Bruceloza

-goveda
-(ovaca)
-(svinja)
Dijagnoza
OIE: “...Unequivocal diagnosis of Brucella
infections can be made only by the isolation
and identification of Brucella, but in situations
where bacteriological examination is not
practicable, diagnosis must be based on
serological methods...”.
methods
• Identifikacija uzročnika
– Mikroskopski preparat
– Kultura
– Identifikacija i određivanje biotipova
– Biološki ogled
– PCR
• Serološki testovi
– Buffered Brucella Ag test (Rose Bengal Test®)
– Buffered agglutination plate test
– RVK
– ELISA
– Fluorescence polarisation assey
• Drugi testovi
– Kožni alergološki test
– SAT
– RID
– Ispitivanje mleka
• Milk i-ELISA
• Milk ring test (mlečnoprstenasta proba)
– Interferon gamma test
 Laboratorijska dijagnostika

OPREZ!!!
Čovek je veoma prijemčiv na infekciju
sa Brucella vrstama.

BSL 3
 Uzorci
• Abortus
– Fetus ili fetalna tkiva (sadržaj želuca, slezina, pluća)
– Fetalne membrane
– Vaginalni sekret (bris)
– Kolostrum

• Za potrebe monitoringa
– Krv
– mleko
 Uzorci
• Trupovi
– Lnn (glave, mlečne žlezde, genitalnih organa)
– Slezina
– Uterus
• Kasni graviditet
• Ubrzo nakon porođaja
– Mlečna žlezda

• Mleko i mlečni proizvodi

 Mikroskopski preparat
Brucelle su G- kokobacili ili kratki štapići

Pojavljuju se pojedinačno, ređe u paru ili malim grupama

Ne formiraju spore niti pravu kapsulu, nemaju flagelu i nisu pokretni
 Mikroskopski preparat
Stampova modifikacija Ziehl-Neelsen-ovog bojenja
- koristi se za pregled briseva
organa ili telesnih tečnosti
ili za ID formirane kulture
- fiksira se toplotom ili
etanolom
- boje se crveno na plavoj
pozadini

*Chlamidiophilla abortus (C. psittaci)

i Coxiella burnetii takođe prouzrokuju
abortus, a teško se differentuju na
osnovu MZV – potrebna kultura
Mikroskopski preparat
 Kultura
• Osnovne podloge
– 5-10% krvni agar
– TSA (tryptose soy agar) + 2-5% Bo/Eq serum
– SDA (serum dekstrozni agar)

• Selektivne podloge (gore navedene mogu se koristiti za proizvo-

dnju selektivnih podloga uz dodatak Ab)
– Farrell’s medium
(osn. medijum + polimiksin B + bacitracin + vankomicin + natamicin + nistatin + nalidiksinka kiselina)
* Bacitracin i nalidiksinka kiselina imaju inhibitorno dejstvo na neke B. abortus i B. melitensis sojeve

– Thayer-Martin’s medium
(osn. medijum + Hb + kolistin + vankomicin + nitrofurantion + nistatin + amfotericin B)
 Kultura
Ako je broj organizama u uzorku mali (mleko,
kolostrum, neka tkiva) potrebno je uraditi
inokulaciju ispitujućeg materijala u podloge za
obogaćivanje u koje se dodaju Ab

• TSA bujon ili SDA bujon

Inkubacija na 37°C, uz 5-10% CO2 do 6 nedelja

 Kultura
• Kolonije postaju vidljive nakon 2-3 dana

• 4. dana inkubacije:
– okrugle, ø = 1-2mm
– sjajne, providne,
plavkaste
– rastu u S formi
(glatki rubovi)
(B. ovis i B. canis uvek rastu u R formi , a ostale u
početku izoloacije rastu u S formi, a kasnije mogu da
formiraju R kolonije, pogotovo ako se radi o
subkulturama)
 Kultura

Culture showing colonies of Brucella melitensis on blood agar

 Kultura
Kolonije starije od 4 dana:
– postaju veće i tamnije
– može doći do naknadnog razvoja R formi
(važi bilo za B. abortus, B. melitensis, B. suis)

R forme su:
manje transparentne, više mat bele do smeđe,
više granulirane i trošne pri dodiru ezom

Da li su stvorene R forme?? →
bojenje kristal violet bojom
- S forme – ne usvajaju boju
- R forme – se boje
 Identifikacija i tipizacija
• Sve kolonije sa morfologijom koja je liči na
kolonije Brucella boje se po Gramu i MZN
• Neke Lab koriste fluorescentna At za ID

• Nakon sagledavanja morfoloških karakteristika

kulture i mikrobiološkog preparata rade se:
– Ispitivanja biohemijskih karakteristika
– SAT test
– Fagotipizacija
 Identifikacija i tipizacija
Biohemijske karakteristike:
- ne izazivaju hemolizu (sve brucele)
osnovu ovih karakteristika

- potreba CO2 za rast

Diferencijacija vrsta na

- produkcija H2S (trake Pb-acetata)

- ureaza aktivnost
- rast u prisustvu boja
- oksidaza (sve)
Identifikacija i tipizacija
Rast u prisustvu boja
 Identifikacija i tipizacija
SAT test sa monospecifičnim A, M i R serumom:
B. abortus, B. melitensis i B. suis poseduju
zajedničke površinske Ag – A i M antigene, koji su
prisutni u različitim proporcijama na površini ove
3 vrste brucela.

Samo će permanentne R forme aglutinirati sa R

monospecifičnim serumom (B. ovis, B. canis).

*pripremi se rastvor ispitivane kulture brucela. Tri kapi rastvora se stavljaju na ploču. Svakoj
kapi se dodaje jedan monospecifičan serum. Meša se i aglutinacija se očitava nakon jednog
minuta.
 Identifikacija i tipizacija
• Fagotipizacija:

• PCR

• Biološki ogled

• Identifikacija vakcinalnih sojeva

– na osnovu biohemijskih karakteristika
– upotrebom specifičnih PCRs
 ID brucela kod Su i Ov
• Bruceloza svinja (B. suis):
– uzorci su slični kao kod bruceloze goveda
– uvek formira S kolonije koje se ne razlikuju od S
kolonija drugih brucela
– potvrda vrste i biovara se zasniva na fagotipizaciji,
produkciji H2S i rastu u prisustvu boja
– PCR

• Bruceloza ovaca i koza (B. melitensis, B. ovis)

– isto kao kod bruceloze goveda
(- mikroskopski pregled ejakulata, kultura ejakulata i palpacija testisa)
7 biotipova

3 biotipa

5 biotipova
 Serološki testovi
– Buffered Brucella Ag test (Rose Bengal Test®)
– Buffered agglutination plate test
– RVK
– ELISA
– Fluorescence polarisation assey
Bo - 12m BAB (RBT) I – ELISA C-ELISA
klanje
Ov/Cap – 6m ili FPA ili RVK
 Buffered Brucella Ag test (Rose Bengal Test®)

- test aglutinacije
- Ag: inaktivisan B. abortus S99 ili S1119-3,
obojen Rose Bengal bojom
Procedura:
1. uzorke i Ag zagrejati na 22±4°C
2. 25μl seruma staviti na pločicu
3. dodati 25μl antigena iz bočice u blizinu seruma
4. pomešati serum i Ag staklenim štapićem
5. mešati lagano sledeća 4 minuta na sobnoj temperaturi
6. očitavanje rezultata – bilo koja vidljiva reakcija se smatra pozitivnom

*lažno pozitivni: Vcc životinja

lažno negativni (retko): razvoj prozone – razrediti serum ili ponovo testirati nakon 4-6 nedelja
Rose Bengal Test®
 Buffered agglutination plate test

- Ag: B. abortus S1119-3

- Boje: brilijant zelena i kristal violet
Procedura:
1. uzorke i Ag zagrejati na 22±4°C
2. 80μl seruma staviti na pločicu
3. dodati 30μl antigena iz bočice u blizinu seruma
4. pomešati serum i Ag staklenim štapićem
5. Pločicu okrenuti 3x (ravnomerna disperzija reagenasa)
6. Inkubacija tokom 4min u vlažnoj komori na sobnoj temperaturi
7. Izvaditi ploču, opet je rotirati 3x i vratiti na drugu 4-minutnu inkubaciju
8. očitavanje rezultata – bilo koja vidljiva reakcija se smatra pozitivnom

*lažno pozitivni: Vcc životinja

lažno negativni (retko): razvoj prozone – treba razrediti serum ili ponovo testirati
 RVK
• koristi se kao potvrdni test
• komplikovan
• izvodi se u mikrotitar formatu

• inaktivacija seruma (60±2°C; 30min)

• razređivanje seruma:
jedno razređenje ili serija razređenja
1. Serum se stavlja u prva tri reda.
2. Prvi red je antikomplementarna kontrola. U njega se dodaje CFT pufer
3. CFT pufer se stavlja u sve bazenčiće osim one u u drugom redu.
4. Serije razređenja seruma se prave dodavanjem 25μl od trećeg rada pa nadalje
5. 25μl mešavine iz poslednjeg reda se izbacuje
6. Ag (25μl) određenog razređenja se dodaje u svaki osim u prvi red
7. Komplement (25μl) određenog razređenja se dodaje u svaki red
8. Ploče se inkubiraju (37°C, 30min ili na 4°C preko noći)
9. U svaki bunarčić se dodaju Er ovna
10. Ploče se inkubiraju (37°C, 30min )
11. Centrifugiranje
12. Očitavanje rezultata
(stepen hemolize se upoređuje sa stadardima koji odgovaraju 0, 25, 50, 75 i 100% lize)
 ELISA
• indirektna ELISA

• kompetitivna ELISA
 Indirektna ELISA
Ag: cela ćelija
sLPS - smooth lipopolsaccharide
OPS – O-polysaccharide

- I-ELISA sa sLPS ili OPS ipak ne može da diferentuje

vakcinalna At

- Koriste se monoklonski ili poliklonski antiglobulini

 Indirektna ELISA

1. čvrsta komponenta je Ag
2. dodaje se ispitivani serum
3. nevezana At se ispiraju
4. dodaje se konjugovano anti-At
5. nevezani konjuat se ispira
6. dodaje se supstrat
7. procena razvoja boje vrši se spektrofotometrom
 Kompetitivna ELISA
1. čvrsta komponenta je Ag -Upotrebom mAt posignuta je visoka
2. Dodaju se mAt i odmah ispitivani serum specifičnost i uklonjene su većina ali ne
3. Inkubacija sve ukrštrne reakcije sa dr. bakterijama
4. Ispiranje nevezanih At iz seruma i mAt
5. Dodaju se konjugovani anti-mouse IgG -C-ELISA je sposobna da eliminše većinu
6. Inkubacija reakcija sa rezidualnim vakcinalnim At
7. Ispiranje nevezanih konjugata (moguća diferencijacija Vcc od inficiranih)
8. Dodaje se supstrat
9. Procena razvoja boje spektrofotometrom - Ipak moguće su lažne pozitivne reakcije
 Flourescence polarisation test
- U lab ili na terenu; brz test
- Zasniva se na rotaciji molekula u rastvoru.
- Molekularna veličia utiče na rotaciju. Mali
molekuli se rotiraju brže od velikih
- Molekul se obeleži fluorohromom, a vreme
rotacije se određuje merenjem intenziteta
polarizovane tečnosti
- Veliki molekuli emituju više svetla (više
polarizovani), nego mali koji se brže rotiraju i
emituju više depolarizovane svetlosti
 Flourescence polarisation test
- Ag male molekulske težine obeležen
fluorohromom se dodaje u serum koji se
ispituje na prisustvo specifičnih At
- Ako je At prisutno, vezaće se za obeleženi Ag i
prouzrokovaće smanjenje njegove rotacije.

- Senzitivnost i specifičnost FPA testa za

brucelozu je skoro identična onoj kod C-ELISA
 Drugi testovi
– Kožni alergološki test
– SAT
– RID
– Ispitivanje mleka
• Milk i-ELISA
• Milk ring test (mlečnoprstenasta proba)
– Interferon gamma test
 Kožni alergološki test
• Alergen – brucellin (INRA®)– pripremljen je od
R forme B. melitensis. Ne sadrži sLPS pa ne
prouzrokuje nespecifičnu inflamatornu
reakciju niti ometa kasnije izvođenje
seroloških reakcija
• Visoka specifičnost – seronegativna neVcc grla
koja raguju pozitivno smatraju se inficiranim
• Nedostatak – ne reaguju sva inficirana grla
 Kožni alergološki test
1. koža repnog nabora, boka ili vrata
2. 0.1ml brucelina intradermalno
3. očitavanje nakon 48-72h
4. debljina kože se meri pre i posle aplikacije
5. zadebljanje kože za 1.5-2mm smatra se
pozitivnim
 Drugi testovi
• Serum agglutination test (SAT)

• Radial immunodiffusion (RID)

• Interferon gamma test

 Testiranje mleka
• Efikasan način za skrining mlečnog stada
• Nedostatak – testraju se samo grla u laktaciji
• Pozitiva grla se retestiraju serološkim metodama

• I-ELISA
• MRT (milk ring test)
 Mlečnoprstenasta proba
• U zapatu sa >100 grla – test je manje pouzdan
<150 grla – 1ml uzorka zbirnog mleka
150-450 grla – 2ml uzorka
450-700 grla – 3ml uzorka

• Lažno pozitivni rezultati:

» grla Vcc 4 meseca ili manje pre testiranja
» uzorci koji sadrže kolostrum
» uzorci koji sadrže mleko krava sa mastitisom

• Ag: inaktivisana B. abortus S99 ili S1119-3

obojen hematoksilinim ili tetrazolom
 Mlečnoprstenasta proba
1. dodaje se 30-50μl Ag u 1-2ml
uzorka
2. inkubacija (37°C tokom 1h
ili na 4°C tokom noći kad raste
osetljivost)
3. pozitivna reakcija – formiranje
tamno plavog prstena iznad mleka
(formiranje bilo kakvog plavog
prstena smatra se pozitivnim
pogotovo ako se radi o uzorku
poreklom od velikog broja krava)
4. negativna – boja mleka je tamnija
(homogeno obojeno)
od sloja masti na površini
Serološka dijagnostika bruceloze svinja
• ELISA*: I-ELISA, C-ELISA *Antigen:
kao za Dg bruceloze goveda
• FPA* (B. abortus)
• RBT*
• CFT*

• Kožni alergološki test

– brucellin – R forma B. melitensis B115
– intradermalno – koža baze uha ili baze repa
– pozitivno – eritem i otok, nekad čak i nekroza
 Serološka dijagnostika bruceloze
ovaca i koza
• Rose Bengal
• CFT
• I-ELISA
• FPA
*Probe na mleku se ne vrše
• Kožni alergološki test
– brucellin – R forma B. melitensis B115
– intradermalno – donji kapak
– pozitivan – zadebljanje kapka veće od 2mm