P. 1
Bruceloza

Bruceloza

5.0

|Views: 696|Likes:
Published by Ђорђе

More info:

Published by: Ђорђе on Feb 08, 2011
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF or read online from Scribd
See more
See less

07/08/2013

Bruceloza -goveda

-(ovaca) -(svinja)
Dijagnoza

OIE: “...Unequivocal diagnosis of Brucella infections can be made only by the isolation and identification of Brucella, but in situations where bacteriological examination is not practicable, diagnosis must be based on serological methods methods...”.

• Identifikacija uzročnika
– Mikroskopski preparat – Kultura – Identifikacija i određivanje biotipova – Biološki ogled – PCR

• Serološki testovi
– Buffered Brucella Ag test (Rose Bengal Test®) – Buffered agglutination plate test – RVK – ELISA – Fluorescence polarisation assey

• Drugi testovi
– Kožni alergološki test – SAT – RID – Ispitivanje mleka
• Milk i-ELISA • Milk ring test (mlečnoprstenasta proba)

– Interferon gamma test

Laboratorijska dijagnostika
OPREZ!!! Čovek je veoma prijemčiv na infekciju sa Brucella vrstama.

BSL 3

Uzorci
• Abortus
– – – – Fetus ili fetalna tkiva (sadržaj želuca, slezina, pluća) Fetalne membrane Vaginalni sekret (bris) Kolostrum

• Za potrebe monitoringa
– Krv – mleko

Uzorci
• Trupovi
– Lnn (glave, mlečne žlezde, genitalnih organa) – Slezina – Uterus
• Kasni graviditet • Ubrzo nakon porođaja

– Mlečna žlezda

• Mleko i mlečni proizvodi

Mikroskopski preparat
Brucelle su G- kokobacili ili kratki štapići Pojavljuju se pojedinačno, ređe u paru ili malim grupama Ne formiraju spore niti pravu kapsulu, nemaju flagelu i nisu pokretni

Mikroskopski preparat
Stampova modifikacija Ziehl-Neelsen-ovog bojenja
- koristi se za pregled briseva organa ili telesnih tečnosti ili za ID formirane kulture - fiksira se toplotom ili etanolom - boje se crveno na plavoj pozadini
*Chlamidiophilla abortus (C. psittaci) i Coxiella burnetii takođe prouzrokuju abortus, a teško se differentuju na osnovu MZV – potrebna kultura

Mikroskopski preparat

Kultura
• Osnovne podloge
– 5-10% krvni agar – TSA (tryptose soy agar) + 2-5% Bo/Eq serum – SDA (serum dekstrozni agar)

• Selektivne podloge
– Farrell’s medium

(gore navedene mogu se koristiti za proizvodnju selektivnih podloga uz dodatak Ab)

(osn. medijum + polimiksin B + bacitracin + vankomicin + natamicin + nistatin + nalidiksinka kiselina) * Bacitracin i nalidiksinka kiselina imaju inhibitorno dejstvo na neke B. abortus i B. melitensis sojeve

– Thayer-Martin’s medium
(osn. medijum + Hb + kolistin + vankomicin + nitrofurantion + nistatin + amfotericin B)

Kultura
Ako je broj organizama u uzorku mali (mleko, kolostrum, neka tkiva) potrebno je uraditi inokulaciju ispitujućeg materijala u podloge za obogaćivanje u koje se dodaju Ab • TSA bujon ili SDA bujon Inkubacija na 37°C, uz 5-10% CO2 do 6 nedelja

Kultura
• Kolonije postaju vidljive nakon 2-3 dana • 4. dana inkubacije:
– okrugle, ø = 1-2mm – sjajne, providne, plavkaste – rastu u S formi (glatki rubovi)
(B. ovis i B. canis uvek rastu u R formi , a ostale u početku izoloacije rastu u S formi, a kasnije mogu da formiraju R kolonije, pogotovo ako se radi o subkulturama)

Kultura

Culture showing colonies of Brucella melitensis on blood agar

Kultura
Kolonije starije od 4 dana:
– postaju veće i tamnije – može doći do naknadnog razvoja R formi
(važi bilo za B. abortus, B. melitensis, B. suis)

R forme su: manje transparentne, više mat bele do smeđe, više granulirane i trošne pri dodiru ezom Da li su stvorene R forme?? → bojenje kristal violet bojom - S forme – ne usvajaju boju - R forme – se boje

Identifikacija i tipizacija
• Sve kolonije sa morfologijom koja je liči na kolonije Brucella boje se po Gramu i MZN • Neke Lab koriste fluorescentna At za ID • Nakon sagledavanja morfoloških karakteristika kulture i mikrobiološkog preparata rade se:
– Ispitivanja biohemijskih karakteristika – SAT test – Fagotipizacija

Identifikacija i tipizacija
Biohemijske karakteristike:
- ne izazivaju hemolizu (sve brucele)
Diferencijacija vrsta na osnovu ovih karakteristika

-

potreba CO2 za rast produkcija H2S (trake Pb-acetata) ureaza aktivnost rast u prisustvu boja

- oksidaza (sve)

Identifikacija i tipizacija
Rast u prisustvu boja

Identifikacija i tipizacija
SAT test sa monospecifičnim A, M i R serumom:
B. abortus, B. melitensis i B. suis poseduju zajedničke površinske Ag – A i M antigene, koji su prisutni u različitim proporcijama na površini ove 3 vrste brucela. Samo će permanentne R forme aglutinirati sa R monospecifičnim serumom (B. ovis, B. canis).
*pripremi se rastvor ispitivane kulture brucela. Tri kapi rastvora se stavljaju na ploču. Svakoj kapi se dodaje jedan monospecifičan serum. Meša se i aglutinacija se očitava nakon jednog minuta.

Identifikacija i tipizacija
• Fagotipizacija: • PCR • Biološki ogled • Identifikacija vakcinalnih sojeva
– na osnovu biohemijskih karakteristika – upotrebom specifičnih PCRs

ID brucela kod Su i Ov
• Bruceloza svinja (B. suis):
– uzorci su slični kao kod bruceloze goveda – uvek formira S kolonije koje se ne razlikuju od S kolonija drugih brucela – potvrda vrste i biovara se zasniva na fagotipizaciji, produkciji H2S i rastu u prisustvu boja – PCR

• Bruceloza ovaca i koza (B. melitensis, B. ovis)
– isto kao kod bruceloze goveda
(- mikroskopski pregled ejakulata, kultura ejakulata i palpacija testisa)

7 biotipova

3 biotipa

5 biotipova

Serološki testovi
– Buffered Brucella Ag test (Rose Bengal Test®) – Buffered agglutination plate test – RVK – ELISA – Fluorescence polarisation assey

Bo - 12m Ov/Cap – 6m

BAB (RBT) ili FPA

I – ELISA

C-ELISA ili RVK

klanje

Buffered Brucella Ag test (Rose Bengal Test®)

- test aglutinacije - Ag: inaktivisan B. abortus S99 ili S1119-3, obojen Rose Bengal bojom
Procedura: 1. uzorke i Ag zagrejati na 22±4°C 2. 25μl seruma staviti na pločicu 3. dodati 25μl antigena iz bočice u blizinu seruma 4. pomešati serum i Ag staklenim štapićem 5. mešati lagano sledeća 4 minuta na sobnoj temperaturi 6. očitavanje rezultata – bilo koja vidljiva reakcija se smatra pozitivnom *lažno pozitivni: Vcc životinja lažno negativni (retko): razvoj prozone – razrediti serum ili ponovo testirati nakon 4-6 nedelja

Rose Bengal Test®

Buffered agglutination plate test - Ag: B. abortus S1119-3 - Boje: brilijant zelena i kristal violet
Procedura: 1. uzorke i Ag zagrejati na 22±4°C 2. 80μl seruma staviti na pločicu 3. dodati 30μl antigena iz bočice u blizinu seruma 4. pomešati serum i Ag staklenim štapićem 5. Pločicu okrenuti 3x (ravnomerna disperzija reagenasa) 6. Inkubacija tokom 4min u vlažnoj komori na sobnoj temperaturi 7. Izvaditi ploču, opet je rotirati 3x i vratiti na drugu 4-minutnu inkubaciju 8. očitavanje rezultata – bilo koja vidljiva reakcija se smatra pozitivnom *lažno pozitivni: Vcc životinja lažno negativni (retko): razvoj prozone – treba razrediti serum ili ponovo testirati

RVK
• koristi se kao potvrdni test • komplikovan • izvodi se u mikrotitar formatu • inaktivacija seruma (60±2°C; 30min) • razređivanje seruma: jedno razređenje ili serija razređenja

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Serum se stavlja u prva tri reda. Prvi red je antikomplementarna kontrola. U njega se dodaje CFT pufer CFT pufer se stavlja u sve bazenčiće osim one u u drugom redu. Serije razređenja seruma se prave dodavanjem 25μl od trećeg rada pa nadalje 25μl mešavine iz poslednjeg reda se izbacuje Ag (25μl) određenog razređenja se dodaje u svaki osim u prvi red Komplement (25μl) određenog razređenja se dodaje u svaki red

8. Ploče se inkubiraju (37°C, 30min ili na 4°C preko noći) 9. U svaki bunarčić se dodaju Er ovna 10. Ploče se inkubiraju (37°C, 30min ) 11. Centrifugiranje 12. Očitavanje rezultata (stepen hemolize se upoređuje sa stadardima koji odgovaraju 0, 25, 50, 75 i 100% lize)

ELISA
• indirektna ELISA

• kompetitivna ELISA

Indirektna ELISA
Ag: cela ćelija sLPS - smooth lipopolsaccharide OPS – O-polysaccharide - I-ELISA sa sLPS ili OPS ipak ne može da diferentuje vakcinalna At - Koriste se monoklonski ili poliklonski antiglobulini

Indirektna ELISA

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

čvrsta komponenta je Ag dodaje se ispitivani serum nevezana At se ispiraju dodaje se konjugovano anti-At nevezani konjuat se ispira dodaje se supstrat procena razvoja boje vrši se spektrofotometrom

Kompetitivna ELISA
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. čvrsta komponenta je Ag Dodaju se mAt i odmah ispitivani serum Inkubacija Ispiranje nevezanih At iz seruma i mAt Dodaju se konjugovani anti-mouse IgG Inkubacija Ispiranje nevezanih konjugata Dodaje se supstrat Procena razvoja boje spektrofotometrom -Upotrebom mAt posignuta je visoka specifičnost i uklonjene su većina ali ne sve ukrštrne reakcije sa dr. bakterijama -C-ELISA je sposobna da eliminše većinu reakcija sa rezidualnim vakcinalnim At (moguća diferencijacija Vcc od inficiranih) - Ipak moguće su lažne pozitivne reakcije

Flourescence polarisation test
- U lab ili na terenu; brz test - Zasniva se na rotaciji molekula u rastvoru. - Molekularna veličia utiče na rotaciju. Mali molekuli se rotiraju brže od velikih - Molekul se obeleži fluorohromom, a vreme rotacije se određuje merenjem intenziteta polarizovane tečnosti - Veliki molekuli emituju više svetla (više polarizovani), nego mali koji se brže rotiraju i emituju više depolarizovane svetlosti

Flourescence polarisation test
- Ag male molekulske težine obeležen fluorohromom se dodaje u serum koji se ispituje na prisustvo specifičnih At - Ako je At prisutno, vezaće se za obeleženi Ag i prouzrokovaće smanjenje njegove rotacije. - Senzitivnost i specifičnost FPA testa za brucelozu je skoro identična onoj kod C-ELISA

Drugi testovi
– Kožni alergološki test – SAT – RID – Ispitivanje mleka
• Milk i-ELISA • Milk ring test (mlečnoprstenasta proba)

– Interferon gamma test

Kožni alergološki test
• Alergen – brucellin (INRA®)– pripremljen je od R forme B. melitensis. Ne sadrži sLPS pa ne prouzrokuje nespecifičnu inflamatornu reakciju niti ometa kasnije izvođenje seroloških reakcija • Visoka specifičnost – seronegativna neVcc grla koja raguju pozitivno smatraju se inficiranim • Nedostatak – ne reaguju sva inficirana grla

Kožni alergološki test
1. koža repnog nabora, boka ili vrata 2. 0.1ml brucelina intradermalno 3. očitavanje nakon 48-72h 4. debljina kože se meri pre i posle aplikacije 5. zadebljanje kože za 1.5-2mm smatra se pozitivnim

Drugi testovi
• Serum agglutination test (SAT) • Radial immunodiffusion (RID) • Interferon gamma test

Testiranje mleka
• Efikasan način za skrining mlečnog stada • Nedostatak – testraju se samo grla u laktaciji • Pozitiva grla se retestiraju serološkim metodama • I-ELISA • MRT (milk ring test)

Mlečnoprstenasta proba
• U zapatu sa >100 grla – test je manje pouzdan
<150 grla – 1ml uzorka zbirnog mleka 150-450 grla – 2ml uzorka 450-700 grla – 3ml uzorka

• Lažno pozitivni rezultati:
» grla Vcc 4 meseca ili manje pre testiranja » uzorci koji sadrže kolostrum » uzorci koji sadrže mleko krava sa mastitisom

• Ag: inaktivisana B. abortus S99 ili S1119-3 obojen hematoksilinim ili tetrazolom

Mlečnoprstenasta proba
1. 2. dodaje se 30-50μl Ag u 1-2ml uzorka inkubacija (37°C tokom 1h ili na 4°C tokom noći kad raste osetljivost) pozitivna reakcija – formiranje tamno plavog prstena iznad mleka (formiranje bilo kakvog plavog prstena smatra se pozitivnim pogotovo ako se radi o uzorku poreklom od velikog broja krava) negativna – boja mleka je tamnija (homogeno obojeno) od sloja masti na površini

3.

4.

Serološka dijagnostika bruceloze svinja
• • • • ELISA*: I-ELISA, C-ELISA FPA* RBT* CFT*
*Antigen: kao za Dg bruceloze goveda (B. abortus)

• Kožni alergološki test
– brucellin – R forma B. melitensis B115 – intradermalno – koža baze uha ili baze repa – pozitivno – eritem i otok, nekad čak i nekroza

Serološka dijagnostika bruceloze ovaca i koza
• • • • Rose Bengal CFT I-ELISA FPA *Probe na mleku se ne vrše • Kožni alergološki test
– brucellin – R forma B. melitensis B115 – intradermalno – donji kapak – pozitivan – zadebljanje kapka veće od 2mm

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->