avanja u matriksu gela. Kako su nukleinske kiseline negativno naelektrisane,putuju ka anodi.

11

Slika 5. Southern blotting

Northern blotting je tehnika za detekciju RNK fragmenata. Razlikuje se od Southern blotting-a samo po upotrebi RNK umesto DNK. Procedura je ista11. Western blotting se koristi za ispitivanje proteina.U ovom slu~aju proba nije komplementarna DNK ve} antitelo.

Odre|ivanje sekvence DNK12
Sangerov metod preranog zavr{etka lanca (dideoxyribonucleotide chain-termination chainmethod) Ovaj metod imitira sintezu DNK i proizvodi mno{tvo DNK lanaca koji su komplementarni originalnom fragmentu. Svaki lanac }e po~eti sa istim prajmerom a zavr{i}e se sa dideoksiribonukleotidom(formom nukleotida kojoj fail 3’-OH grupa tako da se sinteza prekida). Dideoksi metod zavr{etka lanca se odvija u 4 faze:

11 12

Pri hibridizaciji DNK proba hibridizuje sa komplementaranom RNK sekvencom. Najzahtevnije mapiranje je svakako bilo sekvenciranje humanog genoma(Human Genome Project) koje je trajalo od 1990. do 2003. godine.

12

1)fragment DNK koji sekvenciramo je denaturisan i inkubiran sa sastojcima neophodnim za DNK sintezu: prajmerom, DNK polimerazom, 4 vrste deoksiribonukleotida i 4 vrste dideoksiribonukleotida(svaki obele`en posebnim fluorescentnim molekulom). 2) Sinteza svakog novog lanca po~inje na 3’ kraju prajmera i nastavlja se dok slu~ajno nije uba~en dideoksiribonukleotid umesto ekvivalentnog deoksiribonukleotida. Elongacija se tu zavr{ava.Dobija se mno{tvo obele`enih DNK lanaca razli~itih du`ina sa obojenim poslednjim nukleotidom. 3)Obele`eni lanci u sme{i se razdvajaju na poliakrilamidnom gelu u kapilarnoj tubi.Kra}i lanci se kre}u br`e. Detektor bele`i fluorescentnu boju na lancima koji se kre}u. Lanci koji se razlikuju po jednom nukleotidu u du`ini mogu se detektovati prilikom ~itanja.Rezultati su od{tampani a sekvenca komplementarna kalupnom lancu se ~ita odozdo ka gore.

Sliak 6. Sangerov metod preranog zavr{etka lanca

13

Analiza ekspresije gena DNK ~ipom
DNK mikromre`a(DNA microarray,DNK ~ip) se sastoji od velikog broja jednolan~anih DNK fragmenata koji predstavljaju razli~ite gene koji su razvrstani i fiksirani.Idealno,ovi ~ipovi sadr`e sve gene organizma.Postupak je prikazan na slici. Iz mRNK koja je uzeta iz odre|enog uzorka,reverznom transkripcijom se pravi cDNK koja je fluorescentno obojena. Ona hibridizuje sa komplementarnom DNK u ~ipu.Skeniranjem svelte}ih ta~kica saznaje se koji geni su eksprimirani u tom uzorku tkiva. Upore|ivanjem ekspresije gena u normalnom i kanceroznom tkivu dolazi se do informacija koje mogu pomo}i u usavr{avanju terapije. Mo`e da se prati i ekspresija gena u istom tkivu pod razli~itim uslovima,kao i promena ekspresije gena tokom embrionalnog razvi}a i diferencijacije.

Slika 7. DNK ~ip

14

2. Primena biotehnologije Poljoprivreda
Jedan od ciljeva moderne biotehnologije je modifikovanje genetskog materijala biljaka koje se koriste u ishrani radi: 1)pove}anja prinosa 2)ve}e otpornosti biljaka na vremenske nepogode(npr. su{e) i slano zemlji{te 3)ve}e otpornosti biljaka na insekticide,herbicide i fungicide 4) Manje zavisnosti od istih(ve}e otpornosti na insekte itd.) kao i |ubriva 5)Pove}anja nutritivne vrednosti U geneti~kom in`enjeringu biljaka naj~e{}e se koristi bakterija Agrobacterium tumefaciens i njen Ti plazmid. Tako je zahvaljuju}i geneti~kom in`enjeringu dobijen je paradajz koji sporije truli na polici, pamuk otporan na `i{ke, krompir otporan na krompirovu zlaticu. Geni iz bakterije Bacillus thuringensis za Bt toksine(ne deluju na ljude) su uba~eni u biljke koje su postale rezistentne na {tetne insekte. Gen iz brazilskog oraha uba~en u soju je korigovao oskudicu u metioninu13. U tzv “zlatni pirina~” su uba~eni geni iz biljke narcisa {to omogu}ava proizvodnju betakarotena i time spre~ava deficijenciju vitamina A i slepilo koje se razvijalo kod ljudi sa siroma{nom ishranom..

Slika 8.Obi~an i zlatni pirina~

plants(pametne biljke) Smart plants Genetski modifikovane “pametne biljke” obave{tavaju poljoprivrednika kada }e da nastupi deficijencija odre|enog minerala ali PRE o{te}enja.Time se smanjuje upotreba |ubriva. Jedan tip ovih biljaka koristi promoter koji br`e vezuje RNK polimerazu(koja vr{i transkripciju) kada koncentracija fosfora u biljnom tkivu po~ne da opada.Ovaj promoter je povezan sa genom reporterom koji dovodi do proizvodnje plavog pigmenta tako da kad li{}e po~ne da poprima plavu boju,farmer zna da je vreme da doda fosfatno |ubrivo.

13

vi{e o negativnim posledicama upotrebe GM hrane u odeljku o eti~kim dilemama

15

Slika 9. Upozorenje “pametne biljke” na deficijenciju fosfora

Slika 10. Levo: Genetski modifikovan pamuk otporan na insekte (levo) u pore|enju sa neza{ti}enim pamukom (desno). Desno: Transgena biljka duvana koja ispoljava gen za svetlost kod svica

Slika 11. Prskanje herbicidom je ubilo korov dok je genetski modifikovan kukuruz opstao.

16

Industrija
Proizvodnja piva Pivo je slabo alkoholno piće, koje se proizvodi u procesu alkoholnog vrenja iz slada, hmelja, vode i pivskog kvasca. Pivski slad se dobija od žitarica, najčešće od ječma i daje pivu sastojke od kojih zavisi punoća ukusa i koncentracija osnovnog ekstrakta piva. Hmelj služi za konzervaciju piva i daje mu prijatan karakterističan miris i gorak ukus, dok pivski kvasac izaziva alkoholno vrenje u kome šećer prelazi u etanol i ugljen dioksid. Proizvodnja vina. Vino je alkoholno pi}e koje se dobija naj~e{}e fermentacijom gro`|a ili gro`|anog soka(mo`e se koristiti i drugo vo}e) uz pomo} kvasca.Prirodni balans gro`|a je takav da mo`e da izazove vrenje bez ikakvog dodavanja {e}era,kiselina,enzima i drugih supstanci koje izazivaju fermentaciju. Vino nastaje tako {to se gro`|e gnje~i i dobija sok-{ira.U osnovi proizvodnje je proces fermentacije tokom kojeg pod uticajem kvasca dolazi do razlaganja {e}era do etanola,pri ~emu se osloba|a ugljen-dioksid. Proces vrenja traje vi{e nedelja, nakon ~ega se vino preta~e u ba~ve. Gro`|e sadr`i i tanine koji su prirodni konzervansi i omogu}avaju starenje vina. Lakti~ne bakterije (LAB). Lakti~ne bakterije(odnosno bakterije mle~ne kiseline) su bakterije ~ije je osnovno svojstvo da obavljaju razgradnju ugljenih hidrata do mle~ne kiseline14.Prirodna nalazi{ta LAB-a su: 1)Na biljkama(u manjem broju zbog prisustva kiseonika) 2)Kod ljudi i ostalih sisara na sluzoko`i usne duplje,gastrointestinalnog trakta,vagine,mle~nim kanalima dojki. 3)U mednom `eludcu p~ela.Smatra se da asepti~ka svojstva meda omogu}avaju upravo lakti~ne bakterije prisutne u `eludcu p~ela. Danas se gaje u laboratorijama i one i njihovi produkti koriste u proizvodnji hrane i pi}a. Fermentacijom laktoze i drugih ugljenih hidrata proizvode mle~nun kiselinu koja doprinosi osve`avaju}em kiselom ukusu mle~nih proizvoda i inhibira rast patogenih i saprofitnih mikroorganizama,a kod prozivodnje sira je va`na tokom koagulacije. Probiotske lakti~ne bakterije proizvode biolo{ki aktivne supstance koje imaju pozitivan efekat na zdravlje ljudi. One pru`aju mogu}nost da se putem ishrane vr{i stabilizacija flore intestinalnog trakta,pobolj{ano usvajanje laktoze,sni`enje nivoa holesterola u krvi,smanjenje nadutosti,za{tita od infekcija i stvaranja kancera debelog creva. Bakteriocini su specifi~ni produkti metabolizma bakterija koji imaju antibakterijska svojstva prema drugim vrstama bakterija. U novijim istra`ivanjima dobijeni su produkti lakti~nih bakterija koji imaju antimikrobno dejstvo na Staphylococcus,Enterococcus,Salmonella,Pseudomonas,Escherichia coli,Shigella itd Klini~kim ispitivanjem dobijeni su dobri rezultati u saniranju te{kih infekcija i upale ko`e.

Jedna od metoda identifikacije bakterija se upravo zasniva na ispitivanju fermentativnih sposobnosti bakterija. API(Analytical Profile Index) koristi galeriju od 50 osu{enih {e}era na koje deluju(ili ne deluju) dodate suspenzije bakterijske kulture. Rezultati se porede sa standardnim tablicama odakle se o~itava vrsta iz bakterijske suspenzije.

14

17

Biogoriva(biofuels) su goriva koja poti~u od mrtvih organizama. Biogoriva U te svrhe se naj~e{}e gaje biljke: {e}erna repa,{e}erna trska,kukuruz,itd iz kojih se proizvodi etanol koji se prodaje kao gorivo.Za razliku od fosilnih goriva koja neprestano podi`u temperature na Zemlji osloba|aju}i nove koli~ine ugljenika,ugljenik u biogorivu poti~e iz atmosfere tj biljke su ga ugradile tokom rasta. Kukuruz se melje,me{a sa vodom i zagreva.Dodaju se enzimi koji skrob pretvaraju u {e}er.U kazanu za fermentaciju kvasac pretvara {e}er u alkohol koji se destilacijom odvaja od vode. Biodizel. Biodizel. Hemijskom modifikacijom biljnih ulja dobija se biodizel iz soje,suncokreta,uljane repice.. Fabrika “Viktorija oil” AD [id za sada je jedini proizvo|a~ biodizela u Srbiji. Nastoji se i boljem iskori{}avanju bakterija za proizvodnju biogasa.

Slika 11. Alge proizvode biogorivo

Slika 12. Kukuruz

Tekstilna industrija Biotehnologija je omogu}ila stvaranje pamuka otpornog na insekte i herbicide kao i prirodno obojenog pamuka. Radi se i na pobolj{anju kvaliteta vune. Vojska je posebno zainteresovana za proizvodnju pancira od vlakana paukove svile. D`ins. Nekada su se agresivne hemikalije(koje o{te}uju vlakno i zaga|uju sredinu) D`ins koristile za obradu d`insa. Za “izno{en” izgled material je trljan kamen~i}ima(odatle izraz “stonewashed”). Danas se u te svrhe koriste razli~iti enzimi. Celulaza(umesto kamen~i}a) omek{ava tkaninu,a za otklanjanje vodonik-peroksida(koji se koristi za beljenje) se koristi katalaza pri ~emu nastaju produkti koji ne zaga|uju `ivotnu sredinu-voda i kiseonik.

18

Slika 13. Farmerke

Ve{ta~ki sneg. Proteinski produkt bakterije Pseudomonas syringae podsti~e zale|ivanje sneg. pa se koristi za pravljenje ve{ta~kog snega.

Medicina
bolesti. Dijagnostikovanje bolesti. DNK tehnologija je omogu}ila stvaranje testova za detektovanje nosilaca recesivno naslednih bolesti kao i individua pogo|enih naslednom bole{}u. Anemija srpastih }elija poga|a uglavnom Amerikance afri~kog porekla. Nastaje usled promene gena za beta globin gde je valin zamenio glutaminsku kiselinu {to menja konformaciju beta lanca. Izmenjeni molekuli hemoglobina interaguju jedni sa drugim,povezuju se i grade stapi}astu strukturu koja deformi{e eritrocit u srpast oblik. Mogu se javiti slabost,bol,o{te}enje organa.Potrebne su transfuzije krvi. Abnormalan gen se detektuje Southern Blotting-om. Usled mutacije,restrikciono mesto za enzim MstII je uni{teno,tako da kod normalnog gena dobijamo 2 trake veli~ina 1.1kb i 0.2kb a kod gena za srpastu anemiju jednu traku veli~ine 1.3kb.

19

Slika 14. Detekcija gena za srpastu anemiju Southern botting-om.

Han bolest(HB) Hantingtonova bolest(HB) je dominantno nasledni neurodegenerativni porem}aj. Na kratkom kraku hromozoma 4 nalazi se gen za hantingtin. Gen sadr`i triplet nukleotida CAG koji se ponavlja. Ako imate ispod 26 ponovaka,bi}ete dobro.Ako imate 39 ponovaka,demencija }e vas sti}i u sedamdeset petoj a prve simptome }ete osetiti u {ezdeset {estoj.Ako imate 50 ponovaka,pamet }ete izgubiti u dvadeset sedmoj godini `ivota. Pogor{anje po~inje blagim popu{tanjem intelektualnih sposobnosti,nevoljnim

20

pokretima mi{i}a i ide do duboke depresije,povremenih halucinacija i uobra`enja. Skala je ovakva: da su va{i hromozomi dovoljno duga~ki da se protegnu oko ekvatora,razlika izme|u zdravlja i ludila bila bi manja od jednog in~a. Bolest je neizle~iva, a njen tok traje izme|u 15 i 25 u`asnih godina. Najjednostavniji na~in dijagnostikovanja HB-a je amplifikacija regiona koji sadr`i ponovke,i procena broja CAG ponovaka na osnovu du`ine PCR produkata. Za dijagnostiku se mo`e koristiti periferna krv. Za prenatalnu dijagnostiku DNK iz }elija amnionske te~nosti ili horionskih ~upica. distrofija. Di{enova mi{i}na distrofija. Di{enova mi{i}na distrofija je fatalna X- vezana recesivna bolest. Fenotip je odumiranje mi{i}a. Prvi znaci su geganje,ote`ano penjanje uz stepenice, i sklonost ka lakom saplitanju. Oko desete godine oboleli obi~no vi{e ne mo`e da hoda i mora da koristi invalidska kolica. Bolest napreduje, bolesnik postaje vezan za krevet i naj~e{}e umire pre dvadesete godine. Mutacije u genu za distrofin(naj~e{}e delecije) mogu biti detektovane pomo}u multiplex PCR-a(amplifikuje se 9 razli~itih regiona gena,pokriva 80% slu~ajeva). Za detaljniju analizu koristi se Southern blotting. Hemofilija. Hemofilija. Od bolesti koje se prenose genom na X hromozomu prvo je otkrivena hemofilija. Hemofilija nastaje usled nedostatka fibrina, {to dovodi do poreme}aja u procesu zgru{avanja krvi. Bolest kontroli{u 2 vezana gena na X hromozomu, koji reguli{u sintezu razli~itih faktora zgru{avanja. Hemofilija tipa A je izazvana nedostatkom antihemofilnog globulina (AHG), dok je hemofilija tipa B rezultat nedostatka tromboplastina. Oko 80% svih pacijenata sa ovom bole{}u imaju hemofiliju tipa A koja se le~i davanjem AHG u transfuziji. Hemofilija A je izazvana re|e delecijom a u najve}em broju slu~ajeva inverzijom. Za detekciju se koristi Southern blotting koji otkriva inverzije i PCR za delecije. Za detekciju hemofilije B se koristi PCR. Cisti~na fibroza (CF) je autosomno recesivni poreme}aj. Normalni alel kodira membranski protein koji funkcioni{e u transportu hlora izme|u odre|enih }elija i van}elijske te~nosti. Ovi transportni kanali su odsutni ili nefunkcionalni kod dece koja su nasledila oba defektna alela. Posledica je visoka koncentracija hlora u van}elijskoj te~nosti, zatim lepljiva,jaka sluz koja se nagomilava u plu}ima,crevima,poreme}ena funkcija pankreasa. Apsorpcija hranljivih materija u crevima je slaba,~est je bronhitis,imunitet je znatno oslabljen. Ako se simptomi ne le~e,ova deca umiru do petog ro|endana.Antibiotici,masa`a koja poma`e ~i{}enju sluzi mogu znatno produ`iti `ivot. Delecija defektnog gena koji se nalazi na hromozomu 7 se mo`e detektovati PCR-om.

Slika 15. Analiza porodice obolelog od cisti~ne fibroze:otac heterozigot,oboleli sin,}erka heterozigot i majka-heterozigot

21

HIVDetekcija HIV-a. AIDS je , za sada, neizle~iva i smrtonosna bolest, iako se primenjuju neki lekovi za le~enje oportunisti~kih infekcija. Za otkrivanje bolesti koriste se testovi (ELISA-test i potom Western-Blot ) koji potvr|uju prisustvo virusa ili antitela na virusne antigene u serumu inficirane osobe. Me|utim HIV-1 se mo`e detektovati i direktnom primenom RT-PCR metode15. Prednost PCR-a u dijagnostici AIDS-a je u tome {to se mo`e detektovati uzro~nik bolesti u najranijim fazama, kada jo{ nisu sintetisana antitela kao i kod novoro|en~adi (gde imunolo{kim tehnikama nije mogu}e razdvojiti antitela majke od antitela ploda). produkti. Farmaceutski produkti. Pre razvi}a DNK tehnologije insulin koji se koristi u tretiranju dijabetesa je dobijan iz pankreasa svinja. Morao je da bude pa`ljivo pre~i{}en,ali je i pored toga ponekad izazivao alergijske reakcije kod pacijenata. Danas se koriste mikroorganizmi za sintezu insulina iz humanog insulinskog gena. Gen se ubacuje u bakterije u izmenjenoj formi,bez introna. Produkt je ~istiji,manja je verovatno}a biolo{ke kontaminacije. U pro{losti kori{}enje hormona rasta iz le{eva je bilo povezano sa hormona Creutzfeldt-Jakob-ovom bole{}u16,a HIV se prenosio tretiranjem hemofilije kontaminiranim faktorom VIII. Protein Insulin Hormon rasta Faktor VIII Faktor IX Tissue plasminogen activator(TPA) Vakcine Bolest Insulin-zavistan dijabetes mellitus Patuljasti rast zbog deficijencije hormona rasta Hemofilija A Hemofilija B Infarkt miokarda,{log Hepatitis B,malarija itd.

Tabela 1. Proteini proizvedeni tehnologijom rekombinovane DNK

Jo{ jedan zna~ajan farmaceutski produkt koji se dobija tehnologijom genetskog in`enjeringa je tissue plasminogen activator (TPA)17. Da bi bio efektan TPA se daje najkasnije 3 sata nakon sr~anog udara i omogu}ava rastvaranje krvnih ugru{aka i smanjuje rizik od narednih sr~anih udara. Proteini dobijeni genetskim in`enjeringom mogu se koristiti u mimikriji receptorskih proteina,~ime se recimo spre~ava ulazak virusa HIV-a u }eliju. Ve}ina patogena ima specifi~ne proteine na povr{ini,koji izazivaju imunu reakciju. Ovaj tip proteina mo`e da se proizvodi i koristi kao vakcina. Genska terapija predstavlja zamenu nefunkcionalnog gena funkcionalnim.Funkcionalni gen se klonira i ubaci u genom retrovirusa. Retrovirusi koji se koriste u genskoj terapiji su prethodno onesposobljeni za samostalnu replikaciju i ne mogu da proizvode ne`eljene
15 16

PCR metoda kojoj prethodi reverzna transkripcija. Creutzfeldt-Jakobova bolest(CJD) je degenerativna neurolo{ka bolest izazvana prionima. 17 Pove}ana aktivnost ovog enzima izaziva poja~ano krvarenje,a smanjena aktivnost opasnost od embolije i tromboze.

22

efekte vezane za infekciju. Mana upotrebe retrovirusa u genskoj terapiji je {to je mogu}e ugraditi samo malu DNK sekvencu-manju od 7kb. Modifikovan virus ugra|uje svoj genom u genom }elija doma}ina koje su gajene i prenosi mu zdravu verziju gena. Promenjene }elije su vra}ene u organizam pacijenta.

Slika 16. Genska terapija A-le~enje dece sa SCID-om B-le~enje cisti~ne fibroze

1990. Anderson i Blez su le~ili trogodi{nju devoj~icu A{anti De Silvu od retke nasledne bolesti SCID-a. Jaka kombinovana imunolo{ka deficijencija (SCID) je ~inila decu nesposobnom da se imunolo{ki odbrane od infekcije, a uzrok je bila brza smrt belih krvnih }elija. Takva deca su ~esto oboljevala i rano umirala. Bolest je uzrokovana gre{kom u jednom genu na hromozomu 20, koji se zove ADA gen. Anderson i Blez su uzeli bele krvne }elije iz krvi obolele devoj~ice , inficirali ih retrovirusima sa ADA genom i vratili transfuzijom natrag u devoj~icino telo. Genska terapija je radila. Broj devoj~icinih belih krvnih }elija se utrostru~io, njeni imunoglobulini su porasli i ona je po~ela da proizvodi skoro ~etvrtinu one koli~ine ADA proteina koju proizvodi prose~na osoba. Iako je nije skroz izle~ila, jer je devoj~ica i dalje primala PEG-ADA terapiju (uno{enje gotovog ADA proteina u krv, proizvoda ekvivalentnog gena gove~eta), genska terapija je pomogla. Ova procedura nije bila kraj le~enja,jer genetski modifikovana bela krvna zrnca funkcioni{u nekoliko meseci,nakon ~ega se terapija mora ponoviti. I druge

23

bolesti }e se uskoro pridru`iti kombinovanoj imunolo{koj deficijenciji i le~iti genskom terapijom. Da bi efekti genske terapije bili trajni, }elije koje su primile normalni alel moraju da se dele u toku `ivota pacijenta. Zato su }elije ko{tane sr`i,koje uklju~uju i stem }elije primarni kandidati.

Slika 17.Genska terapija-trajni efekti

Osim retrovirusa,kao vektori se mogu koristiti i adenovirusi,me|utim kako se ne integri{u u genom doma}ina efekti su kratkotrajni. Mana kori{}enja retrovirusa u genskoj terapiji je {to se gen mo`e nasumi~no ubaciti,recimo usred gena koji kontroli{e deobu }elije {to mo`e dovesti do raka. Zabele`ena su tri slu~aja leukemije nakon le~enja SCID-a. Drugi problem je kako mo`emo kontrolisati ekspresiju prene{enog gena tako da se dobija potrebna koli~ina produkta u pravo vreme i na pravom mestu. }elije. Stem }elije. Stem }elije su nediferencirane }elije koje imaju sposobnost deobe i proizvodnje specijalizovanih }elija.Transplantacija ko{tane sr`i se koristi ve} godinama u le~enju leukemije.

24

Radi se i na preobra`avanju }elija ko{tane sr`i u spermatozoide {to bi moglo omogu}iti lezbejskim parovima da imaju decu18.

Forenzika
Analiza biolo{kih materijala sa mesta zlo~ina koji sadr`e DNK mo`e identifikovati po~inioca sa ve}om sigurno{}u.DNK sekvenca svake osobe je jedinstvena(osim kod jednojaj~anih blizanaca19). DNK fingerprinting je tehnika razlikovanja individua iste vrste na osnovu DNK. Koriste se VNTR(Variable Number Tandem Repeats) sekvence koje su visoko varijabilne u broju ponavljanja u bloku. Blokovi se mogu amplifikovati PCR-om i zatim porediti. CODIS je baza podataka koju koristi FBI i zasnovana je na 13 razli~itih VNTR sekvenci.[ansa da dva ~oveka imaju isti raspored traka,tj. da im se poklapaju du`ine blokova kod svakog VNTR-a je veoma mala.

Slika 18. Levo: Varijacija du`ine VTNR alela kod 6 osoba Desno:{ematski prikaz VNTR-a u 4 alela

Pre PCR-a tehnika RFLP-a se koristila za analizu VNTR blokova.Me|utim ova tehnika je znatno sporija i potrebna je ve}a koli~ina DNK.

Slika 19. Analiza slu~aja ubistva. Na ode}i osumnji~enog je prona|ena krv koja pripada `rtvi,{to se vidi po poklapanju rasporeda traka.
Nemogu}nost razvi}a normalnog embriona fuzionisanjem 2 jajne }elije ili 2 spermatozoida nastaje zbog genomskog imprintinga.Spermatozoid i jajna }elija imaju razli~itu kombinaciju aktivnih i neaktivnih gena. Za normalno razvi}e ponekad je potrebna samo jedna aktivna verzija a spajanjem 2 jajne }elije mogu se dobiti npr. 2 aktivne verzije,a spajanjem 2 spermatozoida 0. 19 Pronalaze se na~ini za razlikovanje jednojaj~anih blizanaca-na osnovu bolovanja od razli~itih bolesti {to dovodi do prisustva razli~itih antitela,zatim ugradnje latentne virusne DNK na razli~itim mestima u genomu,kao i razli~itim mutacijama u mitohondrijalnoj DNK..
18

25

DNK fingerprinting se koristi i u dokazivanju o~instva(i materinstva). Poredi se DNK majke,deteta i potencijalnog oca. Dete nasle|uje pola genetskog materijala od majke,a pola od oca. Tako|e, mitohondrijalna DNK20 se mo`e koristiti za pra}enje `enskih predaka, a Y hromozom za pra}enje mu{kih.

Bioinformatika
Obilje sekvenci i strukturalnih podataka je dovelo do nastanka bioinformatike,koja predstavlja presek biotehnologije i nauke o ra~unarima. Baze podataka sekvenci Sekvence u elektronskoj formi se mogu na}i u bazi podataka na Internetu.Npr. http://pir.georgetown.edu/ (spisak proteinskih sekvenci) ili http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html (sadr`i genske sekvence ) Upore|ivanje sekvenci Mo`emo porediti sli~nost dva polipeptida ili segmenta DNK pronala`enjem delova koji se poklapaju. Npr. citohrom c kod ~oveka i psa se razlikuju u 11 od 104 aminokiselina u lancu,dakle [(104-11)/104]×100=89% se poklapaju.

Slika 20. Upore|ivanje DNK sekvenci 2 vrste koje su nastale akumuliranjem mutacija i koje poti~u od

zajedni~kog pretka

Dva najpoznatija programa za upore|ivanje sekvenci su BLAST(basic local aligment search tool) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast i FASTA http://www.ebi.ac.uk/fasta33/
20

Nasle|uje se uvek od majke

26

O~uvanje `ivotne sredine
Bioremedijacija predstavlja kori{}enje organizama za otklanjanje zaga|uju}ih supstanci iz zemlji{ta,vode i vazduha. Na primer bakterije i archaea razla`u organsku materiju iz kanalizacije ,stvaraju}i material koji se mo`e nakon hemijske sterilizacije koristiti za popunjavanje zemlji{ta i proizvodnju |ubriva. Druge primene bioremedijacije su razlaganje radioaktivnog otpada i ~i{}enje naftnih mrlja. U rudarstvu prokarioti se koriste za ekstrakciju metala iz ruda.

Slika 21. Radnik prska |ubrivom zemlji{te zaga|eno naftom.\ubrivo stimuli{e rast bakterija koje }e razlagati naftu.

Fitoremedijacija predstavlja upotrebu biljaka za pre~i{}avanje `ivotne sredine. Paprat Pteris vittata akumulira arsen u listovima. Druge biljke akumuliraju olovo,cink, radioaktivne metale(stroncijum-90 i cezijum-137). Vrba i topola imaju sposobnost pumpanja velike koli~ine vode sa organskim zaga|iva~ima,pa ih koriste naftne rafinerije.

Slika 22. Suncokreti upijaju radioaktivne materije iz zaga|ene bare

27

Evolucija
Organizmi sli~nih morfolo{kih karakteristika i sli~nih DNK sekvenci imaju ve}u verovatno}u da budu srodni. Ipak,u nekim slu~ajevima pripadnici dve vrste mogu biti geneti~ki sli~ni i imati razli~itu morfologiju,kao i vice versa. Recimo mala promena u genima koji kontroli{u vreme razvi}a tzv. heterohronija mo`e dovesti do potomaka koji se morfolo{ki veoma razlikuju od predaka iako genetska osnova mo`e biti sli~na. Pore|enjem DNK sekvenci nau~nici su u mogu}nosti da procene srodnost vrsta. Kori{}enjem gena koji mutiraju konstantnom brzinom-tzv “molekulski satovi molekulski satovi”,mo`e se utvrditi vreme kada su se ove vrste razdvojile od zajedni~kog pretka. Upore|ivanje geneti~kih osnova mo`e pru`iti dodatne dokaze o konvergentnoj evoluciji recimo.

Slika 23. Konvergentna evolucija:Levo: australijska(torbar-Marsupialia) i ameri~ka krtica(Eutheria). Desno:ameri~ka lete}a veverica i australijski sugar glider.

Bezbednost i eti~ka pitanja koja name}e DNK tehnologija
“To su paradoksi mo}i i humanosti: mogu}nosti nauke i tehnike su ogromne,ali i ljudska isku{enja u njihovoj primeni tako|e. Nauke danas vi{e uznemiravaju i zabrinjavaju nego {to umiruju ~oveka”. Prof . dr Ivan Kolari}21

DNK tehnologija name}e i nove probleme. 1992. svetski proizvo|a~ semena Pioneer je ubacio u soju gen iz brazilskog oraha u cilju nutritivnog oboga}ivanja, korigovanja sojine prirodne oskudice u metioninu. Me|utim uskoro se pokazalo da odre|en broj ljudi razvija alergiju na brazilski orah,pa se i transgena soja pokazala kao alergen. Tako|e,genetski modifikovane biljke mogu razmenjivati gene sa svojim divljim srodnicima,tako da se gen za rezistentnost na herbicid mo`e preneti na korov,pri ~emu se dobija “superkorov”. Potrebna su i ispitivanja uticaja gena koji kodiraju toksine za {tetne insekte na korisne insekte(recimo ako je gen ispoljen u polenu,postoji opasnost da }e ubiti opra{iva~e). Kompanije koje proizvode transgena semena koriste tehnologiju “terminatora”. One prodaju semena koja garantuju dobar prinos,zdravu biljku ali i sterilnu. Tako da farmeru ne ostaje ni{ta drugo nego da kupi i slede}e godine seme.
21

Ivan Kolari}-profesor filozofije http://www.geocities.com/kolaricivan/prva.htm

28

I pored brojnih pozitivnih strana testiranja nosilaca i genske terapije,postoji i mra~na strana. Kod genske terapije je potreban poseban oprez,da se gen ne bi ubacio na pogre{nom mestu i blokirao funkcionisanje drugog gena,ili poremetio neki regulator {to mo`e dovesti do raka. Eliminisanjem recesivnih alela, i dizajniranjem genoma elimini{emo prirodnu raznovrsnost. U slu~aju anemije srpastih }elija,heterozigoti su delimi~no za{ti}eni od najopasnijeg oblika malarije {to je doprinelo visokoj frekvenciji alela. Neki geni pod jednim uslovima su {tetni,a pod druga~ijim korisni. Dalje,pitanje je ko ima pravo da zna na{u genetsku osnovu?Da li }e osiguravaju}e kompanije i poslodavci obele`avati nosioce ili one kod kojih simptomi bolesti tek treba da se razviju? Problemi prenatalne dijagnostike su da li recimo dopustiti abortus zdravog deteta paru koji boluje od nasledne bolesti,ali `eli da odr`i trudno}u samo ukoliko `ena nosi obolelo dete?Ma koliko ~udno zvu~alo,primer mo`e biti ahondroplazija22,ili nasledna gluvo}a. Rano dijagnostikovanje mo`e ponekad pomo}i u le~enju,kao kod hiperholesterolemije,fenilketonurije23,celijakije24. Testiraju}i sebe,podnosilac zahteva testira i porodicu. Pitanje je da li je ponekad bolje za pacijenta da ne zna istinu.Recimo u slu~aju Hantingtonove bolesti,da li re}i ~oveku da }e oboleti od bolesti, kad ima jo{ nekoliko godina normalnog `ivota dok ne po~nu simptomi i progresivno ludilo? [to se ti~e biogoriva, upotreba kukuruza,soje i drugih poljoprivrednih kultura za proizvodnju etanola i biodizela je dovela do skoka cena ovih namirnica. Da li je moralno tro{iti hranu na proizvodnju biogoriva kada u pojedinim mestima vlada glad? Tra`e se alternativna re{enja(proizvodnja goriva pomo}u otpada,algi,bakterija). Tako|e farmeri kr~e {ume ne bi li pove}ali obradivo zemlji{te {to negativno uti~e na klimu i biodiverzitet. Brojne su eti~ke debate vezane za stem }elije. Za istra`ivanje embrionalnih stem }elija potrebna je destrukcija embriona. Me|utim potencijalna korist je velika.Nau~nici tra`e na~in da navedu }eliju da se diferencira u potrebne specijalizovane }elije ~ime bi se le~ila povreda mozga,ki~mene mo`dine,srca. 1997. Britanski geneti~ar Ian Wilmut i kolege su najavile ro|enje jagnjeta Dolly- prvog sisara koji je kloniran iz telesne }elije adulta. Da li je kloniranje ljudi eti~no? Kao slobodna individua vi posedujete svoj genom i nijedna vlada ga ne mo`e nacionalizovati i nijedna kompanija kupiti ali da li vam to daje za pravo da ga nametnete drugoj individui?Klon je druga individua.Ovca Dolly je umrla pre vremena od bolesti plu}a.Jedni ka`u da to nema veze sa tim {to je klon. Drugi veruju da su telomere25 ve} bile skra}ene,ona se “rodila stara” jer je klon starije ovce.

Patuljasti rast U ishrani se koriste namirnice sa smanjenom koli~inom fenilalanina. 24 U ishrani se koristi hrana bez glutena. 25 Telomera je region repetitivne DNK na kraju hromozoma.Ona {titi gene,a tokom sukcesivnih deoba se smanjuje.Nau~nici veruju da skra}enje telomera ima udela u starenju.
23

22

29

Slika 24.Ian Wilmut i Dolly

Ovo su samo neke od eti~kih dilema koje se neminovno pojavljuju kod primene biotehnologije. U nastavku rada bi}e prakti~no prezentovana PCR metoda kao i jedna od mnogobrojnih njenih primena. Ura|ena je amplifikacija segmenta DNK (dela gena za gametofitnu inkompatibilnost26) , kod 3 biljke , pomo}u specifi~nih prajmera. Realizaciju je omogu}io Institut za molekularnu genetiku i geneti~ko in`enjerstvo27 (IMGGI) u Beogradu.

26

U nekim familijama biljaka tokom evolucije javila se sposobnost da se onemogu}i samooplodnja, koja umanjuje geneti~ku raznovrsnost vrste. Tu sposobnost kontroli{u geni tzv. S-lokusa (odnosno njihovi aleli) a prepoznavanje i odbacivanje sopstvenog polena se odigrava na nivou gametofitne generacije. Ti aleli imaju veoma razli~itu sekvencu i du`inu, od jedinke do jedinke, tako da se S-lokus smatra za jedan od najpolimorfnijih u prirodi.

27

[arac-Sto{i} J.:Amplification of specific sequence of DNA by PCR method, Republi~ka smotra mladih talenata, Kladovo, 2003.

30

Materijal i metode rada:
Cilj rada: 1) Utvr|ivanje postojanja specifi~nih mesta vezivanja prajmera B i C za gen za inkompatibilnost kod izabranih uzoraka biljaka. 2) Odre|ivanje du`ine amplifikovanog dela genoma.

PCR(polymerase chain reaction)
Laboratorijski pribor i hemikalije Pribor: 4 ependorf epruvete pipetman 0,5-10 µl pipetman 20-200 µl stalak za ependorf epruvete nastavci za pipetman rukavice Koli~ina po reakciji (za jednu ependorf epruvetu) PCR pufer(komercijalni) - 2 µl Q solution(komercijalni) - 2 µl d NTP - 2 µl (200µM) Mg Cl2- 0,8 µl (1,5 mM) prajmer B - 1,2 µl (20 µM) prajmer C - 1,2 µl (20 µM) Taq - 0,1 µl (5u/µl) H2O - 9,7 µl ___________ × 4 ( za 4 ependorf epruvete ) genomska DNK -1µl. (50ng/µl) Uzorci: DNK iz 3 biljke iste vrste -Prunus tenella (stepski badem), obele`ene kao R1, R2, R3 Uzete su 4 sterilne ependorf epruvete. Stavljene su u stalak i obele`ene markerom (u na{em slu~aju uzorci su obele`eni kao R1 , R2 i R3). ^etvrta ependorf epruveta (0) predstavlja master mix i u nju se ne stavlja uzorak. Hemikalije su izme{ane u master mix ependorf- epruveti, u koli~ini za 4 reakcije. Hemikalije su stavljane slede}im redosledom : H2O, PCR buffer, Q solution, MgCl2, dNTP, specifi~ni prajmeri i Taq. Sme{a je zatim pipetmanom ravnomerno podeljena u 4 ependorf- epruvete. U R1 ependorf- epruvetu stavljena je odre|ena koli~ina uzorka R1, u R2 uzorka R2, u R3 uzorka R3 , dok se u 0 ne stavlja uzorak, ve} ona sadr`i samo ranije napravljenu sme{u. Ependorf epruvete su stavljene u centrifugu radi spu{tanja kapljica na dno. Zatim su ependorf epruvete stavljene u termocikler, gde je ukucan program za inkubaciju (vreme i temperatura denaturacije , vreme i temperatura hibridizacije, vreme i temperatura elongacije, broj ciklusa). 30 minuta pre zavr{etka inkubacije napravljen je 2% agarozni gel , u koji je dodato 1,5µl etidijum bromida. Gel je jo{ u te~nom stanju sipan u kalup ure|aja za elektroforezu. Kada za elektroforezu je zatim napunjena 1× 31

TAE28 puferom. Kada se gel ohladio i postao `elatinast, u prethodno napravljena udubljenja je sipan uzorak koji je, nakon {to je izva|en iz thermocycler-a , pome{an sa bojom. Nakon {to je obojeni uzorak sipan u rupice u gelu, kadica sa gelom i puferom je zatvorena , ure|aj je uklju~en i pristupilo se elektroforezi. Posle 30 minuta gel sa uzorcima, koji su se u me|uvremenu udaljili od po~etnog polo`aja u zavisnosti od veli~ine DNK molekula, je pregledan u mra~noj sobi pod UV svetlom. Zatim je CCD kamerom fotografisan i rezultati su od{tampani ( sl.3. )[9].

Slika 2. Termocikler

Mikrotuba

Rezultati istra`ivanja i diskusija O~itavanjem rezultata sa fotografije do{lo se do zaklju~ka da su prajmeri prona{li komplementarnu sekvencu, hibridizovali sa njom, i do{lo je do amplifikacije `eljenog segmenta DNK.To zna~i da odabrane biljke poseduju neke od alela gena za inkompatibilnost i da su stoga verovatno u stanju da onemogu}e oplodnju sopstvenim polenom. U suprotnom, prajmeri B i C, specifi~ni za alele ovog gena, ne bi hibridizovali, ne bi bilo produkta reakcije i i ne bi postojala traka na gelu. Upore|ivanjem veli~ina amplifikovanih DNK uzoraka sa standardom do{lo se do zaklju~ka da se du`ine umno`ene DNK uzoraka R1 i R2 poklapaju i iznose otprilike 1000bp i 850bp dok se du`ine umno`ene DNK uzorka R3 ne{to razlikuju i iznose malo vi{e od 1000bp i oko 400bp .U kontroli-0 (uzeta iz ependorf epruvete master mix) nismo dobili traku {to zna~i da reakcija nije bila kontaminirana.Po{to je u pitanju gen za koji postoji jako mnogo alela (izuzetno polimorfan gen), ~injenica da dve biljke imaju razli~ite alele iste du`ine mo`e da upu}uje na to da su one geneti~ki srodne. Takva mogu}nost mogla bi se dalje izu~iti jedino testiranjem vi{e polimorfnih regiona DNK PCR reakcijom. Ako bi u svakoj takvoj PCR reakciji ove biljke imale produkte iste du`ine, mogli bismo zaklju~iti da su one verovatno geneti~ki klonovi, nastali, na primer vegetativnim razmno`avanjem. Naravno, treba naglasiti da identi~na du`ina amplifikata ne zna~i i identi~nu sekvencu nukleotida. Potpuna potvrda identi~nosti nekog geneti~kog koda radi se daleko skupljom tehnikom- sekvenciranjem DNK.

28

TRIS-acetat-EDTA(TAE) pufer

32

Slika 3. Agarozna gel elektroforeza produkata PCR amplifikacije dela genoma uzoraka R1, R2 i R3

Zaklju~ak ♣ Biljke R1, R2 i R3 imaju sekvencu komplementarnu B i C prajmerima, odnosno imaju gene za inkompatibilnost. ♣ R1 i R2 biljke su mo`da geneti~ki srodne {to bi se moglo dalje ispitati. Acknowledgment: Special thanks to my family, friends and all my teachers for support and guidance through the beautiful world of science. Special thanks to Marc Anderson who demanded from me to do my best., and Sacha Martin :) ..qui a corrigé mon résumé en
français. Literatura: 1)[arac-Sto{i} J.:Amplification of specific sequence of DNA by PCR method, Republi~ka smotra mladih talenata, Kladovo, 2003. 2)[arac-Sto{i} J: Sex determination in human fetuses by PCR method, Republi~ka smotra mladih talenata,Kladovo, 2004. 3)[arac-Sto{i} J: Lacteal Acid Bacteria (LAB) and their importance in nature, Republi~ka smotra mladih talenata, Kladovo,2002. 4)[arac-Sto{i} J: Viruses,Republi~ka smotra mladih talenata,Kladovo, 2001. 5)[arac-Sto{i} J: Genetika I, Beograd,2005. 6)Campbell N.,Reece J.:Biology,7th ed, 2005.Pearson Education: Benjamin Cummings 7) Griffiths A. J. F., Miller J. H., Suzuki D. T., Lewontin R. C., Gelbart W. M.: An introduction to genetic analysis,7th ed. New York,2000.,W. H. Freeman and Company 8)Tuci} N: Evolucija, ~ovek i dru{tvo. Beograd,1999.,Dosije, Alternativna akademska obrazovna mre`a. 9)Mueller R. F., Young I. D.: Emery’s elements of medical genetics.Churchill Livingstone 2001. 10)Ridli M.: Genom: Autobiografija vrste u 23 poglavlja. Beograd,2001.,Plato. 11)Romac S., Vukosavi} S., Stojkovi} O., ^uljkovi} B.: PCR u klini~koj dijagnostici. Beograd: Biolo{ki fakultet 1999., PCR Centar. 12)Voet D.,Voet J.: Biochemistry,3rd ed.,USA 2004.,John Wiley&sons,inc. 13) Thibodeau A.G.,Patton T.P:Anatomy&Physiology,5th ed,2003.,Mosby 14) Mihailovi} M. B.: Biohemija, IV izdanje. Beograd,2000.,Nau~na. 15)D`. K. Born jr, National Geographic-Serbian ed., 10(2007)35
Tel +381644743419

33

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->