P. 1
Bioloska_kemija-skripta-2010-2011

Bioloska_kemija-skripta-2010-2011

|Views: 2,703|Likes:

More info:

Published by: Aleksandra Radonjić on Dec 12, 2010
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

08/13/2014

pdf

text

original

BIOLOŠKA KEMIJA

Praktikum

Jerka Dumić Sanja Dabelić Olga Gornik Gordana Maravić Vlahoviček Ruđer Novak Sandra Šupraha Goreta

Farmaceutsko-biokemijski fakultet Sveučilišta u Zagrebu Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju Zagreb, 2010.

Urednik

Prof. dr. sc. Jerka Dumić

Recenzenti
Prof. dr. sc. Karmela Barišić Prof. dr. sc. Jasna Lovrić

J. Dumić i sur., Biološka kemija Praktikum; ur. J. Dumić, izdavač Sveučilište u Zagrebu, Farmaceutsko-biokemijski fakultet, Zagreb 2010.

ISBN 978-953-6256-61-7
CIP zapis dostupan u računalnom katalogu Nacionalne i sveučilišne knjižnice u Zagrebu pod brojem 744598
Slika na naslovnici: prostorna struktura ljudskog deoksihemoglobina pri rezoluciji 1,74 Å. Slika preuzeta iz proteinske baze podataka RCSB PDB.

Umnožavanje, preslike ili pretisak nisu dopušteni bez odobrenja autora.

BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM

Sadržaj (sekvenciranje
Vježba 1. Potenciometrijska titracija aminokiselina ............................................................... 1 Vježba 2. Gel-filtracija hemoglobina ....................................................................................... 10 Vježba 3. Pročišćavanje imunoglobulina G iz humanog seruma ....................................... 15 Vježba 4. Enzimska kinetika .................................................................................................... 24 Dodatak: Enzimska kinetika ..................................................................................................... 30 Vježba 5. Ugljikohidrati ............................................................................................................ 39 Vježba 6. Lipidi. ......................................................................................................................... 46 Vježba 7. Termička denaturacija DNA ................................................................................... 51

BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM

Vježba 1. Potenciometrijska titracija aminokiselina (sekvenciranje
1.1 Aminokiseline Aminokiseline su α-amino-α-karboksilne kiseline. Na Cα-atom je uz amino (-NH2) i karboksilnu skupinu (-COOH) vezan vodikov atom (-H) te bočni ogranak (-R) (Slika 1.1). Upravo stoga sve aminokiseline osim glicina (kojem je R = H) imaju asimetrični Cαatom, a u organizmu su prisutne samo lijeve (L) aminokiseline. Bočni ogranci aminokiselina strukturno su raznoliki, od jednostavnih alifatskih struktura (alanin, valin, leucin), aromatskih (fenilalanin, tirozin, triptofan), do cikličkih (prolin, koji ujedno jedini od aminokiselina sadrži sekundarnu amino skupinu), ili pak onih koje u bočnom ogranku sadrže sumpor (metionin, cistein), kisik (treonin, serin, tirozin), dušik (asparagin, glutamin, arginin, histidin) ili karboksilnu skupinu (asparaginska i glutaminska kiselina) (Tablica 1.1). Upravo je strukturna raznolikost aminokiselina ključan preduvjet raznolikosti polipeptida (proteina) koji nastaju povezivanjem aminokiselina peptidnom vezom. Peptidna veza, koja je zapravo amidna veza, nastaje uvijek povezivanjem α-karboksilne skupine jedne s α-amino skupinom druge aminokiseline. Time su polipeptidni lanci kao i sve biološke molekule usmjerene molekule (od N-kraja prve prema C-kraju posljednje amninokiseline u lancu), dok su peptidne veze smjera C-kraj – N-kraj (Slika 1.2). Svi do danas otkriveni proteini izgrađeni su od 20 aminokiselina koje stoga nazivamo proteogenim aminokiselinama.
R H3N
+

Cα H

COOH

Slika 1.1 Opća strukturna formula aminokiselina pri pH 1. Preuzeto i

prilagođeno iz (1).
Slika 1.2 Stvaranje peptidne veze.

Preuzeto i prilagođeno iz (1).

1.2 Fizikalno-kemijska svojstva aminokiselina Aminokiseline, a time i proteini kao i neke druge biološke molekule, primjerice nukleinske kiseline, poliprotonske su kiseline. Svaka skupina koja može disocirati (-COOH, -NH3+, =NH2+, -OH, -SH) opisana je konstantom disocijacije Ka, odnosno pKa (-log Ka). Sve aminokiseline u svojoj strukturi imaju najmanje dvije takve skupine: αamino (pKa ∼2,2) i α-karboksilnu skupinu (pKa ∼9,4). To znači da će pri pH > 3,5 αkarboksilna skupina biti gotovo u potpunosti deprotonirana, dok će α-amino skupina pri pH < 8 biti protonirana, odnosno da su i α-amino i α-karboksilna skupina svih aminokiselina u fiziološkom pH području u potpunosti ionizirane (Slika 1.3).
1

76 149.31 204.2 2.1 2.02 8.46 9.2 2. Ime.8 146.33 181.32 2.17 9.2 2.09 9.1 2.13 9.2 2.2 2.13 121.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ Tablica 1.33 2.28 115.34 9.2 1.1 Popis proteogenih aminokiselina (struktura.78 89.2 9.95 10.1 1.64 165.29 2. troslovni i jednoslovni simbol Nepolarne aminokiseline Glicin Gly G Alanin Ala A Valin Val V Leucin Leu L Izoleucin Ile I Metionin Met M Prolin Pro P Fenilalanin Phe F Triptofan Trp W Strukturna formula a Mr pKa1 α-COOH pKa2 α-NH3+ pKaR bočni ogranak 75.74 131.2 2.41 Polarne neutralne (nenabijene) aminokiseline Serin Ser S Treonin Thr T Asparagin Asn N Glutamin Gln Q Cistein Cis C Tirozin Tyr Y 2 105.87 117.1 2.1 2.07 .20 9. pKa vrijednosti funkcionalnih skupina). Mr.74 131.1 2.10 132.71 10.1 2.2 2.15 119.11 10. Preuzeto i prilagođeno iz (1).78 8.35 9.21 9.

amidnu skupinu (-CO-NH2) – asparagin i glutamin.53 174. Bočni ogranci nepolarnih aminokiselina izgrađeni su isključivo od ugljika i vodika.18 8.82 9.3 Opća strukturna formula aminokiselina pri fiziološkom pH. 3 .1).67 4. Zbog tog svojstva da istovremeno mogu primiti proton (kiseline). tirozin. Asp D Glutaminska kis. prije svega disocijacijskih svojstava bočnih ogranaka. u kojem molekula ima skupine suprotnih naboja nazivamo dipolarnim ionima ili "zwitterionima“. Preuzeto i prilagođeno iz (1).86 147.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM Tablica 1.5.19 9.2 2. Takav oblik. treonin. uz iznimku bočnog ogranka metionina koji sadrži sumpor (R = -CH2-CH2-S-CH3) i triptofana koji sadrži dušik u indolnom prstenu.17 9. Polarne amninokiseline u bočnom ogranku sadrže polarne skupine.48 Prikazani ionski oblici prevladavaju pri pH 7.2 2. ali i otpustiti proton (baze) aminokiseline smatramo amfoternim molekulama.2 1.1 2. troslovni i jednoslovni simbol Strukturna formula Mr pKa1 α-COOH pKa2 α-NH3+ pKaR bočni ogranak Polarne nabijene aminokiseline Kisele aminokiseline Asparaginska kis.0 146. dok se polarne još dijele na nenabijene (neutralne) i nabijene. primjerice hidroksilnu (-OH) – serin. ili sulfhidrilnu skupinu (-SH) – cistein.1 2.0 12.25 155. koje mogu biti ili kisele ili bazične (Tablica 1.09 9.17 6. Slika 1. Na temelju fizikalno-kemijskih. Cα-atomi (osim u glicinu) i oni označeni zvjezdicom su kiralni centri.95 10. Glu E Bazične aminokiseline Histidin His H Lizin Lys K Arginin Arg R a 133. odnosno amfolitima. aminokiseline su podijeljene na nepolarne i polarne. Izoelektrična točka (pH vrijednost pri kojoj je ukupni naboj molekule jednak nuli) tih aminokiselina je oko 5.1 (nastavak) Ime. a pri fiziološkom pH su u obliku „zwitteriona“.82 3.

0 2.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ Skupine u bočnom ogranku dviju od ovih aminokiselina (tirozin i cistein).4.18 8. odnosno konjugirane kiseline. a njihova izoelektrična točka (pI) je oko 5. primjerice lizinu (R = -CH2CH2CH2CH2NH3+).0 mol NaOH / mol AK 3. 4 . doći će do niza protonskih disocijacija (disocijacija protona aminokiseline lizina prikazana je na slici 1. u lužnatom mediju mogu disocirati (pKa fenilne skupine –C6H4OH tirozina iznosi 10.95 10. Preuzeto i prilagođeno iz (2). ili guanidino skupinu – arginin. poliprotonske kiseline. Pri fiziološkom su pH ipak sve polarne aminokiseline neutralne (bočni ogranak im je nenabijen).53 AK2+ AK+ AK0 AK- Slika 1. dodajemo kiselinu doći će do protoniranja. pH 14 12 pK3 10 8 6 4 pK1 2 0 0 1. Polarne nabijene aminokiseline podijeljene su na kisele (u bočnom ogranku sadrže karboksilnu skupinu – asparaginska i glutaminska kiselina) i bazične (u bočnom ogranku sadrže ili amino skupinu – lizin. Otapanjem izoelektričnog oblika aminokiseline u vodi pH takve otopine imat će pH koji odgovara pI te aminokiseline.37). odnosno bazičnom području. odnosno ako dodajemo lužinu. Aminokiseline su. a pri fiziološkom pH su konjugirane baze. a sulfidrilne skupine –SH cisteina 8.0 pK2 pI 2.46. dakle.4 Titracija lizina jakom lužinom.5. ili imidazolni prsten – histidin) na temelju toga što su im pI vrijednosti u kiselom. pa ako takvoj molekuli.

95 i 10.8. promjena pH izazvana dodatkom određene količine kiseline ili lužine bit će to manja.34) i amino skupinu (pKa = 9. odnosno pH= pKa + log [A-] [HA] Kapacitet pufera ovisi i o njegovoj koncentraciji. Otopina koja se opire promjeni pH poznata je kao puferska otopina. odnosno [AK0] = [AK-].78 pKa2 NH2CH2CO2– -1 ukupan naboj 0 Titriracijom glicina doći će do disocijacije protona u dva koraka. S obzirom na to da pKa odgovara onoj vrijednosti pH pri kojoj je količina disociranog i nedisociranog oblika jednaka. 5 .iona koji dodani sustavu smanjuju ili povećavaju pH za jednu jedinicu.iona dolazi do preuzimanja protona od strane HA pri čemu nastaju H2O + A. Kod neutralnog pH glicin je u "zwitterionskom" obliku. dakle što je puferska otopina koncentriranija.53) dovoljno razlikuju da titracijska krivulja jasno pokazuje pojedinačne disocijacijske korake.5. Očekujemo da će pri određenom pH koncentracija pozitivnih i negativnih naboja biti jednaka. Taj pH poznat je pod imenom izoelektrična točka.5 ekvivalenta baze. To slijedi izravno iz definicije konstante disocijacije izražene u logaritamskom obliku koji je poznat pod imenom Henderson-Hasselbalchova jednadžba.biti dobar pufer oko neutralnog pH. + NH3CH2CO2H +1 2. ako znamo pKa1 i pKa2. Puferi su prema definiciji smjese slabih kiselina ili baza i pripadajućih im soli. očekujemo da će svaki disocijacijski korak stvoriti svoje pufersko područje. Ako je pKa za disocijaciju protona 6. u sposobnosti A.ione. prilikom dodatka OH. Uz isti omjer koncentracija HA i A-. a jednaki su samo kada je pH = pKa i tada on ima maksimalnu vrijednost (maksimalni puferski kapacitet). Tada je [AK2+] = [AK+]. što su koncentracije [HA] i [A-] veće. Djelovanje pufera sastoji se.78). dakle.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM U tom se primjeru pKa (-log Ka) vrijednosti (2.18. Tako glicin ima karboksilnu skupinu (pKa = 2. Možemo je izračunati. 1.34 pKa1 + NH3CH2CO2– "zwitterion" 9. U tim točkama dodatak baze izaziva najmanju promjenu pH. tada će smjesa HA i A. Nagib titracijske krivulje je minimalan pri dodatku 0. Puferski kapacitet definira se kao broj molova H+ ili OH.5 odnosno 2. Glicin je amfoterni elektrolit jer do disocijacije protona dolazi i u kiseloj i u bazičnoj sredini.iona da preuzmu dodane H+ ione i stvore HA te na taj način ublaže promjenu pH. odnosno [AK+] = [AK0]. Ka= [H+] [A-] [HA] . Kod aminokiselina postupna se ionizacija zbiva na kemijski različitim skupinama. čime se puferska otopina opire promjeni pH. S druge pak strane. 8. Puferski kapaciteti nekog pufera u kiselom i u baznom smjeru mogu biti različiti.

+ H+ 3 2 2 NH2CH2CO2 + H+ Ka 2 = [NH 2 CH 2 CO -2 ][H + ] [ + NH 3CH 2 CO -2 ] Ka 1 × Ka 2 = [ + NH 3CH 2CO -2 ][H + ] [NH 2 CH 2 CO -2 ][H + ] × + [ + NH 3CH 2CO 2 H] [ NH 3CH 2 CO -2 ] - U izoelektričnoj točki [ NH3CH2CO2H] = [NH2CH2CO2 ]. Iz grafa očitajte pKa vrijednosti. a potom i bazom. pa je + Ka 1 × Ka 2 = [H + ]2 log Ka 1 + log Ka 2 = log [H + ]2 (pKa1 + pKa 2 ) = pI 2 pH = pH izoelektrične točke obično označavamo simbolom pI. Kod glutaminske će kiseline.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ +NH C H C O H 3 2 2 +NH CH CO 3 2 2 Ka 1 = [ + NH 3CH 2 CO -2 ][H + ] [ + NH 3CH 2CO 2 H] +NH C H C O . Izoelektrična točka nalazit će se u onom području pH. odnosno (pKa1 + pKaR) / 2. primjerice. pI vrijednost te ekvivalente dodane kiseline. To se može lako dokazati (učinite to za vježbu!). odnosno lužine na osnovi kojih ćete izračunati Mr nepoznate aminokiseline iz uzorka. Općenito možemo reći da je pI jednak aritmetičkoj sredini pKa vrijednosti onih disocijacijskih reakcija u kojima izravno sudjeluje zwitterionski oblik. 1. pI za glicin je prema tome (2. Ako molekula ima više od dvije ionizacijske skupine.34 + 9. 6 . pI biti 3. Udio dvostruko negativnog molekularnog oblika pri tom je pH zanemariv.23. disocijacija protona odvija se u više koraka.3 Zadaća Titrirajte otopinu izoelektrične aminokiseline kiselinom. Na temelju krivulje dobivene potenciometrijskom titracijom uzorka odredite o kojoj se aminokiselini radi. pI će kao i u prethodnom primjeru biti jednak onom pH kod kojeg je koncentracija molekularnog oblika s jednim pozitivnim nabojem jednaka koncentraciji molekulske vrste s jednim negativnim nabojem. u kojem je zwitterionski oblik molekule dominantna vrsta.06.78) / 2 = 6.

4 Reagencije • • • 0. Elektrodu isperite vodom i obrišite te je potom uronite u čistu čašu u koju ste stavili novih 40 mL uzorka i magnet i postavili je na miješalicu.2 M HCl u dest. • Kombiniranu elektrodu prethodno uključenog i baždarenog pH-metra izvadite iz zasićene otopine KCl.2 M otopinom HCl. vodi otopina izoelektrične aminokiseline (3 g/L destilirane vode) 1.2 M otopinom NaOH te je postavite tako da možete titrirati uzorak u koji je uronjena elektroda u čaši na miješalici. 1. 3 g/L) te u nju stavite magnet. očitajte ga i zabilježite. što se očituje kao promjena pH otopine aminokiseline. • Titrirajte sadržaj u čaši 0. Nakon svakog dodatka lužine pričekajte da se pH ustali. Pazite da elektrodu uronite dovoljno duboko u otopinu. odnosno deprotoniranja njenih funkcionalnih skupina.2 mL). odnosno čim kraće vrijeme ostavljati na zraku. • Napunite biretu od 25 mL 0. lagano obrišite staničevinom i uronite u čašu s uzorkom. vodi 0.7 Postupak • U čašu od 100 mL dodajte 40 mL uzorka (otopina izoelektrične aminokiseline. Postavite čašu na magnetsku miješalicu tako da se magnet lagano okreće. ali tako da je magnet ne može udariti.5 Pribor • • • • • • • • • • • • pH-metar kombinirana elektroda magnetska miješalica magnet bireta za HCl (25 mL) bireta za NaOH (25 mL) stalak za birete s nastavkom pipete čaša od 100 mL odmjerne tikvice staničevina milimetarski papir 1. • Po završetku titracije izvadite elektrodu i magnet iz čaše. Lužinu dodajte u malim obrocima (0.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM 1. isperite je destiliranom vodom. kako bi grafički prikaz titracije sadržavao što više eksperimentalnih točaka. Napomena: poželjno je elektrodu pH-metra čim prije uroniti u otopinu. a uzorak koji ste titrirali bacite.1-0.2 M otopinom NaOH iz birete. • Na već opisani način titrirajte uzorak 0.6 Načelo postupka Dodatkom jake kiseline ili lužine u otopinu izoelektrične aminokiseline dolazi do protoniranja. 7 .2 M NaOH u dest.

+ COOH Cl H3 N + COO H3 N + - COO Na H H2 N C H H C H H C H glicin hidroklorid (AK+) izoelektrični glicin (AK0) natrijev glicinat (AK-) 8 . pa pH opet odgovara pKa). pa će se tako na titracijskoj krivulji aminokiseline s 2 funkcionalne skupine (koje u bočnom ogranku nemaju skupinu koja može disocirati) razaznati 2 platoa.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ • Skicirajte titracijsku krivulju te je interpretirajte na temelju uputstava koja slijede: Početni pH otopine (prije dodatka kiseline ili lužine) nepoznate aminokiseline u izoelektričnom obliku odgovara njenoj izoelektričnoj točki (pI). Na temelju podataka o broju funkcionalnih skupina. Pri kojem je pH puferski kapacitet dva puta veći u lužnatom nego u kiselom smjeru? 2. Postupnim dodatkom malih volumena kiseline ili lužine dolazi do promjene pH otopine što se mjeri pH-metrom. a 50% protonirano (pH = pKa). Na temelju određene količine (broja molova) i poznate mase nepoznate aminokiseline koja je otopljena u volumenu uzetom za titraciju moguće je izračunati njenu molekulsku masu. Glicin se često upotrebljava kao pufer. odnosno same aminokiseline.). Platoi na krivulji odgovarat će puferskom području (oko pKa) pojedine funkcionalne skupine. izoelektričnog glicina ili natrijevog glicinata.iona koja je ekvivalentna količini (molovima) te funkcionalne skupine. pKa vrijednosti i molekulske mase može se odrediti o kojoj se aminokiselini radi. a 50% još uvijek protonirano. Unošenjem podataka o dodanom volumenu kiseline ili lužine (na os apscisu) i izmjerenom pH (na os ordinatu) moguće je skicirati titracijsku krivulju aminokiseline.8 Zadaci 1.E. odnosno same aminokiseline (pH = točka ekvivalencije. Volumen dodane kiseline ili lužine potreban da se pojedina funkcionalna skupina prevede iz deprotoniranog oblika u protonirani ili obrnuto sadrži količinu (molove) H+ ili OH. Komercijalno ga možemo nabaviti u obliku glicin hidroklorida. Isto vrijedi i za dodatak lužine samo što tada u potpunosti protoniran oblik funkcionalne skupine prevodimo u oblik kada je 50% skupine deprotonirano. dok će se na titracijskoj krivulji aminokiseline s 3 funkcionalne skupine (koje u bočnom ogranku imaju skupinu koja može disocirati) razaznati 3 platoa. taj volumen sadrži polovinu količine (molova) te funkcionalne skupine. T. Ukoliko na krivulji odredimo volumen dodane kiseline potreban da se pojedina funkcionalna skupina prevede iz deprotoniranog oblika u oblik kada je 50% skupine još uvijek deprotonirano. 1.

05 M glicinskog pufera pri pH 9.1 dodali 0. ponestalo vam je glicina u zalihama.5. Voet. Canada: Brooks/Cole Cengage Learning. C. J.H. 6.5 M HCl (zanemarite promjenu volumena) (pKa = 4.1 M puferske otopine glicina.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM 3.9 Literatura 1. New York: John Wiley & Sons Inc.1 mL 1 M HCl (zanemarite promjenu volumena) (pKa = 8. and Voet. Pretpostavite a) da je pufer priređen titracijom izoelektričnog glicina otopinom NaOH b) da je pufer priređen titracijom glicin hidroklorida otopinom NaOH. Nažalost. ali ste uspjeli pronaći dvije 0. Izračunajte konačni pH otopine ako ste u 500 mL 0.7).0 i drugu s pH = 9.5 M acetatnog pufera pH 5 dodali 1 mL 0.78. 9 . 2. Garrett. Koji volumen svake od ovih dviju otopina morate pomiješati kako biste dobili 100 ml željenog pufera? 1. jednu s pH = 9. 5. and Grisham.M.2. D. Izračunajte konačni pH otopine ako ste u 250 mL 0. (1995) Biochemistry. Izračunajte ionsku jakost 0.1). (1999) Biochemistry.02 M Tris/Cl pufera pH 8.1 M glicinski pufer pH = 9. potreban vam je 0. R. 4. U svrhu pročišćavanja određenog proteina. Skicirajte titracijsku krivulju glutamilserilglutamilvalina.

U osnovnoj izvedbi.1). a unutar njih prostor ispunjen gel-tekućinom. Kod kromatografije ionske izmjene. Gel-filtracija hemoglobina 2. niti nose električni naboj. Ovdje se razdvajanje temelji na različitoj brzini putovanja molekula ovisno o njihovoj veličini. 10 . kolona za gel-filtraciju sazdana je od inertnih zrnaca koja ne stupaju u interakciju s analitom. Tekućinska kromatografija u koloni podrazumijeva pokretnu fazu (otapalo) i stacionarnu fazu u staklenoj. plastičnoj ili metalnoj koloni. kromatografije obrnute faze i afinitetne kromatografije pojedine komponente ostavaruju interakcije sa zrncima gela ovisno o svom naboju. dok male molekule prodiru u zrnca usporavajući svoje putovanje (Slika 2.1 Gel-filtracija Jedna od osnovnih zadaća preparativne i analitičke biokemije je odjeljivanje i identifikacija bioloških molekula. ne reagiraju s uzorkom. a sadržaj i koncentracija pojedine tvari u sakupljenim se frakcijama određuje naknadno. odnosno zrnca kromatografskog materijala. mogu biti inertna ili mogu stupati u interakciju s analitom. Punjenje kolone.1 Prikaz molekularnog prosijavanja tijekom gel-filtracije. odnosno ne vežu se. Suprotno tome. aparaturu za kromatografiju čini samo kolona punjena kromatografskim materijalom. polarnosti ili afinitetu za ligand te se tako odjeljuju od ostalih komponenti iz uzorka. Uzorak se nanosi na kolonu koja se potom ispire puferom. Između zrnaca gela nalazi se intersticijska tekućina.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ Vježba 2. Kod gel-filtracije velike molekule ne mogu prodrijeti kroz pore i ući u zrnca gela pa brzo putuju intersticijskom tekućinom. Za odjeljivanje se često koriste kromatografske metode kod kojih se smjesa tvari otopljena u pokretnoj fazi (koja može biti tekućina ili plin) razdvaja na sastavnice propuštanjem kroz stacionarnu fazu (najčešće čvrsti polimer). male molekule velike molekule porozna zrnca gela (stacionarna faza) Slika 2.

Hem je izgrađen od organskog dijela. protoporfirina IX. no dostupni su u širem rasponu veličine pora. Stoga se krupna zrnca primjenjuju za velike preparacije kod kojih je brzina važnija od razlučivanja. Volumen dostupan pojedinoj molekuli obrnuto je razmjeran njenoj veličini. Kako je atom željeza heksakoordiniran u hemu. a time je separacija uzorka slabija. Količina pufera potrebna da neka molekula izađe iz kolone naziva se volumen ispiranja. neproteinska komponenta neophodna za biološku aktivnost hemoglobina. a na svaki globinski lanac vezana je po jedna molekula hema koji veže kisik. najzastupljeniji hemoglobin u krvi odraslih osoba. Kada se putem šestog koordinativnog mjesta veže kisik (oksigenacija) nastaje svijetlo crveni oksihemoglobin (HbO) koji nalazimo u arterijskoj krvi. sitna zrnca za većinu preparativnih postupaka. Raspon masa molekula koje je moguće odijeliti određenim kromatografskim materijalom za gel-filtraciju određen je veličinom njegovih pora. a za njima kasnije izlaze manje molekule koje putuju i kroz pufer izvan zrnaca gela i kroz pufer unutar zrnaca. sitna i vrlo sitna). odnosno vrlo velike molekule putuju kroz pufer izvan zrnaca gela i prve izlaze iz kolone.2). dok su tijekom intrauterinog života prisutni embrijski (2 α-lanca i 2 ε-lanca. Poliakrilamidne gelove čine umreženi akrilamid i N. α2δ2). U krvi odraslih osoba postoji i manje zastupljen hemoglobin A2 (2 α-lanca i 2 δ-lanca.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM Ukupni volumen tekućine u koloni jednak je zbroju volumena pufera izvan i pufera unutar zrnaca gela. 2. Zrnca za gel-filtraciju su umreženi polimeri. a vrlo sitna zrnca koriste se u analitičke svrhe kada je potrebno maksimalno razlučivanje. nastaje methemoglobin koji je 11 . Fe3+. Dekstran je polisaharid sastavljen od monomera glukoze. srednja. naziva se deoksihemoglobin. peto koordinativno mjesto uvijek popunjava elektronski par dušika iz histidinskog ogranka polipeptidnog lanca (His93). sastoji se od dva α-lanca i dva β-lanca (α2β2). Sama zrnca kao i pore u njima mogu biti različite veličine. a četiri proteinska lanca tetraedarski su raspoređena.6-anhidro-L-galaktoze umrežen vodikovim vezama. u čijem je središtu atom željeza koordinativnim vezama povezan sa četiri atoma dušika iz pirolovih prstena protoporfirina (Slika 2. tamno crveni je oblik Hb. Hemoglobin A.2 Hem i hemoglobin Hemoglobin (Hb) je izgrađen od proteinskog i neproteinskog dijela. što je korisno za odjeljivanje velikih proteina ili dugih linearnih molekula (DNA. što su zrnca krupnija pakiranje kromatografskog materijala je rjeđe pa je brzina protoka veća. kod kojeg je šesto koordinativno mjesto prazno. Proteinski dio hemoglobina sastoji se od četiri polipeptidna lanca povezana nekovalentnim interakcijama (kvarterna struktura). No pored veličine pora. dok šesto mjesto može biti prazno ili popunjeno. α2ε2) i fetalni oblici (2 αlanca i 2 γ-lanca. agarozu i poliakrilamid. RNA). njegovo je važno svojstvo i veličina zrnaca gela (krupna. Agaroza je linearni polimer D-galaktoze i 3. Svaka podjedinica hemoglobina sadrži po jedan hem. Po svojstvima pri odjeljivanju slični su dekstranu.N-metilenbisakrilamid. a razlikujemo tri osnovna tipa: dekstran. prostetičku skupinu smještenu u procjepu blizu površine molekule. Molekula hemoglobina gotovo je kuglasta. prisutan u venskoj krvi. Hemoglobin. Pore na zrncima su mnogo veće nego kod dekstrana. To je specifična. α2γ2). Ukoliko se hemoglobinsko željezo oksidira iz Fe2+ oblika u trovalentni oblik.

Potom se eritrocitima doda 7 volumena hipotonične otopine. 2. Nakon vađenja.1 Priprema otopine deoksihemoglobina Krv se izvadi venepunkcijom u vacutainer-epruvetu koja sadrži antikoagulans. poznat pod engleskim nazivom buffy coat). Plazma i leukociti s tromobocitima se otpipetiraju i bace. Preostale dvije koordinativne veze povezuju ogranak histidina i molekularni kisik. Supernatant se baci i postupak pranja se ponovi još dva puta. odnosno destilirane vode. Nakon centrifugiranja 10 minuta pri 13000g i 4°C na dnu epruvete se nalazi debris stanica. a supernatant koji predstavlja uzorak otopine deoksihemoglobina se otpipetira i pohrani na -20°C do daljnje uporabe. Graña hemoglobina. a zatim oksigenirati otopljenim 12 . Ispiranje se provodi tako da se eritrocitima doda jednaki volumen fiziološke otopine. C) Struktura Fe-protoporfirina IX. Ovaj oblik ima veliki afinitet vezanja negativnih iona. ali i neutralnih molekula s izraženim dipolnim momentom.8 mg/mL krvi.2. Vacutainer-epruvete mogu biti različitih volumena i namjena. Eritrociti se potom tri puta isperu fiziološkom otopinom. Gel-filtracijom razdvojite smjesu feri/ferocijanida i methemoglobina. epruveta se lagano promućka i ponovno centrifugira 10 minuta pri 600g i 4°C. B) Aktivno mjesto hemoglobina: Fe-atom leži u ravnini u kojoj su uspostavljene četiri koordinativne veze s atomima porfirinskog dušika. Ubrzo nakon miješanja dolazi do hemolize.3 Zadaća Priredite otopinu methemoglobina dodatkom kalijevog fericijanida u otopinu hemoglobina. krv se centrifugira 10 minuta pri 600g i 4°C kako bi se razdvojili eritrociti (donji crveni sloj) od plazme (gornji prozirno žuti sloj). A) B) C) Slika 2. Protein će daljnjim prolazom kroz gel reagirati s prethodno unijetim Fe(II) reagensom uslijed čega će se reducirati u deoksihemoglobin.2. 2. Između navedena dva sloja čiji su volumeni približno jednaki nalazi se vrlo tanak sloj leukocita i tromobocita (bijele boje. pa umjesto kisika veže vodu. Epruvete koje sadrže K2EDTA ili K3EDTA kao antikoagulans standardno su označene ljubičastim čepom.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ smeđe boje. Prilikom vađenja krvi zbog razlike u tlakovima u epruvetu ulazi točno određeni volumen krvi tako da je konačna koncentracija EDTA 1. A) Tetramerna struktura hemoglobina.

Na kolonu prvo nanesite 0. Dodajte sasvim mali kristal fericijanida i protresite epruvetu. Postupna zbivanja tijekom prolaza proteinske frakcije kroz kolonu pratit će karakteristične promjene boje.5 Pribor • • • • • • • • • • • • • • staklena kolona.6 Načelo postupka Gel-filtracijom se smeđi methemoglobin razdvaja od puno manjih iona kalija. • U drugoj epruveti pomiješajte 0. pH 7 80 mM FeSO4 u 0. • Uzorak (otopinu deoksihemoglobina) razrijedite u epruveti puferom u volumnom omjeru 1+4 (70 μL krvi + 280 μL pufera).BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM molekularnim kisikom. pH 7 80 mM EDTA u 0. vodi kalijev fericijanid Sephadex G-25 2. 13 . 10 cm. fericijanida i ferocijanida.2 M natrijevom fosfatnom puferu.7 Postupak • Stezaljkom podesite protok pufera kroz staklenu kromatografsku kolonu u staklenu čašu na 30 kapi u minuti.1 mL otopine FeSO4 i 0. 2. φ=1 cm gumeni nastavak za kolonu sa stezaljkom parafilm stalak sa stezaljkom staklena čaša od 100 mL staklena boca Pasteurova pipeta plastične epruvete od 1.4 Reagencije • • • • • • 0.1 mL otopine EDTA. Daljnjim prolaskom deoksihemoglobina kroz kolonu ispunjenu puferom deoksihemoglobin se oksigenira u oksihemoglobin.5 mL plastične epruvete od 15 mL stalak za epruvete špatula automatske pipete nastavci za automatske pipete boce štrcalice 2. Prekinite istjecanje kada se razina pufera spusti do površine zrnaca gela. 2.02 M natrijev fosfatni pufer. Unutar kolone u koju je prethodno unijet reducens u potpunosti se odvija redukcija methemoglobina u deoksihemoglobin.2 M natrijevom fosfatnom puferu.2 mL svježe priređene smjese FeSO4/EDTA u fosfatnom puferu. • Kako biste dobili oštre vrpce slojeva u koloni nužno je pažljivo raditi i prilikom nanošenja uzoraka na kolonu ne uzmutiti površinski sloj gela. pH 7 uzorak (otopina deoksihemoglobina) u dest.

F. (1995) Biochemistry. Obilježili ste velik segment DNA radioaktivnim nukleotidima. R. C. Garrett. E. http://www. Pergamon Press. Potom na kolonu nanesite 350 μL razrijeđene krvi te otpuštanjem stezaljke omogućite da sav uzorak uđe u kolonu. 3. Zašto se kisik labilno veže za prostetičku skupinu hemoglobina? 2. Nature 213: 399-400.8 Zadaci 1. 2. Ima li razlike između oksidacije i oksigenacije hemoglobina? Objasnite! 4. 5.aw-bc. John Wiley & Sonc Inc.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ • • • • polagano otpuštajte stezaljku da sav dodani volumen uđe u kolonu te stezaljku ponovno pritegnite. (1989) Practical Biochemistry for Colleges.H. 2. U epruvete od 1.com/mathews/ch07/heme.g. (1967) Reduction of Methaemoglobin in Haemoglobin Samples using Gel Filtration for Continuous Removal of Reaction Products.B.M. Navedite prednosti i mane pojedine tehnike odjeljivanja molekula. J.9 Literatura 1. and McIntosh. R.5 mL sakupljajte frakcije svijetlo-crvene odnosno žute boje prilikom njihovog izlaska iz kolone. Pazite da kolona nikada ne ostane bez nadsloja pufera! Pratite promjene boje slojeva u koloni. Usporedite gel filtraciju i dijalizu. and Grisham. Nastavite na kolonu dodavati pufer i ostvarite kontinuirani protok (oko 30 kapi u minuti) kroz kolonu tako da otpustite stezaljku. and Voet. Voet.J. Na kolonu nanesite oko 1 mL (25 kapi) pufera te otpuštajući stezaljku omogućite da sav pufer uđe u kolonu. Wood. (1999) Biochemistry. 2. H. Koji ćete kromatografski materijal upotrijebiti za razdvajanje molekula DNA od slobodnih nukleotida? 3.htm 14 . D. 4. Dixon. Brooks Cole.

BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM Vježba 3. Serum je. IgD.1). vežu se na njega i posreduju u aktivaciji imunosnog sustava. Lanci su međusobno povezani disulfidnim mostovima između prostorno bliskih cisteinskih ostataka. Humani serum sadrži pet klasa imunoglobulina (IgA. a svakim od njih odjeljuju se pojedine vrste molekula određenom učinkovitošću. bilirubin).2 Metode pročišćavanja proteina Proces pročišćavanja proteina rijetko se odvija u samo jednom koraku. možemo ga smatrati puferiranom otopinom koja sadrži ione. Ig. 3. Metoda se temelji na činjenici da u vodenoj otopini molekule vode koje okružuju proteinske 15 konstantni dio varijabilni dio . Teški su lanci specifični za pojedinu klasu protutijela (α – IgA. Imunoglobulini su heterodimeri koji se sastoje od dva laka i dva teška lanca. Pravilnim odabirom metoda pročišćavanja i njihovim primjerenim slijedom.1 Taloženje (isoljavanje) amonijevim sulfatom Taloženje amonijevim sulfatom omogućava razdvajanje proteina na temelju njihove različite topljivosti pri određenoj koncentraciji amonijevog sulfata u otopini. Proteini čine velik dio suhe tvari seruma (60-80 g/L). među kojima je najzastupljeniji IgG. IgE. Pročišćavanje imunoglobulina G iz humanog seruma 3. dakle.2. IgG i IgM). kreatinin. biološke makromolekule (proteini. 3. imunosni sustav posredstvom protutijela može prepoznati milijune različitih stranih Slika 3. molekula u organizmu. može se iz smjese proteina izdvojiti točno određeni protein. Najčešće se radi o nizu postupaka. μ – IgM). dok konstantni dio posreduje u aktivaciji stanica imunosnog teški sustava. organske tvari (urea. fibrinogena i krvnih stanica.1 Humani serum i imunoglobulin G (IgG) Krv izvađena venepunkcijom bez dodatka antikoagulansa zgrušava se stajanjem na zraku posredstvom sustava za koagulaciju. Stvara ih imunosni sustav kralježnjaka kao odgovor na strane tvari (antigene) koje mogu prodrijeti u organizam. Na molekuli funkcionalno razlikujemo konstantni i varijabilni dio (Slika 3. laki Varijabilni dio specifično prepoznaje i lanac veže antigen. dio krvi bez čimbenika zgrušavanja. γ – IgG. Protutijela prepoznaju specifičan antigen. ε – IgE. pa ih nazivamo i protutijela. koji djeluju kao obrambeni proteini.1 Shematski prikaz molekule. lipoproteini. Centrifugiranjem se ugrušak odvaja od supernatanta koji nazivamo krvnim serumom. Kombiniranjem različitih aminolanac kiselina u varijabilnom dijelu. DNA). Značajan dio proteinske frakcije seruma čine imunoglobulini (7-16 g/L). δ – IgD.

3 SDS-poliakrilamidna gel-elektroforeza Elektroforeza je metoda razdvajanja molekula pod utjecajem električnog polja na temelju razlika u njihovoj masi i naboju.3 B). U SDSpoliakrilamidnoj gel elektroforezi. sodium dodecyl sulphate). Funkcionalne skupine kationskih izmjenjivača negativno su nabijene. od engl. prisutan je anionski detergent natrijev dodecil-sulfat (SDS. 0 0 A) B) Slika 3. Premda točan mehanizam nije poznat. otopini.3 A).BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ molekule poprimaju uređenu strukturu. Za odvajanje je ključna empirijski utvrđena činjenica da se određeni protein taloži u uskom rasponu koncentracija amonijevog sulfata. odnosno okružen je s manje molekula vode). anionski izmjenjivač s pozitivno nabijenim funkcionalnim skupinama veže anione iz mobilne faze (Slika 3. u gelu i u puferu za nanošenje uzoraka. pa elektrostatskim silama vežu katione otopljene u mobilnoj fazi (Slika 3.2 Dva proteina s različitim hidrofilnih (crno) i fugiranjem razdvojiti od proteina zaostalih u omjerom hidrofobnih (bijelo) skupina.2 Kromatografija ionske izmjene Kromatografija ionske izmjene provodi se na koloni ionskog izmjenjivača koja se sastoji od čestica gela s kovalentno vezanim nabijenim skupinama. 3. SDS se 16 . Suprotno tome.2. Različiti proteini imaju različit ukupni naboj koji potječe od bočnih ogranaka aminokiselina na površini molekule proteina. Istaložene proteine moguće je centri. 3.2 prikazana su dva proteina s različitim omjerom hidrofilnih i hidrofobnih skupina na površini molekule. U ovoj se vježbi koristi anionski izmjenjivač trimetilaminoetan koji je jaki kation (otporan na promjene pH od 2-14).Slika 3. Jasno je da će se protein s lijeve strane slike taložiti pri manjoj koncentraciji amonijevog sulfata (jer ima manje vodi izloženih hidrofilnih skupina. Na slici 3. smatra se da povećanjem koncentracije amonijevog sulfata u otopini dolazi do kompeticije između amonijevih i sulfatnih iona i proteina za slobodne molekule vode što dovodi do agregacije i precipitacije proteina. Možemo reći da amonijev sulfat oduzima vodu otopljenim proteinima te oni stoga stvaraju nakupine i talože se.3 Shematski prikaz zrnaca gela A) kationskog i B) anionskog izmjenjivača.

a ne smjese proteina. glicerol i boju bromfenol plavo u puferu pH 6.4 g SDS/g proteina) pa putovanje proteina u električnom polju u ovoj vrsti elektroforeze ovisi isključivo o njegovoj molekulskoj masi (s obzirom na to da je omjer naboja i mase konstantan). l duljina puta zrake svjetlosti kroz uzorak. Višak boje s gela uklanjamo ispiranjem u otopini Slika 3. jer se proteini razlikuju po molarnom ekstinkcijskom koeficijentu.4 Ureñaj za diskontinuiranu SDSPAGE. Međutim. Brzina putovanja u razdvajajućem gelu uvjetovana je učinkom molekulskog prosijavanja. 3. Slika preuzeta i modificirana iz (6). proteine vizualiziramo bojanjem gela bojom koja specifično boja proteine. linearan odnos vrijedi samo unutar određenog raspona koncentracija proteina. Proteine razdvajamo diskontinuiranom elektroforezom uz uporabu sabijajućeg i razdvajajućeg gela koji se međusobno razlikuju u pH i gustoći (Slika 3.4). ali ne boja proteine. Za određivanje koncentracije određenog proteina mjerenjem apsorbancije potrebno je stoga ili poznavati njegov molarni ekstinkcijski koeficijent ili konstruirati baždarni pravac koji odražava odnos poznatih koncentracija tog proteina i apsorbancija. octene kiseline.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM veže za proteine u uzorku. Osim toga. Temeljem Beer-Lambertovog zakona (A = ε x l x c. maskira njihov površinski naboj i oni postaju negativno nabijeni. odnosno manji proteini putuju brže. Coomassie blue® R-250. Nakon provedene elektroforeze. triptofana ili tirozina u svojoj strukturi.8 koncentriraju u usku vrpcu te svi zajedno ulaze u razdvajajući gel (10-15%) u kojem je pH 8. β-merkaptoetanol kida disulfidne mostove. Uzorke pripremamo dodatkom pufera za nanošenje uzoraka koji sadrži SDS. otopljenoj u metanolu i octenoj kiselini. Proteini se prolaskom kroz sabijajući gel (3-5%) pri pH 6. pri čemu je ε molarni ekstinkcijski koeficijent. a boja bromfenol plavo služi za praćenje tijeka elektroforeze.8.4 Odreñivanje prisutnosti i koncentracije proteina mjerenjem apsorbancije Proteini apsorbiraju svjetlost valne duljine 280 nm zbog prisutnosti aromatskih prstenova na bočnim ograncima aminokiselina fenilalanina. a veći sporije. valja uočiti da se mjerenjem apsorbancije može odrediti koncentracija otopine čistog proteina. βmerkaptoetanol. glicerol povećava gustoću uzorka te se oni tako lakše nanose u jažice. a c koncentracija tvari koja apsorbira) može se zaključiti da je odnos vrijednosti apsorbancije i koncentracije proteina linearan.8. SDS denaturira proteine uz kuhanje pri 95°C. 17 . Količina negativno nabijenog detergenta koja će se vezati na protein razmjerna je njegovoj veličini (1.

5 mM SDS.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ 3. 3.5 mM Tris/HCl pH 6.5 M amonijev sulfat u dest. vodi pufer za elektroforezu: 192 mM glicin. vodi otopina za bojanje gela (0.8% bisakrilamid. 10% amonijev persulfat u dest. 3.5 M Tris HCl.5 Zadaća Iz uzorka humanog seruma izolirajte imunoglobulin G. 10% SDS. 10% SDS. vodi TEMED gel za razdvajanje: 30% akrilamid/0.8% bisakrilamid. vodi 1% agaroza u dest. 0. vodi gel za sabijanje: 30% akrilamid/0. 10 cm. 6% SDS. vodi) komercijalno pribavljena smjesa proteina poznatih molekulskih masa komercijalno pribavljen imunoglobulin G 3. Provjerite čistoću pročišćenog proteina SDS-poliakrilamidnom gel elektroforezom te odredite koncentraciju izoliranog proteina.8.0 M Tris HCl. vodi pufer za nanošenje uzoraka: 187. 10% ledena octena kiselina u dest. pH 6. 20% glicerol. u dest.1% bromfenol plavo u dest. vodi 10 mM natrijev fosfatni pufer. 10% amonijev persulfat u dest.3. 5% β-merkaptoetanol. pH 8.6 Reagencije • • • • • • • • • • • • • 3. pH 8. 1. 25 mM Tris HCl.8.8 2 M NaCl u dest. vodi) otopina za odbojavanje gela: (10% octena kiselina u dest. pH 6. 45% metanol. 1.5 i 2 mL stalak za epruvete stalak sa stezaljkom staklene boce flomaster za označavanje stolna centrifuga plastične kolone.1% Coomassie blue® R-250.7 Pribor • • • • • • • • • • • • • • • • • • 18 automatske pipete nastavci za automatske pipete plastične epruvete od 1.8. φ = 1 cm gel Sephadex G-25 Fractogel® TMAE-650 (anionski izmjenjivač trimetilaminoetan) plastične kapaljke peristaltička pumpa plastične cijevi s odgovarajućim priključcima čaše od 100 mL termostatirana tresilica mješač Vortex digestor .

Začepite epruvetu i promiješajte uzorak.8. 3. pri čemu se polipeptidni lanci razdvajaju na temelju razlike u svojoj masi te vizualiziraju bojom koja se veže na proteine.5 M otopine amonijevog sulfata. Nakon otapanja istaloženih proteina u fosfatnom puferu zaostali se amonijev sulfat odvaja od proteinske frakcije gel-filtracijom. Nadsloj pufera mora biti u razini površinskoj sloja gela.8 Načelo postupka Dio proteina humanog seruma.2 Odsoljavanje gel-filtracijom (princip metode objašnjen je u Vježbi 2. 3. 19 . • Uzorak centrifugirajte 5 minuta pri 5400g te potom supernatant pipetom odbacite u čašu za otpad.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM • • • • • • • • • • češalj i razmaknice za elektroforezu stakla za elektroforezu štipaljke kadica za elektroforezu žice s priključcima izvor istosmjerne struje (ispravljač.3 M. a isti se s kolone ispiru povećanjem ionske jakosti. a talog se odvaja od topljivih proteina centrifugiranjem. eng.5 mL počnite sakupljati tekućinu koja istječe. Prisutnost i čistoća IgG u pojedinim frakcijama provjerava se elektroforetskim razdvajanjem proteina sakupljenih frakcija u poliakrilamidnom gelu u denaturirajućim uvjetima.9. Kolona nikad ne smije ostati bez nadsloja tekućine. power supply) kvarcna kiveta staničevina boce štrcalice UV/VIS spektrofotometar 3.1 Isoljavanje amonijevim sulfatom • U 200 μL humanog seruma dodajte 400 μL 3. Kada uzorak uđe u kolonu na vrh kolone dodajte još pufera.9 Postupak 3.9. taloži se pri određenoj koncentraciji amonijevog sulfata (2. Prisutnost proteina u sakupljenim frakcijama utvrđuje se na temelju porasta apsorbancije mjerene pri valnoj duljini od 280 nm. • Uzorak (resuspendirani talog nakon taloženja amonijevim sulfatom) nanesite na kolonu za gel-filtraciju i istovremeno u epruvetu od 1. među kojima i IgG. tako da njegova konačna koncentracija bude 2.37 M). Koncentracija čistog IgG u pojedinim frakcijama određuje se na temelju apsorbancije tih frakcija i apsorbancija otopina poznatih koncentracija IgG (uz konstruiranje baždarnog pravca) pri valnoj duljini 280 nm. • Preostali talog resuspendirajte u početnom volumenu (200 μL) 10 mM fosfatnog pufera pH 6. Na kolonu anionskog izmjenjivača pri određenim uvjetima (pH 6.8) vežu se svi ostali proteini osim IgG.) • Iz kolone za gel-filtraciju ispustite višak fosfatnog pufera u čašu za otpad.

• Nanesite uzorak na kolonu anionskog izmjenjivača i odmah počnite sakupljati uzorke eluensa od po 1 mL. 20% glicerol. Sakupite 10 frakcija. Ispustite pufer iznad zrnaca gela u čašu za otpad. • Frakciju proteina sakupljenu nakon gel-filtracije seruma razrijedite 10 puta te pomiješajte 10 µL razrijeđene frakcije s puferom za nanošenje uzoraka u omjeru 2:1. Taj uzorak sačuvajte za sljedeći korak pročišćavanja (anionsku izmjenu). • Pomiješajte 2 µL supernatanta nakon taloženja proteina seruma amonijevim sulfatom s 8 µL vode i 5 µL pufera za nanošenje uzoraka. 3. 3.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ • Nakon što sakupite prvih 1 mL tekućine koja istječe iz kolone. • Uravnotežite kolonu ispiranjem s 30 mL 10 mM fosfatnog pufera koji nakon izlaska iz kolone sakupljajte u čaši za otpad. a na ordinatu A280. • Kolonu zatim isperite s 10 mL 2 M NaCl uz protok od 0.5 mM Tris/HCl pH 6.4 Odreñivanje prisutnosti proteina mjerenjem apsorbancije pri λ = 280 nm • Kvarcnu kivetu u koju ste ulili 10 mM fosfatni pufer stavite u spektrofotometar te apsorbanciju pri λ = 280 nm postavite na vrijednost 0.9.5 Elektroforeza proteina u diskontinuiranom denaturirajućem poliakrilamidnom gelu • Razrijedite uzorak seruma 50 puta te pomiješajte 10 µL seruma s 5 µL pufera za nanošenje uzoraka (187. 3. propustite kroz nju 30 mL pufera koji po izlasku s kolone sakupljajte u čašu za otpad i potom bacite.5 mL/min (oznaka 5 na pumpi Pharmacia P-3).8. a sljedeća 2 mL koja istječu iz kolone nastavite sakupljati u epruvetu od 2 mL. s puferom za nanošenje uzoraka u omjeru 2:1. 5% βmerkaptoetanol.9. a po potrebi dodajte još pufera u kolonu. a prije proteina. • Pomiješajte 10 µL pufera koji je s kolone izlazio nakon imunoglobulina G. • Pomiješajte 3 µL pročišćene frakcije IgG sa 7 µL vode i 5 µL pufera za nanošenje uzoraka. • Ispraznite kivetu. 20 .3 Kromatografija ionske izmjene • Označite i priredite na stalku 20 epruveta volumena 1. 6% SDS. • U kivetu ulijte pojedinu frakciju sakupljenu tijekom anionske izmjene te očitajte apsorbanciju te frakcije pri λ = 280 nm. tu frakciju bacite.9.8 mL/min (oznaka 8 na peristaltičkoj pumpi) te sakupite 10 frakcija volumena 1 mL. • Kako bi kolonu za gel-filtraciju isprali od amonijevog sulfata.) • Prikažite dobivene rezultate grafički na milimetarskom papiru nanoseći na apscisu broj sakupljene frakcije.1% bromfenol plavo). (Postupak mjerenja ponovite na isti način za sve frakcije. isperite je destiliranom vodom i protresite kako biste iz nje uklonili svu tekućinu. 0.5 mL za sakupljanje uzoraka. Pokrenite peristaltičku pumpu i namjestite brzinu protoka pufera na 0.

8% bisakrilamid 1.035 mL 0.1 Sastojci za pripremu sabijajućeg i razdvajajućeg gela za SDS-PAGE.003 mL razdvajajući gel (10%.8 10% SDS 10% amonijev persulfat Temed* 1. 21 .33 mL ----0.4 mL 0. • Pripremite sabijajući (5%) i razdvajajući (10%) gel prema tablici 3.33 mL 1. • Kuhajte uzorke 5 minuta pri 95°C.1. spacer) i "češalj" te ih učvrstite metalnim štipaljkama. • Između stakala ulijte razdvajajući gel. a nakon njegove polimerizacije i sabijajući gel. • U jažice nanesite redom: o komercijalno pribavljenu smjesu proteina poznatih molekulskih masa (3 μL/jažici) o uzorak seruma (15 μL/jažici) o uzorak supernatanta nakon taloženja amonij sulfatom (15 μL/jažici) o uzorak nakon gel filtracije (15 μL/jažici) o uzorak frakcije pročišćenog IgG (15 μL/jažici) o uzorak nakon izlaska imunoglobulina G (15 μL/jažici) o uzorak eluata s NaCl (15 μL/jažici) o uzorak komercijalno pribavljenog IgG (15 μL/jažici) • Spojite elektrode na izvor istosmjerne struje te elektroforezu provodite uz konstantan napon od 80 V za sabijajući gel i 120 V za razdvajajući gel u puferu za elektroforezu.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM • Pomiješajte 5 µL frakcije proteina koji s kolone za anionsku izmjenu izlaze s NaCl s 5 µL vode i 5 μL pufera za nanošenje uzoraka.25 mL 0. 2 mL) dest.8 1. • Nakon polimerizacije sabijajućeg gela izvadite češalj. sabijajući gel (5%. • Spojeve između stakala na stranicama gdje su postavljene razmaknice ispunite 1% otopinom agaroze. • Stakla za elektroforezu spojite na način da između njih postavite razmaknice (eng. voda 30% akrilamid/0.02 mL 0. 3.02 mL 0. pH 6.003 mL * dodaje se neposredno prije izlijevanja gela. a nastale jažice nekoliko puta isperite destiliranom vodom. pH 8. • Pomiješajte 3 μg komercijalno nabavljenog imunoglobulina G (otopljenog u 10 μL) s puferom za nanošenje uzoraka u omjeru 2:1. • Temeljito operite stakla za elektroforezu detergentom.5 mL) 1.5 M Tris HCl.035 mL 0.91 mL ----0. Temed je katalizator reakcije umrežavanja akrilamida i bisakrilamida u kojoj sudjeluju slobodni radikali koji potječu od amonijevog persulfata. • Stakla s gelom postavite u kadicu za elektroforezu.0 M Tris HCl. Tablica 3. isperite destiliranom vodom te pažljivo prebrišite 70% etanolom.19 mL 0.

Potom ostavite gel u otopini za bojanje na zibaljci tijekom sljedećih 15 minuta. Potom u nju dodajte otopinu za odbojavanje koju zatim zagrijte tijekom 45 sekundi u mikrovalnoj pećnici pri najvećoj jakosti.80 mL 1. Koja je razlika između krvnog seruma i krvne plazme? 2.442 0.40.359 1. • Izlijte otopinu za bojanje iz kadice u kojoj se nalazi gel te kadicu s gelom kratko isperite destiliranom vodom. • Pomoću baždarnog pravca odredite koncentraciju IgG u nepoznatom uzorku (u frakciji koja sadrži najviše IgG).1.00 mL A1 0. SDS-poliakrilamidnom elektroforezom analizirali ste smjesu proteina i nakon bojanja gela bojom Coomassie na gelu vidite tri vrpce.10 mg/mL 0.129 0.20 mL 0.355 1.294 1. Otopine se priređuju u duplikatu razrjeđivanjem matične otopine IgG koncentracije 2 mg/mL u 10 mM fosfatnom puferu.20 mL 0. i 2.002 0.03 mL 0.00 mL V (10 mM fosfatnog pufera) 1 mL 0.60 mg/mL 2. 0. 0.853 2.80 mL 0.440 0. Koji dio proteinske strukture apsorbira svjetlost valne duljine 280 nm? 4. 3.60.60 mL 0.8 Zadaci V (2 mg/mL otopine IgG) 0 mL 0.02. Možete li na osnovu toga sa 22 .10.99 mL 0.06.20. • Utvrdite u kojim se frakcijama nalazi IgG i je li pročišćen od ostalih proteina seruma.00 mg/mL.02 mg/mL 0. a koja konstantnog dijela imunoglobulina G? 3.296 A 0.063 0.20 mg/mL 1. 1.026 0.1 mg/mL do 2 mg/mL pa se stoga priređuju standardne otopine IgG koncentracija: 0. 0.40 mL 0.291 A2 -0.40 mL 0.851 2.351 1. uronite gel u otopinu za bojanje te sve zajedno zagrijavajte 45 sekundi pri maksimalnoj jakosti u mikrovalnoj pećnici.06 mg/mL 0.97 mL 0.889 1.899 1.022 0.6 Odreñivanje koncentracije pročišćenog imunoglobulina G Očekivane vrijednosti koncentracije IgG u sakupljenim frakcijama kreću se od 0. Tablica 3. • Razdvojite stakla.104 0. 1. Koja je funkcija varijabilnog dijela.063 0.95 mL 0.441 0.062 0.00 mg/mL 3.05 mL 0.894 1.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ • Kada boja iz uzorka (bromfenol plavo) dosegne donji rub razdvajajućeg gela prekinite tok električne struje.60 mL 0.002 0.117 0. 0.01 mL 0.80 mg/mL 1.024 0. a na ordinatu pripadajuće prosječne vrijednosti A280. Nastavite odbojavanje gela tijekom sljedećih 15 minuta na zibaljci.000 0.849 2.7.80. Kao referentna vrijednost uzima se prosječna izmjerena vrijednost A280 za pojedinu koncentraciju IgG. • Nacrtajte na milimetarskom papiru baždarni pravac nanoseći na apscisu koncentracije IgG iz tablice 3.40 mg/mL 0. IgG 0 mg/mL 0.2 Eksperimentalno utvrñene vrijednosti apsorbancije različitih koncentracija IgG pri svjetlosti valne duljine 280 nm. konačna konc.

(2007) Aberrant Glycosylation of Igg Heavy Chain in Multiple Myeloma. Alberts. Laemmli. Rendić. (1995) Biochemistry. (1999) Fucosylation of IgG Heavy Chains is Increased in Rheumatoid Arthritis.. 5. et al. D. I. http://www.. Gornik. Dumić. J. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. 28 (5): 815–820. 6. M... 3.. Miloš. and Labar. Dumić. J. 8. dok je protein C monomeran protein molekulske mase 14 000 Da. 2. G.ucl.. 227: 680-685..9 Literatura 1. Matišić. B. 23 . and Lauc. 32: 605-608. (2002) Molecular Biology of the Cell. M. ed.ac. M. Coll Antropol. Protein A je homodimer s molekulskom masom monomera 42 kDa. Flögel.htm 4. Nature. (September 1967). protein B je heterodimer koji se sastoji od polipeptida molekulske mase 20 kDa i 30 kDa. J. (1983).uk/~ucbcdab/enzpur/amso4. Amsterdam/New York. D. Shapiro AL. Lauc. Biochem Biophys Res Commun. B. Garland Science 7. I. U. New York: John Wiley & Sons Inc. G. D. Electrophoresis: A survey of techniques and applications. Maizel JV Jr. Heffer-Lauc.K. Voet. Deyl Z. 1: 247-251.. 3.. G. Maravić. Nacrtajte shematski prikaz SDS-PAGE gela u kojem je svaki protein pušten kao zasebni uzorak.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM sigurnošću reći je li uzorak sadržavao tri različita proteina? Objasnite svoj odgovor! 5. Clinical Biochemistry. Flögel. Aurer. Ne zaboravite obilježiti anodu i katodu te molekulske mase pojedinih proteinskih vrpci. M. Elsevier Scientific. Viñuela E. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. and Voet..

pri čemu prvi broj klasificira enzime u jednu od 6 osnovnih skupina koje su formirane ovisno o mehanizmu reakcije koju kataliziraju (Tablica 4. a proteaze su enzimi koji kataliziraju razgradnju proteina. Enzimska kinetika (sekvenciranje 4.1 Klasifikacija enzima. čijom oksidacijom nastaju visokoreaktivni kinoni.1). U stanicama se nalazi u vezikulama i dolazi u doticaj s katekolom i kisikom nakon oštećenja stanice. Svaki je enzim opisan slijedom četiri broja.1). Oznaka EC 1 EC 2 EC 3 EC 4 EC 5 EC 6 Razred Oksidoreduktaze Transferaze Hidrolaze Liaze Izomeraze Ligaze Vrsta reakcije Oksido-redukcija Prijenos funkcionalne skupine Hidroliza Odstranjivanje skupine i tvorba dvostruke veze Izomerizacija Tvorba kovalentne veze u sprezi s hidrolizom ATP 4.1 Reakcija katekola s kisikom katalizirana katekolazom. Prema IUBMB nomenklaturi (nomenklaturi Međunarodnog udruženja za biokemiju i molekularnu biologiju. uz nastavak – aza.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ Vježba 4. Katekolaza U oksidoreduktaze ubrajamo i katekolazu (drugim imenom katekol-oksidazu. Supstrati za katekolazu mogu biti i drugi dihidroksibenzeni.1). katekolaza 2 + O2 2 benzokinon (crven) + 2 H2O katekol (1. International Union of Biochemistry and Molecular Biology. koji potom u neenzimskoj reakciji daju pigment melanin (Slika 4. EC 1. Katekolaza katalizira reakciju katekola i kisika u kojoj se katekol oksidira u benzokinon (Slika 4.2). Smeđa boja koja nastaje kada se.10. 24 .1. voće razreže i stoji na zraku potječe od nastalog benzokinona. enzim široko rasprostranjen u biljkama. engl.3. Klasifikacija enzima Nazivlje enzima najčešće potječe od imena supstrata ili vrste kemijske reakcije koju kataliziraju. Benzokinon inhibira rast mikroorganizama te tako štiti oštećenu biljku od truljenja. Tablica 4. tirozinazu odnosno 1. IUBMB) enzimi se označavaju brojevima EC. primjerice. Tako je primjerice katekol supstrat enzima katekolaze.2 – dihidroksibenzen) Slika 4.2.2-dihidroksibenzen: kisik oksidoreduktazu.

l duljina puta zrake svjetlosti kroz uzorak. Apsorbancija otopine proporcionalna je koncentraciji tvari koja apsorbira. u potpunosti priređenu reakcijsku smjesu potrebno odmah premjestiti u kivetu i započeti mjerenje.4. 4. Početna brzina enzimske reakcije stoga se može izraziti pomoću vrijednosti asporbancije: vo= d[P]/dt = dA/dt Katekolaza koja se koristi za ovu vježbu nije čisti protein otopljen u puferu. već se kao izvor enzima koristi ekstrakt krumpira. no s obzirom na to da se njegova koncentracija u određenoj reakcijskoj smjesi tijekom vremena ne mijenja. Kako bi izmjerena apsorbancija potjecala isključivo od nastalog produkta. ta je apsorbancija konstantna tijekom enzimske reakcije.3. koju pratimo spektrofotometrijski. a c koncentracija tvari koja apsorbira). a kada u post-ustaljenom stanju. 25 . Prilikom izvođenja pokusa na umu valja imati da enzimska reakcija. Kinetika reakcije katekolaze Osnovni principi enzimske kinetike objašnjeni su u zasebnom odjeljku (Dodatak – enzimska kinetika). Izračunajte vrijednosti početne brzine enzimske reakcije pri različitim koncentracijama supstrata. Zaključite kada je enzimska reakcija u ustaljenom. Ekstrakt krumpira također apsorbira svjetlost valne duljine 540 nm.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM Slika 4. kao slijepa proba koristi se smjesa ekstrakta krumpira i pufera koja ne sadrži supstrat i u kojoj je koncentracija ekstrakta krumpira jednaka onoj u uzorku. što je poznato kao Beer-Lambertov zakon (A = ε x l x c. 4. Stoga je takvu.2 Reakcija dopamina s kisikom katalizirana katekolazom. pri čemu je ε molarni ekstinkcijski koeficijent. počinje u trenutku kada se u reakcijskoj smjesi istovremeno nađu enzim i supstrat. Tijek enzimske reakcije koju katalizira katekolaza može se pratiti spektrofotometrijski – tijekom enzimske reakcije bezbojni se supstrat katekol pretvara u smeđi produkt benzokinon. Prilikom praćenja enzimske kinetike u in vitro uvjetima uobičajeno je da se u reakcijskoj smjesi nalaze enzim i supstrat u puferiranom vodenom mediju. Zadaća Priredite reakcijske smjese s istim koncentracijama enzima i različitim koncentracijama supstrata i odredite apsorbancije tako priređenih smjesa u tridesetosekundnim intervalima tijekom prve tri minute enzimske reakcije. koji apsorbira svjetlost valne duljine 540 nm.

Koncentracija nastalog produkta tijekom određenog vremena može se odrediti izravnim mjerenjem apsorbancije istog. Priredite reakcijske smjese s različitim koncentracijama enzima i istim koncentracijama supstrata te odredite apsorbancije tako priređenih smjesa u tridesetosekundnim intervalima tijekom prvih devedeset sekundi enzimske reakcije. 26 . Reagencije • • • 10% ekstrakt krumpira u fosfatnom puferu. Nacrtajte graf ovisnosti početne brzine enzimske reakcije o koncentraciji enzima i zaključite kako koncentracija enzima utječe na početnu brzinu enzimske reakcije. odredite maksimalnu početnu brzinu enzimske reakcije pri zadanoj koncentraciji enzima (Vm).7.5. pH 7.6. Načelo postupka U enzimskoj reakciji katekolaze s katekolom nastaje smeđi produkt bezokinon. Na temelju rezultata mjerenja može se zaključiti tijekom kojeg vremenskog perioda traje ustaljeno stanje te izračunati vrijednosti početne brzine enzimske reakcije. Michaelisovu konstantu za katekolazu u navedenim reakcijskim uvjetima (Km) te zaključite kako koncentracija supstrata utječe na početnu brzinu enzimske reakcije. Vm i Km kao i ispitati kako početna brzina enzimske reakcije ovisi o koncentraciji supstrata i koncentraciji enzima.0 (držati na ledu u tamnom) 20 mM katekol u dest.0 4. Izračunajte vrijednosti početne brzine enzimske reakcije pri različitim koncentracijama enzima.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ Nacrtajte Michaelis-Menteničin graf ovisnosti početne brzine o koncentraciji supstrata. vodi 50 mM natrijev fosfatni pufer. Pribor • • • • • • • • • • • • • staklene epruvete plastične epruvete od 15 mL stalak za epruvete staklene čaše aluminijska folija automatske pipete nastavci za automatske pipete staklena kiveta staničevina staklene boce boce štrcaljke štoperica VIS spektrofotometar 4. pH 7. 4.

8. oznaka epruvete S 1 2 3 4 5 6 volumen (izražen u mL) H20 2.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM 4.0 vrijeme u minutama 1. Na isti gore opisani način izmjerite apsorbancije ostalih uzoraka. Tijek enzimske reakcije i učinak koncentracije supstrata na početnu brzinu enzimske reakcije • Označite epruvete i u njih precizno ispipetirajte odgovorajuće volumene pufera. Napomena: nije potrebno ponovno koristiti slijepu probu.8. Začepite epruvetu i promućkajte je. začepite epruvetu i promućkajte je te sadržaj epruvete prelijte u kivetu.5 1. isperite je destiliranom vodom i protresite kako biste iz nje uklonili svu tekućinu.1.0 6. pH 7. pufer. Rezultate upisujte u tablicu 4. oznaka epruvete 1 2 3 4 5 6 ckatekol (mM) 0.0 2 2 2 2 2 2 2 katekol 0. Dodajte u sljedeću epruvetu (1) 0.0 2.0 1.0 3. Iz vrijednosti apsorbancija koje se odnose isključivo na ustaljeno stanje izračunajte početnu brzinu enzimske reakcije pri određenoj koncentraciji supstrata.5 2.5 1.5 mL katekola i istovremeno uključite štopericu.2 0.5 Tablica 4.2).2 4.5 mL ekstrakta krumpira.0 8.3 Vrijednosti apsorbancije tijekom enzimske reakcije uz konstantnu koncentraciju enzima katekolaze.3. Ispraznite kivetu. Stavite kivetu u spektrofotometar te apsorbanciju pri 540 nm namjestite na vrijednost 0.0 • • Prikažite rezultate grafički nanoseći na apscisu vrijeme (t) u minutama.5 3. Dodajte u prvu epruvetu 0. vode i katekola (navedene u tablici 4.2 Sastav reakcijskih smjesa. Postupak 4.0 0.8 2.3 2.5 2.5 0.0 • • • • Prva epruveta (označena S) ne sadrži katekol te služi kao slijepa proba. Tablica 4.8 1.0 1. Početnu brzinu enzimske reakcije izrazite kao prosječnu promjenu apsorbancije u minuti. Zaključite tijekom kojeg vremenskog raspona traje ustaljeno stanje. Kako je vrlo moguće da eksperimentalno dobivene 27 . potom njezin sadržaj prelijte u kivetu koju umetnite u spektrofotometar te očitavajte apsorbancije svakih 30 sekundi tijekom 3 minute. a na ordinatu A540.7 1.5 2.0 0.

isperite je destiliranom vodom i protresite kako biste iz nje uklonili svu tekućinu.2 0. Prvu slijepu probu začepite. U uzorak 1 dodajte 2 mL katekola i istovremeno uključite štopericu.0 S1 S2 S3 S4 • • 1 2 3 4 • • • U sve slijepe probe (S1.5. Ispraznite kivetu. S3 i S4) dodajte još 2 mL vode.0 2 2 2 2 H20 0.0 0. Napomena: svaki je put potrebno koristiti odgovarajuću slijepu probu! Tablica 4.2 0. očitajte vrijednosti Vm i Km i zaključite kako koncentracija supstrata utječe na početnu brzinu enzimske reakcije. S2.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ vrijednosti apsorbancije u ustaljenom stanju malo odstupaju od pravca kojim se može opisati ovisnost apsorbancije o vremenu.8 1. prosječnu promjenu apsorbancije u minuti izračunajte prema formuli: n _____ Ay-Ax ____ Σ ty-tx dA d[P] n=1 vo = ____ = ____ = _________ n-1 dt dt • Nacrtajte Michaelis-Menteničin graf i Lineweaver-Burkov graf. Rezultate upisujte u tablicu 4.0 mM.2.8.5 Vrijednosti apsorbancije tijekom enzimske reakcije pri koncentraciji katekola 8. Uočite da je za svaki uzorak potrebna odgovarajuća slijepa proba koja sadrži isti volumen ekstrakta krumpira.0 1. Začepite epruvetu i promućkajte je. pH 7.5 0. Sastav reakcijskih smjesa. oznaka epruvete 1 2 3 4 28 Vekstrakt /(mL) 0.5 0.5 .4.4). Učinak koncentracije enzima na početnu brzinu enzimske reakcije • Označite ukupno 8 epruveta i u njih precizno ispipetirajte odgovorajuće volumene pufera. vode i ekstrakta krumpira (navedene u tablici 4. Stavite kivetu u spektrofotometar te apsorbanciju pri λ = 540 nm namjestite na 0 (pritiskom na tipku „auto zero“). potom njezin sadržaj prelijte u kivetu koju umetnite u spektrofotometar te očitavajte apsorbancije svakih 30 sekundi tijekom 1.8 0. Na isti gore opisani način izmjerite apsorbancije ostalih uzoraka. oznaka slijepe probe oznaka uzorka volumen (izražen u mL) pufer.8 1. promućkajte i prelijte u kivetu. 4. odnosno istu koncentraciju katekolaze.2 0.0 ekstrakt krumpira 0.5 vrijeme u minutama 1.5 0. Tablica 4.5 minute.

(1989) Practical Biochemistry for Colleges. Wood.. and Wormald. Price. R. Dwex. Ratcliffe. 29 . and Voet. a u pokusu B želite da izmjerena maksimalna brzina bude 2 puta veća od brzine u pokusu A? 4. Oxford: Pergamon Press.9. Zašto ekstrakt krumpira tijekom ove vježbe držite na ledu? 3.C. Početnu brzinu enzimske reakcije izrazite kao prosječnu promjenu apsorbancije u minuti. Kako biste podesili reakcijske uvjete ako ste u pokusu A izmjerili određenu maksimalnu brzinu studirane enzimske reakcije. Literatura 1.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM • • Iz vrijednosti apsorbancija izračunajte početnu brzinu enzimske reakcije pri određenoj koncentraciji katekolaze. Voet. Nacrtajte graf ovisnosti početne brzine enzimske reakcije o koncentraciji enzima i zaključite o kakvoj je ovisnosti riječ i zašto.A. New York: John Wiley & Sons Inc. 2. R. 4. J. D. (1995) Biochemistry. (2005) Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists.10. Zadaci 1.J. 3.. E.R. N. M. Oxford: Oxford University Press. Možete li metodom opisanom u ovoj vježbi pratiti što se događa s koncentracijom produkta tijekom predustaljenog stanja? Zašto? 2. Koje su osnovne osobine ustaljenog stanja enzimske reakcije koja prati MichaelisMenteničinu kinetiku? 4.G.

Njih koči energetska prepreka koju treba prijeći na putu do produkta reakcije: treba aktivirati reaktante. Enzimska je reakcija složenijeg mehanizma od nekatalizirane reakcije. Sustav ulazi u ravnotežu kad je razlika Gibbsovih energija jednaka nuli. uz smanjenu energiju aktivacije (Slika 1). U organizmu. E+S ES P+E Kompleks ES zatim može dati produkt i slobodni enzim ili može u povratnoj reakciji disocirati na reaktante. Enzim ne mijenja položaj ravnoteže S P. spore se reakcije ubrzavaju pomoću enzima. tijek i brzina reakcije vrlo su osjetljivi na reakcijske 30 . stoljeća Michaelis i Menten pretpostavili su da se enzimska reakcija može odviti samo ako enzim E i supstrat S stvore funkcionalni kompleks ES. ne teku sve energetski povoljne reakcije spontano i brzo.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ Dodatak: Enzimska kinetika (sekvenciranje Svaku kemijsku reakciju pokreće negativna razlika Gibbsove energije između produkata reakcije i reaktanata. Početkom 20. Oslobađanje energije bitno je za spontanost reakcije. ali teče brže. Shematski prikaz promjene Gibbsove energije (∆G) nekatalizirane i enzimski ∆ katalizirane reakcije S P. Međutim. Postoje vrlo spore reakcije usprkos velikom energetskom potencijalu. vrlo specifičnih i moćnih bioloških katalizatora. prirode katalitičke reakcije i dinamičnosti proteinske strukture. Pozitivna energetska razlika pokreće povratnu reakciju. Brzina nastajanja produkta ovisi o katalitičkim svojstvima i koncentraciji enzima te koncentraciji supstrata. U kemiji se potrebna energija aktivacije najčešće namakne povišenjem temperature. koji može živjeti u vrlo ograničenom temperaturnom rasponu. Katalitička moć enzima je vrlo različita. a najveća brzina enzimske reakcije ograničena je difuzijom (k = 10-9Ms-1). # ΔG0#(S→S#) → S ΔG0#(ES→P#) → P Slika 1. Zbog načina vezanja supstrata. on samo ubrzava reakciju pretvorbe supstrata u produkt do uspostavljanja ravnoteže. Tijekom reakcije ta se energetska razlika smanjuje.

Koncentracija produkta P raste sve do uspostavljanja ravnoteže. Praktički je najčešće moguće mjeriti samo nastajanje produkta. stoga i do postupnog smanjenja brzine nastanka produkta. Ustaljeno se stanje uspostavi vrlo brzo (ms < t < 1s). Koncentracija ES raste dok se ne ustali. I. Nakon miješanja enzima i supstrata dolazi do stvaranja kompleksa ES. Tijek enzimske reakcije Tijek pretvorbe supstrata u produkt u prisutnosti enzima može se teorijski pratiti bilo kojom indikatorskom metodom koja prati smanjenje koncentracije supstrata ili povećanje koncentracije produkta. Kad se potrošio osjetni dio supstrata.). aktivatori. PREDUSTALJENO USTALJENO STANJE STANJE d[P] /dt=v0=konst POSTUSTALJENO STANJE [P] [P] i [ES] d[ES]/dt > 0 d[ES] /dt = 0 d[ES] /dt < 0 [ES] vrijeme Slika 2. Grafički prikaz tipičnog reakcijskog tijeka dan je na slici 2. inhibitori i dr. 31 . tijekom kojeg dolazi do postupnog smanjenja koncentracije ES. prestaje ustaljeno stanje i započinje postustaljeno stanje. Michaelis-Menteničina kinetika odnosi se na brzine enzimskih reakcija u ustaljenom stanju. jer je povećanje koncentarcije tvari koja raste od 0 do neke vrijednosti analitički pristupačno. U ustaljenom stanju produkt (P) nastaje stalnom brzinom. dok je smanjenje velike koncentracije tvari za neku malu vrijednost analitički teško uočljivo. Tijek enzimski katalizirane reakcije. a označava se vo. koju nazivamo početnom brzinom. a kratki period koji mu prethodi nazivamo predustaljeno stanje. u kojoj su brzina nastajanja produkta i brzina njegove razgradnje izjednačene.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM uvjete. intenziviranja povratne reakcije. pH i ionska jakost te drugi sastojci u reakcijskom mediju (proteini. kao što su temperatura. odnosno dok reakcijski sustav ne uđe u ustaljeno stanje.

Maksimalna brzina se postigne kad je sav enzim zasićen supstratom.[ES] Na osnovi gornjih jednadžbi možemo izraziti koncentraciju ES kao [ES] = [ET] [S] Km + [S] gdje je Km = (k-1 + k2)/k1. Tu brzinu nazivamo početnom brzinom enzimske reakcije i označavamo je kao vo. tako da je koncentracija kompleksa ES jednaka početnoj koncentraciji enzima. jer su brzine nastanka i razgradnje kompleksa jednake. Vm. Slijedi da je početna brzina enzimske reakcije određena izrazom k2[ET] [S] v o= Km + [S] Mjerimo li početne brzine enzimske reakcije uz različite početne koncentracije supstrata. opazit ćemo da početna brzina raste s porastom supstrata sve dok ne dosegne neku maksimalnu brzinu. Prema tome shema enzimske reakcije u ustaljenom stanju zanemaruje povratnu reakciju. Kinetika ustaljenog stanja Ustaljeno stanje uspostavit će se u uvjetima kada je koncentracija enzima znatno manja od koncentracije supstrata. k2 k1 ES P+E k-1 Brzina reakcije u ustaljenom stanju ovisna je isključivo o koncentraciji kompleksa ES koja je konstantna. vo = Vm = k2 [ET] Prema tome početnu brzinu možemo izraziti kao vo = Vm [S] ] Km + [S] ] Kad je [S] << Km (< 0. a trajat će dokle god je koncentracija produkta zanemarljivo mala u odnosu na koncentraciju supstrata. kcat). pa je brzina nastajanja produkta iz kompleksa ES izravno proporcionalna koncentraciji kompleksa ES k1 [E][S] = (k-1 + k2) [ES] Budući da se početna (ukupna) koncentracija enzima ET raspodjeljuje na slobodni enzim E i kompleks ES [E ]= [ET] . vo = Vm [S] Km gdje je Vm Km =k 32 .01 Km) početna brzina linearno ovisi o početnoj koncentraciji supstrata. E+S vo= k2 [ES] gdje je k2 prava katalitička konstanta (I reda. Konstantu Km nazivamo Michaelisovom konstantom.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ II.

neophodno je uvesti konsekutivnu "indikatorsku" reakciju koja će nastali produkt prevesti u obojeni produkt indikatorske reakcije. Kad je [S] >> Km (> 100 Km) reakcija je 0-tog reda. Ovisnost vo o početnoj koncentraciji supstrata uz stalnu koncentraciju enzima. pa je količina produkta jednaka [P] = Vm × t Enzimska kinetika u dijagnostičke svrhe mjeri se upravo u takvim uvjetima. Količina nastalog produkta ne ovisi o S. Najčešće se koncentracija nastalog produkta određuje spektrofotometrijskom metodom koja se temelji na mjerenju promjene apsorbancije. Znamo da je Vm = k2 [ET] pa količina nastalog produkta izravno ovisi o koncentraciji aktivnog enzima. [S]=Km Slika 3. Kako je sposobnost apsorpcije svjetlosti razmjerna koncentraciji tvari koja apsorbira. Premda grafički prikaz ovisnosti vo o koncentraciji supstrata omogućuje određivanje karakterističnih konstanti Km i Vm za određeni reakcijski sustav. Ako optička svojstva produkta enzimske reakcije ne dopuštaju izravno mjerenje odgovarajuće promjene apsorbancije. Mjerenje katalitičke aktivnosti i brzine enzimski katalizirane reakcije Katalitička aktivnost enzima obično se određuje mjerenjem koncentracija nastalog produkta nakon inkubacije smjese poznatih koncentracija supstrata [S] i enzima [E] pri pogodnom pH u određenim vremenskim razdobljima. uz odgovarajući baždarni dijagram (ili poznati molarni ekstinkcijski koeficijent) moguće je odrediti koncentraciju mjerene tvari. [P] = k2 [ET] t III. d[S] = k[S] dt Znajući konstantu brzine možemo izračunati količinu nastalog produkta u određenom vremenu iz integriranog oblika v. Ovisnost početne brzine o koncentraciji supstrata prikazana je grafički na slici 3. te parametre ćemo 33 .BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM v= gdje je k konstanta brzine I reda.

I Inhibicija enzimske reakcije Kinetička studija enzimske reakcije pomaže u otkrivanju inhibitora i u prepoznavanju mehanizma njihova djelovanja.) 1 / vo nagib (tg α)=K m /V max 1 / V max -1/K m 1/[S] Slika 4. Budući da enzim može imati više aktivnih središta. IV. U prvom slučaju aktivnost se može ponovno uspostaviti odgovarajućim uklanjanjem inhibitora. internacionalna jedinica enzimske aktivnosti. Specifična aktivnost enzima izražava se kao kat g-1. Inhibitore možemo podijeliti u dvije skupine: reverzibilne i ireverzibilne. bilo toksično. odnosno 1kat = 6×107 IU. Katalitička koncentracija enzima određena je brojem katala (ili IU) u litri otopine. prometni broj često se iskazuje kao broj molova produkta koji nastaju po molu aktivnih središta u minuti. U SI-sustavu jedinica enzimske aktivnosti je katal. Prometni (obrtni) broj određenog enzima ima jedinicu min-1. Najčešće se koristi Lineweaver-Burkov prikaz (Slika 4. bilo terapijsko. Starija jedinica za enzimsku aktivnost je tzv. molarna aktivnost enzima i obrtni broj. IU. Aktivnost enzima moguće je izraziti na više načina. Čimbenici koji utječu na brzinu enzimske reakcije IV.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ lakše grafički odrediti na osnovi algebarskih transformacija osnovnog izraza za početnu brzinu. primjerice dijalizom. Srodne mjere enzimske aktivnosti su specifična aktivnost enzima. Odreñivanje Km i Vm po Lineweaver-Burku. 1IU = 1/60 µkat = 16. mikromoli supstrata koje 1 mg proteina prevede u produkt u jednoj minuti). Inhibitorno djelovanje reverzibilnog inhibitora ovisi o konstanti 34 .67 nkat. Enzimske aktivnosti izražavaju se obično u mikrokatalima (µkat) i nanokatalima (nkat) što odgovara jedinicama µmol L-1 s-1 i nmol L-1 s-1. a predstavlja broj molova nastalog produkta po molu enzima u minuti. Katal je definiran kao enzimska aktivnost (količina enzima) koja u jednoj sekundi pretvara 1 mol supstrata u produkt pri optimalnim uvjetima (1 kat = mol L-1s-1). a kaže koliko molova produkta nastaje u prisutnosti jednog grama proteina u jedinici vremena (ili IU mg-1. Definirana je kao količina enzima koja katalizira pretvorbu jednog mikromola supstrata u produkt u jednoj minuti (µmol L-1 min-1) pri standardnim (optimalnim) uvjetima. Inhibitori imaju veliko kliničko značenje. Molarna aktivnost enzima (kat mol-1) odgovara broju molova supstrata koje jedan mol enzima prevede u produkt u jedinici vremena.

tj. Razlikujemo tri osnovna tipa reverzibilne inhibicije: kompetitivna (konkurentna). Ireverzibilna inhibicija je neuklonjiva i progresivna. Kompetitivni inhibitor je spoj koji je po svojoj strukturi veoma sličan pravom supstratu i veže se u aktivno središte i tako konkurira supstratu pri vezanju na enzim. a ne možemo na nju utjecati promjenom koncentracije supstrata.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM inhibicije odnosno disocijacijskoj konstanti kompleksa enzim-inhibitor (Ki). E+S E+I Ks = [E] [S] [ES] ES EI Ki = [E] [I] [EI] E+P Ukupna koncentracija enzima jednaka je [E t ] = vo = Vm [S] K mI + [S] vo K [I] =1+ m × vI K I K m + [S] K s [ES] K [ES] [I] + [ES] + s × [S] [S] Ki  [I]  K mI = K m 1 +   K   i  VmI = Vm Primjer je kompetitivne inhibicije djelovanje benzojeve kiseline (homologa pravog supstrata . Km se u nekompetitivnoj inhibiciji ne mijenja. E+S ES + I ES E+P ESI 35 . Stupanj inhibicije ovisi o relativnom odnosu koncentracija supstrata i inhibitora tako da odgovarajućim povećanjem koncentracije supstrata možemo potpuno potisnuti djelovanje kompetitivnog inhibitora. jer je time jedan dio enzima uklonjen iz katalitičkog tijeka. Smanjuje se maksimalna brzina.katekola) na katekolazu. Do nekompetitivne inhibicije dolazi kad reverzibilna inhibicija ovisi isključivo o koncentraciji inhibitora. Nekompetitivni inhibitor ne veže se u samom aktivnom središtu. na primjer na kompleks ES. Akompetitivna inhibicija nastaje kad se inhibitor ne veže na slobodni enzim nego na neki enzimski oblik koji sam više ne može vezati supstrat. nekompetitivna (nekonkurentna) i akompetitivna inhibicija. već njegovo vezanje na enzim izaziva konformacijsku promjenu koja enzim učini neaktivnim. On zbog toga povećava prividnu Km vrijednost. što smanjuje ukupnu koncentraciju aktivnog enzima. a aktivni udio enzima zadržava početni afinitet za supstrat. Svaki od njih se na karakterističan način odražava u prividnim vrijednostima Km i Vm.

Primjeri učinka pH na enzimsku aktivnost prikazani su na slici 6.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ vi = Vm [I] 1+ Ki Km [I] 1+ Ki K mi = Mjerenje ovisnosti vo i [S] prikazano u Lineweaver-Burkovom dijagramu jasno predočuje kinetičke razlike različitih tipova inhibicije (Slika 5. 1 / Vo B D C A 1 / Vmax 1/[S] -1/Km Slika 5. C . Razumljivo je da će kiselost i ionska jakost medija značajno i specifično utjecati na katalitička svojstva enzima.nekompetitivna inhibicija. Grafičko odreñivanje tipa inhibicije po Lineweaver-Burku (A . Proteinska struktura enzima vrlo je osjetljiva na kiselost medija.kompetitivna inhibicija. 36 .neinhibirana reakcija.II Utjecaj pH na brzinu enzimske reakcije Katalitičko središte enzima sastoji se od katalitičkih i veznih mjesta koja moraju biti u odgovarajućem prostornom razmještaju i ionizacijskom obliku kako bi moglo doći do uspješne katalize.akompetitivna inhibicija). jer ukupna prostorna konformacija ovisi i o slabim nekovalentnim vezama od kojih su mnoge elektrostatske prirode.). D . IV. B . Zbog toga mnogi enzimi postižu maksimalnu katalitičku učinkovitost samo u ograničenom području pH.

Utjecaj pH na brzinu enzimske reakcije. jer se proteinske molekule razlikuju u termičkoj stabilnosti. Utjecaj temperature na brzinu enzimske rekcije (A i B). Konformacijski prijelazi su ponekad spori. Kvarterne strukture su osjetljive na nisku temperaturu. enzimi koji kataliziraju istu kemijsku reakciju. pa i vrijeme izlaganja određenoj nefiziološkoj temperaturi utječe na katalitička svojstva enzima. 37 .III Utjecaj temperature na brzinu enzimske reakcije Temperatura ima dvojaki utjecaj na brzinu enzimske reakcije. Primjer oligomernih enzima su izoenzimi. Temperaturni učinak bit će različit za različite enzime. Povišenjem temperature iznad fiziološke temperature može doći do promjene konformacije ili denaturacije proteinske molekule. ali se razlikuju po svojim fizikalno-kemijskim osobinama. A) B) 50°C % maksimalne brzine 100 – apsorbancija produkta 60°C 40°C 70°C 80°C 50 – 20 40 t (°C) 60 80 vrijeme (minute) Slika 7. Primjeri utjecaja temperature na brzinu enzimskih reakcija prikazani su na slici 7. što će djelomice ili posve onesposobiti katalitičko djelovanje. pa uzorke oligomernih enzima nije poželjno čuvati u zamrzivaču. Stoga se za mjerenje kinetike u dijagnostičke svrhe mora osigurati standardna temperatura od 30o ili 37oC. Brzina enzimske reakcije povećat će se u prosjeku za 10% uz povišenje temperature od 1 stupnja. IV. Izoenzimi se često prepoznaju upravo po svojstvenoj termičkoj stabilnosti.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM Slika 6. Povišenje temperature povećava kinetičku energiju sustava i reakcija nužno teče brže. ako se ti uzorci namjeravaju koristili za kinetička mjerenja.

D.. and Voet. R. Dwek. M. Ratcliffe. Price. 2. New York: John Wiley & Sons Inc. (1995) Biochemistry. R. (2001) Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists. Wormald. Literatura 1.. Oxford: Oxford University Press 38 .. A. G. C. N.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ V. J. R. Voet.

Reakcijom karbonilne skupine monosaharida i jedne od njegovih hidroksilnih skupina nastaju poluacetali ili poluketali. tetroze. a nalazimo je i u krvi i ostalim tjelesnim tekućinama. a aldotetroze. a gradivne su jedinice već spomenutih di-. A) B) otvoreni oblik (<1%) stvaranje poluacetala D-glukofuranoza (<1%) D-glukopiranoza (99%) Slika 5. 3-10 (kod oligosaharida) te >10 (kod polisaharida). jedini monosaharid koji se u stanicama nalazi samostalno. koja se naziva i voćni šećer. 39 .1 Ugljikohidrati Jedna od četiri osnovne skupine bioloških makromolekula su ugljikohidrati polihidroksialdehidi ili polihidroksiketoni opće formule (CnH2n0n)x. Na slici 5.) dočim x može biti 1 (kod monosaharida). pentoze. Monosaharidi mogu biti različiti metabolički intermedijari. aldopentoze i ketoheksoze stvaraju furanoze.2 prikazana ketoheksoza fruktoza.i polisaharida kao i nukleinskih kiselina i glikokonjugata.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM Vježba 5.1 D-glukoza. a ovisno o položaju novonastale hidroksilne skupine na anomernom Catomu razlikujemo α i β anomere. Aldoheksoze većinom stvaraju piranoze (reakcijom aldehidne skupine i hidroksilne skupine na petom C-atomu). pri čemu je n≥3 (te ovisno o tome razlikujemo trioze. pri čemu se rastvoreni oblik ugljikohidrata (koji nacrtan u linearnom obliku nazivamo Fischerovim prikazom) zatvara u ciklički oblik (koji prikazujemo Haworthovom projekcijom). Ugljikohidrati (sekvenciranje 5. Na taj se način stvaraju peteročlani prsteni (furanoze) ili šesteročlani prsteni (piranoze) koji osim ugljika sadrže i jedan atom kisika. dok je na slici 5. Pri tome karbonilni C-atom postaje asimetričan (anomeran). A) Linearan oblik – Fischerov prikaz B) Ciklički oblik – Haworthov prikaz. heksoze itd. koja se još naziva i grožđani šećer.1 prikazana je aldoheksoza glukoza. 2 (kod disaharida). oligo.

Fehlingova i Benedictova reakcija (Slika 5.3 prikazana je struktura saharoze. vezom između dvije hidroksilne skupine na anomernim C-atomima koji nastaju nakon ciklizacije linearnih oblika monosaharida) i struktura laktoze. uobičajenog stolnog šećera. Tromerova. a u vodenim otopinama postoji ravnoteža između otvorenih i cikličkih oblika. Linearan oblik – Fischerov prikaz i ciklički oblik – Haworthov prikaz. pa aldoze. Te se reakcije temelje na redukciji metalnih iona. a Nylanderova reakcija na redukciji bizmutovog nitrata do elementarnog bizmuta.4) vezom. djeluju kao reduktivna sredstva. pri čemu nastaju aldonske kiseline.4) zasnivaju se na redukciji bakrovog (II) sulfata u bakrov (I) oksid koji se taloži u obliku svijetlo crvenog taloga. Ukoliko hidroksilna skupina koja nastaje tijekom stvaranja poluacetala ili poluketala sudjeluje u stvaranju veze između monosaharida i druge molekule koja može. laktoza Aldehidna skupina ugljikohidrata lako se oksidira. ako nisu preko anomernog kisika povezane u glikozidnu vezu. 40 . koja se sastoji od glukoze i fruktoze međusobno povezanih α1 →β2 vezom (tj.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ D-fruktoza (linearni oblik) D-fruktofuranoza (Haworthov prikaz) Slika 5. To zapravo znači da se ne može ponovno spontano stvoriti slobodna karbonilna skupina. koji se taloži u obliku crnog mulja. U krutom stanju monosaharidi su u cikličkom obliku. koji se sastoji od galaktoze i glukoze povezanih β(1. ali ne mora biti ugljikohidrat (takvu vezu nazivamo glikozidnom vezom). Različitim vrstama obojenih reakcija može se utvrditi je li određeni ugljikohidrat reduktivan.3 Saharoza i laktoza. Na slici 5. mliječnog šećera.2 D-fruktoza. saharoza Slika 5. ciklički oblik monosaharida ne može se više rastvoriti u linearan oblik.

pa ne pokazuju pozitivne reakcije reduktivnih šećera. ketoza enol aldoza Slika 5. a heksoza 5-hidroksimetil-furfural).BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM R−C −H + 2Cu2+ + 5OH. Slika 5.+ Cu2O + 3H2O || || C C Slika 5.4) vezom.4) vezom. Polisaharidi. sadrže premalo slobodnih reduktivnih krajeva u usporedbi s velikom količinom vezanih šećera. U prisutnosti koncentrirane sulfatne kiseline monosaharidi se dehidratiraju stvarajući derivate furfurala (pentoza daje furfural. U skupinu polisaharida ubraja se u biljnom svijetu široko rasprostranjeni škrob. U spiralnu strukturu amiloze može se u reakciji s Lugolovom otopinom (otopinom elementarnog joda u kalijevom jodidu) interkalirati jod čime nastaje plavo-ljubičasto obojenje. Prema nijansama obojenja moguće je razlikovati pentoze od heksoza. polimeri više od 10 jedinica monosaharida.4 Benedictova reakcija. Prisutnost ugljikohidrata u vodenim otopinama moguće je dokazati Molischovom reakcijom. polisaharid koji sadrži glukoze povezane β(1.→ R−C −O. U prisutnosti reduktivnog šećera taloži se svijetlo crveni bakrov (I) oksid i nastaje aldonska kiselina. Ketoze nije moguće razlikovati od aldoza u reakcijama na reduktivne šećere jer se te reakcije provode u blago lužnatom mediju u kojem se uspostavlja ravnoteža između aldoznih i ketoznih oblika preko enolnih oblika (keto-enolna tautomerija. ali se razgranatost postiže i α(1.4) vezom) i u manjoj mjeri od amiloze (kod koje su molekule glukoze povezane također α(1.6) vezom).6). Celuloza.5 Keto-enolna tautomerija ketoza i aldoza.5). Benedictov reagens sadrži bakrov (II) sulfat u alkalnoj vodenoj otopini natrijevog citrata i natrijevog karbonata. U kiseloj sredini u kojoj se odvija Molischova reakcija polisaharidi hidroliziraju na monosaharide. ne boja se jodom. U daljnjim reakcijama s α-naftolom furfurali stvaraju ljubičasto obojene kondenzacijske produkte (Slika 5. koji se sastoji većinom od amilopektina (glukoznih jedinica povezanih α(1. 41 .

1 mg/mL) u dest. Prikazana je A) dehidratacija glukoze u 5-hidroksimetil-furfural i B) konačan produkt reakcije s αnaftolom. vodi humani serum 10% ekstrakt krumpira u 40 mM fosfatnom puferu pH 7. ne vežu boju Coomassie Blue G250. 5. za razliku od proteina. što je temelj za Bradfordovu reakciju. Spektrofotometrijskim mjerenje apsorbancije (λ = 595 nm) otopine proteina uz Bradfordov reagens može se odrediti koncentracija ukupnih proteina u uzorku (uz konstruiranje baždarnog pravca na temelju apsorbancija otopina proteina poznatih koncentracija). 0. ugljikohidrata (Molischovom reakcijom) i reduktivnih ugljikohidrata (Benedictovom reakcijom). ali i koncentracije proteina u smjesi. U kiseloj se otopini boja Coomassie Blue 250 uglavnom veže na bočne ogranke bazičnih aminokiselina pri čemu se boja otopine mijenja iz zelenkaste u plavu. Bradfordova je reakcija jedna od nekoliko metoda određivanja prisutnosti. 5.1 U/μL) u fiziološkoj otopini kravlje mlijeko (koje sadrži laktozu) nerazrijeđeno i razrijeđeno 1:10 destiliranom vodom 1% otopina škroba u dest. U različitim uzorcima provjerite prisutnost: škroba (Lugolovom reakcijom).BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ A) 5-hidroksimetil-furfural B) obojani furfuril-difenilmetan Slika 5.6 Molischova reakcija. Ugljikohidrati. vodi zasićena otopina fruktoze u dest. vodi zasićena otopina glukoze u dest.3 Reagencije • • • • • • • • • 42 laktaza (β-galaktozidaza. vodi zasićena otopina saharoze u dest.0 . vodi otopina goveđeg serumskog albumina (BSA. proteina (Bradfordovom reakcijom).2 Zadaća Razgradite laktozu u mlijeku djelovanjem enzima laktaze te odredite prisutnost i koncentraciju na taj način nastale glukoze u mlijeku.

0 . Koncentracija glukoze određuje se pomoću komercijalno dostupnih test-traka na kojima se odvijaju dvije enzimske reakcije u slijedu: glukoza-oksidaza katalizira oksidaciju glukoze iz uzorka u glukonsku kiselinu pri čemu se stvara i vodikov peroksid.5% H3PO4 u dest.7. Slobodna aldehidna skupina ugljikohidrata oksidira dvovalente ione bakra pri čemu nastaju aldonske kiseline i narančasti talog bakrovog (I) oksida.5 Načelo postupka Laktoza iz mlijeka razgrađuje se djelovanjem enzima laktaze na glukozu i galaktozu. Jod iz Lugolove otopine interkalira se u spiralnu strukturu amiloze koja je sastavni dio škroba pri čemu se boja mijenja iz smeđe u plavo-ljubičastu. 0.1) približne koncentracije 15 μg/mL suncokretovo ulje Lugolova otopina (2% I2/ 10% KI u dest. 1.5 mL stalak za epruvete od 1. vodi) 5% α-naftol u 96% etanolu koncentrirana H2SO4 5.5 mL automatske pipete nastavci za automatske pipete testne trake za semikvantitativno određivanje glukoze (primjerice Keto-Diastix®.5 mM natrijev citrat. Bayer) staničevina staklene epruvete stalak za staklene epruvete kapaljke vodena kupelj ili čaša i grijač staklene boce drvene hvataljke za epruvete 5. 43 .05 g/L Coomassie Blue G250 u 5% metanol/8. odnosno povećava se apsorbancija pri valnoj duljini od 595 nm. vodi) Benedictov reagens (0.67 M natrijev citrat i 70 mM bakrov (II) sulfat pentahidrat u dest. Koncentrirana sulfatna kiselina uzrokuje hidrolizu složenih ugljikohidrata na monosaharide koji potom stvaraju derivate furfurala. peroksidaza potom katalizira reakciju vodikovog peroksida s kalij-jodidnim kromogenom pri čemu nastaje smeđe obojani produkt (intenzitet boje ovisi o koncentraciji glukoze u uzorku).4 Pribor • • • • • • • • • • • • plastične epruvete od 1.95 M natrijev karbonat. vodi) Bradfordov reagens (0. pH 7. Bočni ogranci bazičnih aminokiselina u proteinima vežu boju Coomassie Blue G250 pri čemu se mijenja boja otopine u plavu. Derivati furfurala s α-naftolom u konačnici stvaraju ljubičasto obojene produkte.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM • • • • • • • otopina DNA iz kravljeg timusa u puferu SSC/10 (15 mM NaCl.

BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ 5. 5) otopine proteina BSA. 5.3 Dokazivanje prisutnosti proteina Bradfordovom metodom • • • 11 plastičnih epruveta obilježite brojevima. 6) seruma. Obje epruvete inkubirajte 15 minuta pri sobnoj temperaturi. 5. 4) otopine fruktoze. 11) suncokretovog ulja. 11) suncokretovog ulja.6 Postupak 5. 10) vode u koju dodajte komadić staničevine. stavite na stalak i u njih kapnite 6 kapi (~200 μL) sljedećih uzoraka: 1) otopine škroba. 11) suncokretovog ulja.6. 7) ekstrakta krumpira. 9) otopine DNA. 3) otopine glukoze. 10) vode u koju dodajte komadić staničevine. U svaku pojedinu epruvetu kapnite po 3 kapi Lugolove otopine (~100 μL) i protresite epruvete. U svaku pojedinu epruvetu dodajte 1 mL Bradfordovog reagensa i protresite epruvete. 5. U pojedinu epruvetu uronite po jednu testnu traku za određivanje razine glukoze. 5) otopine proteina BSA. 2) otopine saharoze. Pazite da ne uzmutite smjesu tijekom 44 . 6) seruma. 7) ekstrakta krumpira. U svaku pojedinu epruvetu dodajte 6 kapi (~200 μL) otopine α-naftola i protresite epruvete. 4) otopine fruktoze. 2) otopine saharoze.1 Priprema uzorka mlijeka koje ne sadrži laktozu • • • • • Po 1 mL nerazrijeđenog kravljeg mlijeka otpipetirajte u 2 plastične obilježene epruvete od 1. stavite na stalak i u njih kapnite 3 kapi (~100 μL) sljedećih uzoraka: 1) otopine škroba. U jednu epruvetu dodajte 50 μL otopine laktaze. stavite na stalak i u njih otpipetirajte redom po 1 mL sljedećih uzoraka: 1) otopine škroba.5 mL. U svaku pojedinu epruvetu dodajte pažljivo kapaljkom uz stijenku epruvete oko 0. 9) otopine DNA.2 Dokazivanje prisutnosti škroba Lugolovom reakcijom • • • 11 plastičnih epruveta obilježite brojevima. 10) vode u koju dodajte komadić staničevine. 8) razrijeđenog mlijeka.4 Dokazivanje prisutnosti ugljikohidrata Molischovom reakcijom • • • 11 plastičnih epruveta obilježite brojevima. 8) razrijeđenog mlijeka. odmah je izvadite van i s trake uklonite višak mlijeka pomoću staničevine. 8) razrijeđenog mlijeka.6. 3) otopine glukoze.5 mL koncentrirane sulfatne kiseline. 4) otopine fruktoze. 3) otopine glukoze. 6) seruma.6. Zabilježite promjenu boje iz zelenkaste u plavu koja označava pozitivnu reakciju. Zabilježite promjenu boje iz smeđe u plavo-ljubičasto koja označava pozitivnu reakciju. Nakon 30 sekundi usporedite testno polje za glukozu sa skalom boja na pakiranju testnih traka te zaključite kolika je koncentracija glukoze u uzorcima. 2) otopine saharoze. 5) otopine proteina BSA. 9) otopine DNA. 7) ekstrakta krumpira.6.

III) Molischovim reagensom i IV) Benedictovim reagensom i zašto: a. Nakon dodatka sulfatne kiseline nemojte protresati epruvete! Nakon 5 minuta utvrdite je li u sredini pojedine epruvete nastao ljubičasti prsten koji upućuje na pozitivnu reakciju. albumin e. and Roehm. 3) otopine glukoze.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM • dodavanja koncentrirane sulfatne kiseline. J. 2) otopine saharoze. 8) razrijeđenog mlijeka. 3. 3. Voet. (2005) Color Atlas of Biochemistry.7 Zadaci 1. N-acetil-D-galaktozamin d. D-glukarna kiselina c. (1995) Biochemistry. http://www. 2.8 Literatura 1.org/carbohydrates. 5) otopine proteina BSA. b) celulozu i c) glikogen izlažete djelovanju α-amilaze iz sline uz prisutnost Lugolove otopine. Epruvete pomoću drvene hvataljke stavite u čašu s vrućom vodom i zagrijavajte do pojave narančastog obojenja (što predstavlja pozitivnu reakciju) ili do razbistravanja otopina (što predstavlja negativnu reakciju). U svaku pojedinu epruvetu dodajte 1 mL Benedictovog reagensa i protresite epruvete. stavite na stalak i u njih kapnite 10 kapi (~300 μL) sljedećih uzoraka: 1) otopine škroba.biochemweb. Pretpostavite i objasnite rezultate pokusa u kojem a) škrob.6. imunoglobulin G f. maltoza 2. K. 5. J. Koolman. II) Bradfordovim reagensom. New York: John Wiley & Sons Inc. Je li u reakcijama na reduktivne ugljikohidrate moguće razlikovati Dgliceraldehid od dihidroksiacetona? Obrazložite! 5. 10) vode u koju dodajte komadić staničevine. D. 9) otopine DNA. 6) seruma. 4) otopine fruktoze.H. D-glukozamin b. Koji će od navedenih uzoraka pokazivati pozitivnu reakciju s I) Lugolovom otopinom. 11) suncokretovog ulja. 7) ekstrakta krumpira. Stuttgart: Thieme Verlag.5 Dokazivanje prisutnosti reduktivnih ugljikohidrata Benedictovom reakcijom • • • 11 staklenih epruveta obilježite brojevima. 5. and Voet.shtml 45 .

1 α-linolenska kiselina. Slika preuzeta s (2).BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ Vježba 6. Slika 6. za razliku od proteina.adicijom halogena ili oksidacijskim reakcijama. 46 .). kao što je oksidacija pomoću KMnO4. Neki lipidi sadrže fosfatnu kiselinu (fosfolipidi) ili šećerne strukture (glikolipidi). U organizmima se rijetko nalaze u slobodnom obliku. dočim se one kod kojih postoje takve veze nazivaju nezasićenima (Slika 6. a alkoholni dio može biti trovalentni alkohol glicerol (masti i ulja). Zasićene masne kiseline uglavnom se nalaze u proizvodima poput mesa i mlijeka. Nezasićena masna kiselina koju nalazimo u lanenim sjemenkama. Velika većina lipida su esteri u kojima je kiselinska komponenta dugolančana masna kiselina (jedna ili više). a u velikim se količinama nalaze u tkivima koja služe za pohranu energije.1. dok se nezasićene masne kiseline najčešće nalaze u biljnim namirnicama i ribi.1 Lipidi Lipidi su biološke makromolekule raznolikih struktura koje. nukleinskih kiselina i polisaharida nisu polimeri. Stupanj nezasićenosti masnih kiselina u mastima i uljima može se odrediti reakcijama dvostruke veze . nezasićene masne kiseline – „dobre“). Naziva se još i ω-3 masnom kiselinom jer se prva dvostruka veza nalazi na trećem ugljikovom atomu od kraja (hidrofobni rep). Lipidi 6. Neki su lipidi izoprenoidnog porijekla: alkani karakterizirani dugim lancima s višestruko konjugiranim dvostrukim vezama (β-karoten) ili izoprenoidi višestruko ciklizirani u steroidne strukture (kolesterol i steroidni hormoni). većinom su esterificirane te su kao takve sastavnica membrana stanica i organela. Masne su kiseline nerazgranate karboksilne kiseline koje sadrže 4-24 (najčešće 16 do 18) ugljikova atoma. Unos masnih kiselina povezuje se s razinom kolesterola u krvi i povećanim rizikom od razvoja srčanih bolesti (zasićene masne kiseline – „loše“. One koje ne sadrže dvostruke veze među ugljikovim atomima nazivaju se zasićenim masnim kiselinama. dvovalentni dugolančani aminoalkohol sfingozin (sfingolipidi). jednovalentni dugolančani alkohol (voskovi) ili jednovalentni sterolni alkohol (esteri kolesterola). Jedna od njihovih najvažnijih osobina je netopljivost ili vrlo slaba topljivost u vodi.

Hidrofobni dio detergenta može biti raznolike strukture (primjerice linearan ili razgranati ugljikovodični lanac ili sterolni prsten deoksikolata).2). dakle. palmino ili drugo biljno ulje. kationske ili neionske polarne skupine.3-distearil-2-palmitil-glicerata nastaju glicerol. Na slici A) i B) sivo su osjenčani hidrofobni dijelovi. C) micela – hidrofobni dijelovi čine unutrašnjost. iako se mogu koristiti i biljne masti. soli (većinom natrijeve i kalijeve) masnih kiselina. Hidrofilni dio detergenta čine anionske. kao što su kokosovo. a plavo zaokruženi i osjenčani hidrofilni dijelovi molekula.3). A) Slijed reakcija kojima iz triacilglicerola (estera glicerola i tri masne kiseline) uz dodatak lužine nastaje sapun (sol masnih kiselina) i u konačnici alkohol (glicerol). Smanjujući površinsku napetost vode i emulgirajući lipide omogućavaju njihovo otapanje u vodi. a kod sapuna je hidrofobni dio zapravo lanac masne kiseline (Slika 6. Sapuni su. B) Kemijski prikaz ukupne reakcije saponifikacije kojom iz 1.2 Sapuni i detergenti stvaraju micele.3 Saponifikacija. odnosno tri molekule sapuna. A) triacilglicerol lužina sapun + diacilglicerol lužina sapun + monoacilglicerol lužina sapun + glicerol B) O CH2O CHO C O C O CH2O C C17H33 CH2OH C17H33 C15H31 + 3 NaOH CH2OH CHOH + 2 C17H33COO-Na+ + C15H31COO-Na+ Slika 6.2 Saponifikacija Sapuni i detergenti su amfifilne molekule koje u vodenom okružju stvaraju micele – hidrofilni dijelovi molekula okreću se prema vodi.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM 6. a hidrofilni vanjsku stranu micele koja je okrenuta prema vodi. 47 . Nastaju reakcijom saponifikacije koja uključuje hidrolizu triacilglicerola i neutralizaciju masnih kiselina jakom lužinom (Slika 6. U pripremi sapuna najčešće se koriste trigliceridi životinjskog porijekla. A) sapun (natrijev stearat) i B) detergent (natrijev-pdodecilbenzensulfonat). a hidrofobni jedan prema drugome stvarajući unutrašnjost micele. natrijev palmitat i dvije molekule natrijevog stearata. A) C) B) Slika 6. a hidrofilni dio sapuna karboksilna skupina.

Stupanj nezasićenosti masne kiseline može se odrediti pomoću KMnO4. .6 Načelo postupka Lipidi su topljivi u nepolarnim otapalima pomoću kojih se mogu ekstrahirati iz smjese.5 g tako usitnjene čokolade prebacite u označenu staklenu čašicu. voda ohlađena na 4°C detergent aceton 2% otopina KMnO4 u dest. vodi dest. Sapuni i detergenti omogućavaju otapanje lipida u vodi.5 Pribor • • • • • • • • • • staklene čaše (10 mL i 400 mL) magnetska miješalica s grijačem magnet za miješanje stakleni štapić stakleni lijevak filter papir Erlenmayerova tikvica staklene epruvete vaga kapaljka 6. koji oksidira dvostruku vezu između ugljikovih atoma masne kiseline.7. 6.1 Ekstrakcija lipida i odreñivanje stupnja nezasićenosti masnih kiselina • • 48 U tarioniku usitnite čokoladu te 0. vodi biljno ulje 5 M NaCl u dest. 6.4 Reagencije • • • • • • • • • 20% otopina NaOH u dest. Napravite sapun miješanjem jake lužine i jestivog ulja te ispitajte učinkovitost otapanja ulja tako priređenog sapuna i komercijalno pribavljenog detergenta. vodi mliječna čokolada lanene sjemenke 6.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ 6.3 Zadaća Ekstrahirajte lipide iz uzorka čokolade i lanenih sjemenki acetonom te odredite stupanj nezasićenosti ekstrahiranih lipida oksidacijom pomoću KMnO4. U tarioniku usitnite lanene sjemenke te 0. Reakcijom jake lužine i ulja nastaje sapun.5 g tako usitnjenih sjemenki prebacite u drugu označenu staklenu čašicu.7 Postupak 6.

Usporedite maslinovo ulje i maslac obzirom na udio zasićenih i nezasićenih masnih kiselina. destilirana voda b. 3. Zagrijavajte dok ne nastane gusta smjesa (približno 30 minuta). U svih šest epruveta dodajte po tri kapi ulja. Miješajte staklenim štapićem nekoliko minuta dok se sapun ne odvoji od stijenki čaše.3 Osobine sapuna i detergenta • • • • • • U tri epruvete ulijte po 5 mL destilirane vode. Drugu i petu epruvetu povremeno promiješajte staklenim štapićem. Usporedite temperaturu taljenja zasićenih i nezasićenih masnih kiselina. a u druge tri epruvete po 5 mL tvrde vode (u tu svrhu koristite vodovodnu vodu). fiziološka otopina c. Taj aceton služi kao slijepa proba. pratite promjene boje tijekom 10 minuta i objasnite ih. • • • 6.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM • • • • U svaku pojedinu čašu dodajte 5 mL acetona i smjese miješajte staklenim štapićem oko 1 minutu. 6.2 Saponifikacija • • Pomiješajte 15 mL 20% otopine NaOH i 10 mL suncokretovog ulja u staklenoj čaši od 400 mL. petroleter 49 .7. Zagrijavajte svih šest epruveta. 6. Filtrirajte kroz obični filter papir u Erlenmayerovu tikvicu uz dva dodatna ispiranja s po 100 mL vode koju ste prethodno ohladili u frižideru. a u slučaju prejakog kipljenja. U drugu i petu epruvetu dodajte malo (vrh špatule) pripremljenog sapuna. između ostalog. smanjite zagrijavanje. Filtriranjem kroz filter papir postavljen na stakleni lijevak sakupite topljive frakcije tih dvaju smjesa u dvije suhe epruvete. u kojima će β-karoten biti topljiv i po čemu to možete zaključiti: a. Smjesu maknite s grijača i u nju odmah ulijte 150 mL 5 M otopine NaCl. Promatrajte što se događa te zapišite svoja zapažanja. 2. Poželjno je da smjesa lagano kipi.8 Zadaci 1. Dodajte magnet za miješanje i zagrijavajte na magnetskoj miješalici uz konstantno miješanje. U sve tri epruvete dodajte 1 kap 2% KMnO4. U treću suhu epruvetu dodajte volumen acetona jednak onima koji imate u drugim epruvetama. U treću i šestu epruvetu dodajte 100 μL detergenta. 50% etanol u destiliranoj vodi d. Ukoliko naribanu mrkvu stavite u navedena otapala. 96% etanol e. U mrkvi se. za koji je karakteristična izoprenska struktura.7. nalazi i β-karoten.

Voet. http://biology.com/med/Alpha-linolenic_acid. 4. odnosno princip na kojem se temelji primjena sapuna i detergenata kao sredstava za čišćenje. (1995) Biochemistry. New York: John Wiley & Sons Inc.about. 3. D. Podrobno objasnite mehanizam djelovanja sapuna i detergenta. and Voet J.9 Literatura 1.htm http://chemistry.gif http://www.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ f.msu.cem.nicerweb. 2. 6.com/od/cleanerchemistry/a/how-soap-cleans.edu/~reusch/VirtualText/lipids.htm 50 . suncokretovo ulje 4.

Termička denaturacija DNA (sekvenciranje 7.1 Shematski prikaz denaturacije DNA. promjeni pH ili promjeni ionske jakosti. Planarne bazne parove čine adenin i timin povezani dvjema vodikovim vezama te gvanin i citozin povezani trima vodikovim vezama. Baze su smještene u unutrašnjosti uzvojnice. nitasta molekula sastavljena od velikog broja deoksiribonukleotida. Lanci uvijaju oko zajedničke osi i međusobno su antiparalelni. Preuzeto i prilagođeno iz (1). dočim deoksiriboze i fosfatne skupine imaju strukturnu ulogu. a fosfatne i šećerne jedinice u vanjskom dijelu. dva se lanca DNA odvajaju te DNA prelazi iz konformacije dvostruke uzvojnice u konformaciju nasumičnog klupka (Slika 7. U sastavu molekule DNA nalazimo četiri različite dušične baze: purinske baze adenin (A) i gvanin (G) te pirimidinske baze timin (T) i citozin (C). Purinske ili pirimidinske baze u DNA nositelji su genske informacije.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM Vježba 7. DNA se sastoji od dva polinukleotidna lanca čije smjerove označavamo 5'-3'. 51 .1 Deoksiribonukleinska kiselina Deoksiribonukleinska kiselina (DNA) je vrlo dugačka. Fosfodiesterska veza povezuje 3'-hidroksilnu skupinu jedne deoksiriboze s 5'hidroksilnom skupinom susjedne. Tu pojavu nazivamo komplementarnošću baznih parova. Oni su izgrađeni od dušičnih baza te šećera i fosfata. sastoji se od deoksiriboza povezanih fosfodiesterskim vezama. Okosnica DNA. Lanci su povezani vodikovim vezama koje stvaraju baze u unutrašnjosti uzvojnice te van der Waalsovim interakcijama među bazama usporedno s osi uzvojnice.1).2 Denaturacija DNA Ukoliko se vodikove veze među bazama razore uslijed izlaganja povišenoj temperaturi. 7. konstantna duž cijele molekule. Slika 7. Taj se proces naziva denaturacija.

Preuzeto i prilagođeno iz (1). Ta se pojava naziva hiperkromizam i rezultat je gubitka interakcija među elektronskim sustavima gusto složenih baza u DNA. Tm. apsorpcija odgovarajuće smjese slobodnih nukleotida je oko 40% viša od apsorpcije molekule DNA. ionska jakost i pH otopine te prisutnost drugih molekula koje se vežu na DNA.2 B). A) B) Slika 7. Svaki poremećaj dvostruke uzvojnice ogleda se kao povećavanje optičke gustoće prema vrijednostima karakterističnim za slobodne baze (Slika 7. Primjerice. što je karakteristično za pojedine baze). B) Krivulja mekšanja DNA. Stabilnost dvostruke uzvojnice DNA. Veličina Tm linearno je razmjerna molarnom udjelu baznih parova GC. Iz nje se može očitati temperatura pri kojoj je postignuto 50% denaturacije i koju nazivamo temperaturom mekšanja. već samo povećava njezinu vrijednost. Tri vodikove veze koje povezuju gvanin i citozin stabilnije su od dviju vodikovih veza između adenina i timina. ovisi o nekoliko čimbenika kao što su sastav baza DNA. a time i njezin Tm.2 A)). 52 . Međutim. Denaturacija ne mijenja značajno oblik apsorpcijske krivulje. Prilikom denaturacije događaju se i promjene optičke gustoće. karakteristična velika viskoznost otopine nativne DNA. Heterociklički prstenovi nukleotida jako apsorbiraju svjetlost ultraljubičastog područja (s maksimumom blizu 260 nm. To znači da je denaturacija DNA kooperativni proces pri čemu razaranje dijela strukture destabilizira ostatak i potiče daljnju denaturaciju. koja je posljedica krute strukture dvostruke uzvojnice. izrazito se smanjuje kada DNA prelazi u oblik razmjerno slabo međusobno povezanih jednostrukih lanaca.2 A) Apsorpcijski spektar u UV području nativne i termički denaturirane DNA iz bakterije Escherichia coli. Tm se povećava za oko 0. Kada se DNA nalazi u otopini pri približno fiziološkim uvjetima. Krivulja mekšanja je prikaz ovisnosti apsorbancije otopine DNA o temperaturi (Slika 7. Hiperkromni pomak se pri određenoj valnoj duljini (najčešće 260 nm) odvija unutar uskog temperaturnog područja.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ Denaturacija je praćena kvalitativnim promjenama fizikalnih svojstava DNA.4°C ako se udio GC baznih parova poveća 1%.

ali i proteini koji se vežu na jednolančanu DNA. Odredite Tm iz krivulje mekšanja. Ako se otopina denaturirane DNA naglo ohladi na temperaturu znatno nižu od Tm. odnosno zauzima nativnu konformaciju. Denaturacija i renaturacija DNA bitne su za biološku ulogu ove molekule pri procesima replikacije i transkripcije. Promjena pH koja uzrokuje protoniranje ili deprotoniranje baza narušava vodikove veze među njima te dovodi do denaturacije DNA. DNA se renaturira. 53 . otopina denaturirane DNA polagano hladi do temperature 20-25°C manje od Tm. Ukoliko se promijenjeni parametri sustava koji su uzrokovali denaturaciju DNA (primjerice temperatura) vrate na početne vrijednosti. bilo koja molekula koja može stvoriti vodikove veze s funkcionalnim skupinama baza u DNA ili omesti slaganje baza jedne iznad druge može pridonijeti denaturaciji uzvojnice. što je vrijednost svojstvena genomu sisavaca. polymerase chain reaction . urea i formamid. pod istim uvjetima ima Tm oko 95°C. Oni se na toj temperaturi više ne mogu razdvojiti te se DNA postupno u cijelosti renaturira. pak. Takve su molekule. eng. Kako je elektrostatsko odbijanje istoimenih naboja ovisno o dielektričnoj konstanti otopine. destabilizira uzvojnicu DNA. Denaturacija DNA je reverzibilan proces. pri fiziološkim uvjetima ima Tm oko 87°C. Ako se. nastala DNA bit će samo djelomično dvolančana poradi toga što komplementarni lanci neće imati dovoljno vremena da se u u otopini susretnu i pravilno spare prije nego što se tako djelomično dvolančana struktura "smrzne" u otopini. heterogene DNA sadrže mnoštvo različitih fragmenata nastalih nasumičnim kidanjem kromosoma. Dvostruka uzvojnica odgovarajuće DNA samo je neznatno stabilnija od tako nastalih hibrida. temperaturni raspon pri kojem se takva DNA denaturira je širi. dok DNA koja sadrži 60% GC parova. komplementarni lanci RNA i DNA u procesu hibridizacije tvore dvolančane RNA-DNA hibride.PCR). Zapravo.) Stoga je bez intervencije staničnog sustava dvolančana DNA stabilna unutar stanice. Za razliku od homogenih. pogrešno sparenim dijelovima DNA omogući razdvajanje i ispravno sparivanje te na taj način stvaranje duljih komplementarnih sljedova. Tm kao mjera denaturacije DNA važan je čimbenik za mnoge eksperimentalne metode koje uključuju hibridizacije nukleinskih kiselina (primjerice. koje pri fiziološkim uvjetima imaju fosfatne skupine. povećanjem ionske jakosti povećava se dielektrična konstanta te se smanjuje međusobno odbijanje fosfatnih skupina. Na temperaturu mekšanja utječu i ionska jakost i vrijednost pH. Kako se Tm tih fragmenata razlikuju. Slično tome. lančana reakcija polimeraze.3 Zadaća Postupno zagrijavajte uzorak DNA do temperature 92°C i pratite denaturaciju mjerenjem apsorbancije pri valnoj duljini 260 nm. bit će dovoljno toplinske energije da se kratkim. denaturiraju se u uskom rasponu promjene temperature. Uzvojnica DNA se stabilizira.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM vrijednost Tm je obično unutar područja 85-95°C (DNA koja sadrži 40% GC parova. 7. Međusobno odbijanje negativnih naboja. primjerice. Homogene DNA (primjerice virusne ili plazmidne) koje se sastoje od identičnih kratkih dijelova. krivulja denaturacije se sužava i Tm raste.

1. uzorci DNA se zagrijavaju do određene temperature.0 7. Termičku denaturaciju DNA moguće je pratiti spektrofotometrijski. Budući da dostupan spektrofotometar nema termostatiranu kivetu koja bi se mogla postupno zagrijavati. Pri tome dolazi do renaturacije dijela lanca.4 Reagencije • • pufer SSC/10 (15 mM natrijev klorid. Nakon što je prikupljen i dobro ohlađen i posljednji uzorak. u dest. vodi . mjereći A260 u temperaturnom rasponu od sobne temperature do temperature potpune denaturacije. Predlažu se sljedeće temperature (°C): 25 • • 40 55 65 70 75 80 84 88 92 U prikladnu tablicu upisujte stvarnu temperaturu pri kojoj je uzorak izvađen. 7. uzorcima redom izmjerite A260. Kupelj postupno zagrijavajte do 92°C. na milimetarskom papiru nacrtajte graf ovisnosti apsorbancije o temperaturi te odredite temperaturu mekšanja (budući da se ona razlikuje od vrijednosti koju biste dobili mjerenjem kod stvarnih temperatura.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ 7. Epruvete stavite u stalak i uronite u vodenu kupelj. Kada se dostigne željena temperatura. po jednu epruvetu izvadite i odmah ohladite u smjesi leda i vode.5 mM natrijev citrat. označite je kao Tm0). Krivulja koja se konstruira iz dobivenih podataka u korelaciji je s krivuljom koja bi se dobila kao rezultat pokusa s termostatiranom kivetom.7 Postupak • • • Po 1 mL otopine DNA otpipetirajte u 10 plastičnih obilježenih epruveta.5 mL stalak za epruvete automatske pipete nastavci za automatske pipete vodena kupelj posuda sa smjesom leda i vode UV spektrofotometar kvarcna kiveta 7.6 Načelo postupka Izlaganjem povišenoj temperaturi DNA se denaturira. a zatim naglo hlade u smjesi leda i vode.5 Pribor • • • • • • • • plastične epruvetice od 1. 54 . pH 7.1) – standardni pufer za eksperimente denaturacije otopina DNA izolirana iz kravljeg timusa u puferu SSC/10 – uzorak 7.

Voet. New York: John Wiley & Sons Inc.2 M otopini natrijevog klorida Tm DNA je 75°C.9 Literatura 1. 55 . D. U drugoj otopini ista DNA ima Tm od 100°C. (1995) Biochemistry. Kakva svojstva ima nepoznata otopina u odnosu na 0. J. and Voet. Koje sile združuju dva lanca molekule DNA? 2. U 0.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM 7.8 Zadaci 1.2 M otopinu natrijevog klorida? 7.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->