Interpretacija rezultata krvne slike
Osnovne tri vrste ćelija: leukociti, eritrociti, trombociti
Laboratorijske metode u hematologiji
Prof Violeta Dopsaj
4 Interpretacija rezultata krvne slike
1 2
Broj ćelija
Eritrociti
Danas se broj Er odreñuje isključivo na hematološkom brojaču
Leukociti
Na hematološkom brojaču
Mikroskopskom metodom u komori
Trombociti
Na hematološkom brojaču
Mikroskopskom metodom u komori (Breckerr-Cronkitea-ova
metoda)
Brojanje trombocita u krvnom razmazu (Fonio metoda), može se
posmatrati veličina (veliki, džinovski, mali trombociti)
3 4
Tri odeljka leukocita: u koštanoj srži, perifernoj krvi i tkivu
Granulociti nastaju u koštanoj srži tokom sazrevanja od 6-10 dana
prolaze kroz mitotički odeljak (do mijelocita) i postmitotički odeljak
(metamijelocit, štapićasti granulocit, segmentirani granulocit)
U perifernoj krvi borave 6 – 12 sati
Ćelije prethodnice monocita sazrevaju u koštanoj srži 3-5 dana,
u perifernoj krvi se zadržavaju 1-2 dana a zatim odlaze u tkiva-
makrofage
U perifernij krvi se nalaze funkcionalno aktivne i krajnje
diferencirane ćelije: granulociti i monociti
Segmentirani granulociti i monociti koji se transportuju u tkiva se ne
vraćaju u krvotok
5 6
Prof Violeta Dopsaj 2009/10
Broj
Morfologija ćelija
Leukocitarna formula-normalan nalaz
• Krvni razmaz obojen metodom May-Grunwald Giemsa
• Leukocitarna formula odreñena 3-part diff tehnologijom
(3 subpopulacije leukocita: neutrofili, mononukleusne ćelije i
limfociti)
• Leukocitarna formula odreñena 5-part diff tehnologijom
(5 subpopulacija leukocita: limfociti, monociti, neutrofili,
eozinofili, bazofili)
LEUKOCITI
Leukociti su ćelije sa jedrom
Odeljak leukocita podeljen u dve osnovne grupe:
• Fagociti: granulociti i monociti
• Ćelije imunog sistema: T i B limfociti, NK ćelije
Osnovna klinička analiza:
Ukupan broj leukocita (Ehrlich, 1878.g)
Najveći broj leukocitoza i leukopenija su posledica nehematoloških
patofizioloških procesa
Uz ukupan broj leukocita sledeća analiza je
Diferencijalna krvna slika - leukocitarna formula
Limfociti sazrevaju i diferenciraju se u:
primarnim limfoidnim organima (nezavisno od antigena) i
sekundarnim limfoidnim organima (zavisno od antigena)
Za razliku od granulocita mogu ponovo dospeti u perifernu
krv (limfom)
Periferna krv je odeljak hematopoetskog sistema u kojem se
nalazi manje od 50% ukupnih leukocita u organizmu
Ukupan broj leukocita bez leukocitarne formule ima mali
diferencijano-dijagnostičku vrednost zbog cirkadijalnog
ritma (najniži ujutru, najviši popodne) i influentnih faktora
1
 Broj Le se menja u toku života: Emocionalna uznemirenost
Na roñenju neutrofilija, (intenzivno plakanje povećava Le do 45%)
Od 10.dana do 5-7.godine života limfocitoza (do 60% Ly)
U trudnoći blaga leukocitoza (do 15 x 109/L) sa neutrofilijom
U reproduktivnom periodu žene imaju više Le u odnosu na (do 7. meseca trudnoće)
muškarce
U menopauzi su leukociti niži Samo ako se poremećen ukupan broj Le poveže sa:
Fizičko vežbanje povećava Le sa limfocitozom
(limfociti se oslobañaju iz perifernih kapilara i jetre) 1. Leukocitarnom formulom
2. Kliničkim stanjem pacijenta i
Leukocite povećavaju: 3. Ponovi više puta odreñivanje ukupnog broja Le
Hladnoća, vrućina, bol, povraćanje, kofein, tein, unošenje hrane,
pušenje (do 12 x 109/L) Kliničar može zaključiti kakvi su patofiziološki procesi
doveli do poremećaja broja Le

7 8

Histogram leukocita (3-part diff) Granice izneñu regiona na

Limfociti Mononukleari
Region 1 35-100 fL: limfociti
Region 2 100-150 fL: mononukleusne celije
Region 3 150-450 fL: granulociti
35, 90, 160 i 450 fL
Granulociti
Na histogramu leukocita u
regionu ispod 35 fL (R1) ne
bi trebalo da se nalazi ništa,
ali ipak se mogu naći:
džinovski Tr, agregati Tr,
NRBC, nelizirani Er,
krioglobulini, lipidne partikule
iz parentaralne ishrane, i sl
R2-region izmeñu limfo i mono:
atipični limfociti, blasti, plazma ćelije, bazofilija
R3-region izmeñu mono i granulocita:
nezreli granulociti, blasti, abnormalne ćelije, eozinofilija
R4-visoki apsolutni broj neutrofila
RM-promene registrovane u više regiona
9 10

Histogram leukocita (5-part diff) Normalna raspodela subpopulacija leukocita

u 3D data plotu: 5-part diff

Mono
Lymp

Neut

Baso
limfociti
Eos
monociti
neutrofili

eozinofili
bazofili

11 12

Prof Violeta Dopsaj 2009/10 2

 5 diff scaterplott Intraindividualna Ukupna greška (%)
varijacija (CV)
Hemoglobin 2.8 4.1
Hct 2.8 4.1
Eritrociti 3.2 4.4
MCV 1.3 2.3
MCHC 1.7 2.2
RDW 3.5 4.6
Leukociti 10.9 14.6
Neutrofili 15.1 22.4
Limfociti 10.4 16
Monociti 17.8 27.9
Eozinofili 21 37.1
Bazofili 28 38.5
Trombociti 9.1 13.4
13 14

Smernice za ispitivanje leukocita i leukocitnih parametara

Leukocitarna formula: referentni intervali odrasli (Dacie)
Izražavanje rezultata
Broj leukocita (x 109/L) Neutrofili 2.0 - 7.0 x 109/L (40-80%)
Referentni interval (odrasli) 4 - 10 x 109/L Limfociti 1.0 - 3.0 x 109/L (20-40%)
Monociti 0.2-1.0 x 109/L (2-10%)
Leukocitarna formula Eozinofili 0.02-0.5 x 109/L (1-6%)
Svaka subpopulacija izražava se kao: a) relativan broj - procenat Bazofili 0.02-0.1 x 10 9/L (<1-2%)
b) apsolutan broj - preračunat na ukupan broj leukocita (na pr Štapovi 0-0.6 x 10 9/L (0-5%)
neutrofili x 109/L)
Vrednosti su date u širokom rasponu a razlikuju se prema
apsolutan broj = ukupan broj Le (109) x % subpopulacije vrsti hematološkog brojača i polu
subpopulacije 100
leukocita

15 16

Korak 1 Korak 3
Prvo pogledati ukupan broj leukocita (leukocitoza i leukopenija) Utvrditi prisustvo nezrelih ćelija koje nisu normalno prisutne u
Ukupan broj leukocita raste ili opada uglavnom kada se promeni krvnom razmazu, ili su prisutne u malom broju (štapovi)
broj jedne subpopulacije leukocita
Prisustvo većeg broja štapova ili ćelija mlañih od štapova
Korak 2 (metamijelociti, mijelociti..) skretanje u levo
Odredi se relativan i apsolutni broj svake subpopulacije leukocita Prolimfociti, limfoblasti
Promonociti, monoblasti
Povećan broj Smanjen broj
Mlade eozinofilne i bazofilne ćelije označavaju se kao nezrele
Neutrofili neutrofilija neutropenija ćelije, bez označavanja stadijuma
Eozinofili eozinofilija
Bazofili bazofilija NRBC - nucleated red blood cells, acidofilni eritroblasti, ne
Limfociti limfocitoza limfopenija liziraju pa mogu da povećavaju broj Le (mora se broj Le
Monociti monocitoza korigovati)
17 18

Prof Violeta Dopsaj 2009/10 3


Korak 4
Opisivanje izmenjene morfologije ćelija bele loze
Reaktivni, atipični limfociti
Prisutne inkluzije u citoplazmi
Prisutne toksične granulacije, vakuolizacija, Dohle-ova telašca
Kada nemamo hematološki brojač odredi se ukupan broj
leukocita i leukocitarna formula
U leukocitarnoj formuli nakon May-Grunwald bojenja diferencira
se 6 subpopulacija leukocita: neutrofili, limfociti, monociti,
eozinofili, stapićasti neutrofili, bazofili
Na hematološkom brojaču moguće je brzo, precizno i tačno
odrediti ukupan broj Le, i leukocitarnu formulu kao 3- ili 5-part
diff diferencijaciju
19
Indikacije za mikroskopski pregled krvnog razmaza
Na svaki Flaged uzorak treba obratiti pažnju i uključiti
mogućnost izrade krvnog razmaza, nakon provere uzorka
Abnormalna diferencijacija leukocita na hematološkom brojaču
(tek nakon provere preanalitičke faze)
Zahtev za odreñivanje udela nesegmentiranih neutrofila
(štapovi, metamijelociti, skretanje ulevo)
Vrednosti leukocita manje od 1.5 i veće od 20.0 x 109/L
Neslaganje izmeñu broja eritrocita i eritrocitnih indeksa
Najbolje je da ukoliko postoji klinička sumnja lekar traži
razmaz (bez obzira na normalan nalaz sa aparata)
20

Brojanje krvnih ćelija: eritrocita, trombocita, leukocita

Ispitivanje eritrocitnih parametara
Eritrociti: broj eritrocita, morfologija eritrocita
Normalan eritrocit (discocyt) Periferni tazmaz krvi zdrave osobe
Broj eritrocita (x 1012 /L) elektronska mikroskopija
Hemoglobin (g/L)
Hct (L/L, %)
MCV (fL)
MCH (pg)
MCHC (g/L)
RDW (%)
Morfologija
Bikonkavna ćelija diskoidnog oblika, prečnika 7-8 µm, sastoji se
od membrane i citoplazme (95% hemoglobin)
Citoplazma se boji crveno, nema granula, centralni deo svetlije boje
nema jedro, Goldžijev aparat, lizozome, nema sposobnost sinteze
21 proteina, ni RNK 22

Energija se dobija u ciklusu anaerobne glikolize (90-95%) i u Normalnu morfologiju imaju:

heksozo-monofosfatnom šantu (5-10%), nastaje ATP
Normalno 10% eritroblasta propada u kostnoj srži
Ukoliko je procenat veći radi se o neefektivnoj eritropoezi
Usporena sinteza hemoglobina (na pr nema Fe) dovodi do
povećane mitoze eritroblasta i nastaju mikrociti (mali eritrociti)
Krvarenje i hemoliza ubrzavaju eritropoezu, broj mitoza se
smanjuje a u cirkulaciju prelaze makrociti (veliki eritrociti) i
veći broj retikulocita
ER žive u cirkulaciji oko 120 dana
1% ER u cirkulaciji dnevno se raspadne i isto toliko stvori
u kostnoj srži u prisustvu činioca eritropoeze (Fe, B12, folna kis.)
normocitni eritrociti (imaju normalnu veličinu) i
normohromni eritrociti (imaju normalan sadržaj hemoglobina)
Fiziološke varijacije u morfologiji eritrocita:
ER novoroñenčeta se ne opisuju kao makrociti jer je normalno
da su ER veći nego kod odraslih
ER kod trudnice ne opisuju se kao poikolociti i anizociti
Različiti su stavovi laboratorija u opsivanju morfologije ER
Naglasiti da su ER normocitni i normohromni?
Ili naglasiti samo ako je morfologija ER abnormalna?

23 24

Prof Violeta Dopsaj 2009/10 4

 Primer 1
Hemoglobin
Hgb = 12 g/dL
Odreñivanje Hct = 36%
Cijanmethemoglobinska metoda, spetrofotometrijski Primenom pravila: 12 x 3 = Hct 36 %
Danas na aparatu reagens bez cijanida, sadrži Na lauril sulfat Prihvatljiva vrednost Hct 33 - 39 % (potvrñuje pravilo)
Cirkadijalni ritam (8% viši ujutru)
Primer 2
Hematokrit (hematokrit centrifuga) Hgb = 9 g/dL
Hematokritna vrednost (hematoloski brojač) Hct = 32%
Hct (L/L) = MCV (fL) x broj eritrocita (1012/L) Primenom pravila: 9 x 3 = Hct 27 %
Prihvatljiva vrednost Hct 24 - 30 % ( ne potvrñuje pravilo)
Pravilo "trojke": Hgb (g/dL) x 3 = Hct ± 3 (0.03 L/L)
Primer 3
Važi samo za normocitne normohromne eritrocite
Hgb = 15 g/dL
Odstupanje od pravila ukazuje na abnormalne eritrocite ili
Hct = 36%
je prvi znak greške
Primenom pravila: 15 x 3 = Hct 45 %
Ako je morfologija Er relativno normalna važi pravilo
25 Prihvatljiva vrednost Hct 42 - 48 % ( ne potvrñuje pravilo) 26

Eritrocitni indeksi
Ako se vrednost za Hct ne slaže sa dobijenom treba napraviti
razmaz Eritrocitni endeksi omogucavaju klasifikaciju eritrocita prema:
i tražiti abnormalnost eritrocita
Veličini
Primer 2: nañeni hipohromni Er, dobijena vrednost za Hct je tačna
Sadržaju hemoglobina
Ako nisu Er hipohromni ispitati uzrok neslaganja
Prosečna zapremina eritrocita – MCV
Primer 3: neslaganje zbog jake lipemije, uraditi slepu probu analize
MCV (fL) = Hct (L/L) ÷ broj eritrocita (1012/L)
Treba uvek naći uzrok zašto rezultat ne potvrñuje pravilo trojke
Prosecna količina hemoglobina u eritrocitu - MCH
Uzroci greške u odreñivanju hemoglobina
• Veliki broj Le i Tr daje lažno visok Hgb MCH (pg) = Koncentracija hemoglobina (g/L)
• Lipemija, uraditi slepu probu uzorka Broj eritrocita (1012/L)
• Prisustvo Hgb S rezistentnog na liziranje, razblažiti
uzorak destilovanom vodom da se smanji turbiditet Prosečna koncentracija hemoglobina u eritrocitima - MCHC
MCHC (g/L) = Koncentracija hemoglobina (g/L)
Hct (1)
27 28

RDW
Širina distribucije zapremine eritrocita
Indeks anizocitoze
IRON DEFICIENCY NORMAL IRON LOW B12 - FOLATE
RDW zavisi od vrste hematološkog brojača (15.8 ± 2.9 %)

RDW (%) = SD (širina histograma) x 100

MCV (fL)

MCV nizak MCV normalan MCV visok

HYPOCHROMIC RBC NORMAL RBC MEGALOBLASTIC RBC RDW α i β talasemija Anemija hroničnih bolesti Aplastična anemija
normalan (heterozigoti)
LOW MCV HIGH MCV
Anemija zbog
LOW MCH HIGH MCH RDW deficijencije gvožña Bolesti jetre Deficijencija folata
visok Hemoglobin H HLL, HGL (perniciozna anemija)
LOW MCHC NORMAL MCHC
S-β talasemija Mjelofibroza Hemolizna anemija

29 30

Prof Violeta Dopsaj 2009/10 5

 Normohromni Er: MCHC 320 - 370 g/L RDW = RBC Distribution width (CV) %

Hipohromni Er: MCHC manji od 320 g/L

Talasemija i deficijencija Fe

Hiperhromni Er: MCHC veći od 37 g/L

Izraz hiperhromni je pogrešan jer eritrocit ne može da sadrži
više od 370 g/L hemoglobina

MCHC veći od 370 g/L je greška zbog:

• Sferocita koji imaju izmenjen oblik Er pa izgledaju prepunjeni
• Greške u odreñivanju Hgb
• Prisustva hladnih aglutinina
RDW
31 RDW = Coeficient of variation of RBC volume 32

Smernice za ispitivanje eritrocita i eritrocitnih indeksa

Korak 4
Korak 1
RDW (indeks anizocitoze ukazuje na stepen heterogenosti u
Hgb i Hct, primeniti pravilo trojke
volumenu Er)
Značajne su jedino povišene vrednosti
Korak 2
Morfološka evaluacija razmaza kod povišenog RDW
MCV (klasifikacija prema zapremini Er)
Povišen RDW uvek posmatrati zajedno sa MCV
Normociti: Er u referentnom intervalu (aproksimativno 80-100 fL)
Mikrociti i makrociti za klasifikaciju anemija
Korak 5
Ispitivanje abnormalnosti eritrocita u krvnom razmazu
Korak 3
Veličina (anizocitoza)
MCHC (klasifikacija prema sadržaju hemoglobina)
Oblik (poikilocitoza)
Hipohromni eritrociti (MCHC ispod referentnog opsega)
Inkluzije (Howell-Jolly telašca)
Normohromni eritrociti
Mlade ćelije eritrocitne loze
Povećan MCHC kod: sferocita, lipemije, ikterusa, zbog
Obojenost ćelija
interferencije u odreñibanju Hgb
33 34

Korak 6 Normalan histogram eritrocita

Broj eritrocita i MCH Glavna populacija eritrocita
RBC se koristi u dijagnozi talasemija, kada je normalan ili povećan Ostali eritrociti
Ako je Hgb nizak, postoji sumnja na talasemiju
MCH treba da prati MCV (oblik i veličina)
Kada MCH ne prati MCV treba uključiti MCHC (detektuje se
neslaganje izmeñu veličine i sadržaja Hgb)

U ispitivanju RBC parametara ići sledećim redom:

Hgb za potvrdu ili isključivanje anemije
MCV: veličina ćelija
MCHC: sadržaj hemoglobina
RDW: anizocitoza Er se broje iznad 35 fL
Morfologija u razmazu u korelaciji sa numeričkim vrednostima sa U regionu 24-36 fL mogu se naći:
hematološkog brojača Fragmenti eritrocita, citoplazma leukocita,
35 veliki trombociti i agregati trombocita 36

Prof Violeta Dopsaj 2009/10 6

 MCV, MCH I MCHC upucuju na izgled eritrocita u razmazu i Ispitivanje trombocita i trombocitnih indeksa
smanjuju potrebu za izradom krvnih razmaza Broj trombocita (x 109 /L)
Srednji volumen trombocita (MPV) (fL)
Morfološka klasifikacija anemija Morfologija

Mikrocitna hipohromna Normocitna normohromna Makrocitna anemija

anemija anemija
MCV: 50-80 fL MCV: 82-94 fL
MCH: 12-25 pg MCH: 25-30 pg
Sideropenijska anemija Hemolizne anemije
Anemija hronične bolesti* Anemija zbog akutnog krvarenja
Talasemija Mijeloftizna anemija
Anemija kod trovanja Izolovana aplazija crvene loze
olovom Anemija hroničnih bolesti*
Anemija u hroničnoj bubrežnoj
insuficijenciji
Anemija u endokrinim bolestima
MCV: 95-150 fL
Trombociti su bezjedarni, diskoidni, bikonveksni fragmenti
MCH: 30-50 pg citoplazme megakariocita, veličine 2-3µm
Jako osetljive ćelije, reaguju na minimalnu stimulaciju
Megaloblastna anemija
Anemija u bolestima jetre Period sazrevanja u kostnoj srži 5 dana
Anemija u hroničnom
alkoholizmu
2/3 trombocita nalazi se u cirkulaciji, a ostatak u depou slezine.
Životni vek 7- 10 dana
Referentni interval (odrasli) 150 - 450 x 109/L

37 38

Korak 2
Smernice za ispitivanje trombocita MPV (veličina trombocita), analogno sa MCV
Ima značaja kod hemato-onkoloških pacijenata kada postoji
Korak 1 trombocitepenija a kostna srž kao odgovor produkuje mlañe,
Broj trombocita izvan refrentnog opsega veće Tr, pa je MPV povišen
Povećan broj Tr - trombocitoza (povećan rizik za trombozu) Zbog velike fiziološke varijacije u MPV kod zdravih osoba, kao i
Snižen broj Tr - trombocitopenija (povećan tizik za hemoragiju) zbog promene oblika pri dodatku EDTA, ima ograničen značaj
MPV prepoznaje abnormalno velike Tr
Broj Tr se posmatra zajedno sa brojem Le i Er
Korak 3
Pancitopenija - snižen broj Le, Er, Tr (akutna leukemija ili Morfologija Tr (veliki Tr: 2x veći od normalnih, i džinovski
aplastična anemija) trombociti: više od 2x veći od normalnih), ili porediti sa Er
Pancitoza - povećan broj Le, Er, Tr (policitemija vera) Agregati trombocita
Satelitizam trombocita

39 40

Pojava satelitizma trombocita (eng platelet satellitosis) kod nekih
pacijenata pedstavlja in vitro fenomen zbog stvaranja specifičnih
trombocitnih autoantitela
Prisustvo EDTA u in vitro uslovima dovodi do grupisanja trombocita
oko neutrofila, što se registruje na hematološkom brojaču
kao pseudotrombocitopenija (lažno snižen broj Tr) i
pseudoleukocitoza (lažno povišen broj Le), a sve kao posledica
grupisanja i agregacijeTr (eng platelet clumping)
Agregate trombocita aparat broji kao leukocite
Tr se broje u opsegu 2-20 fL i nastaju histogrami raspodele
veličina
Distribucija veličina koristi se za izradu log-normal krive
Kriva se ekstrapolira od 0-70 fL, i konačan broj se dobija
metodom fitovanja krive eliminišući interferirajuće čestice u zoni
šuma (na pr mikrocite)
Srednja zapremina Tr (MPV), analogna MCV kod RBC, dobija
se sa histograma Tr

satelitizam trombocita delimična koagulacija uzorka 41 42

Prof Violeta Dopsaj 2009/10 7

 Suspect flag

WBC:
Immature
Granulocytes 1

Ukazuje na
povlačenje
Le iz marginalnih
prostora

SKRETANJE U
LEVO/LEFT SHIFT

Pseudotrombocitopenija:
A - EDTA; B - citrat 43 44

Histogram leukocita kod reaktivne neutrofilije: Histogram eritrocita kod reaktivne neutrofilije:
povišeni leukociti sa izrazitim "skretanjem ulevo" MCV normalan
povišen RDW posledica heterogenosti veličine eritrocita
izazvane transfuzijom
snižen broj eritrocita
45 46

Histogram trombocita kod reaktivne neutrofilije

Skretanje ulevo sa 10% štapova

Dijagnoza: Pneumonija (nije otkriven uzročnik)
Reaktivno skretanje ulevo sa marginalnom leukocitozom
47 48
Suspektni alarm potiče od povećanih štapova

Prof Violeta Dopsaj 2009/10 8

 Region A
Suspektni alarm
Blasti
Atipični limfociti

•Štapićasti neutrofili Definitivni alarmi

A •Metamijelociti Limfocitoza %
•Megaloblastni Monocitoza %
•Neutrofili
V
o
l
u
m .
t
e uc
d
on
C
Laser Scatter

Infektivna mononukleoza
49 50

• Reaktivni Ly
(virusne infekcije)
• Sezary ćelije (abnormalni
Ly pomereni u desno
E • Prolimfociti
V
o
l
u
m .
t
e c
u
d
on
C
Laser Scatter

Dijagnoza: Abnormalna populacija limfo-monocitoidnih virocita

Mali trombociti, suspektna imuna trombocitopenija
51
Virociti kod infektivne mononukleoze, citomegalovirusa 52
virusnog hepatitisa

53

Prof Violeta Dopsaj 2009/10 9