P. 1
Jasminka_Nikolic-Biohemija

Jasminka_Nikolic-Biohemija

|Views: 2,074|Likes:
Published by Jasmin Avdic

More info:

Categories:Types, School Work
Published by: Jasmin Avdic on May 16, 2011
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

06/29/2013

pdf

text

original

Jasminka Nikolić

BIOHEMIJA
ZA STUDENTE POLJOPRIVREDNOG FAKULTETA

Banja Luka, 2007.

SADRŽAJ
Enzimi.............................................................................................................2 Vitamini i koenzimi.......................................................................................21 Transport elektrona i oksidativna fosforilacija..............................................35 Ugljeni hidrati ..............................................................................................47 Masne kiseline...............................................................................................87 Fosfolipidi.....................................................................................................98 Aminokiseline i peptidi..............................................................................102 Nukleinske kiseline.....................................................................................117 Sinteza proteina.......................................................................................... 125

ENZIMI
STRUKTURA ENZIMA
Enzimi su po svojoj strukturi proteini. Neki enzimi su jednostavni proteini (proteinenzimi) izgrađeni samo od aminokiselinskih ostataka. Primjer su digestivni enzimi: tripsin, himotripsin i elastaza. Drugi enzimi predstavljaju složene proteine (proteid-enzime) koji pored aminokiselinskih ostataka sadrže i neaminokiselinske kofaktore. Tada se kompletan aktivan enzim naziva holoenzim, a sastavljen je od proteinskog dijela (apoenzim) i kofaktora: HOLOENZIM = APOENZIM + KOFAKTOR Sam apoenzim je neaktivna, termolabilna komponenta proteid-enzima. Holoenzim ispoljava svoju aktivnost samo u prisustvu obje komponente, pri čemu je apoenzim nosilac specifičnosti enzima prema supstratu, a kofaktor, označen kao koenzim, određuje tip hemijske reakcije koju enzim katalizuje. Metalni jon može da služi kao kofaktor za neke enzime. Cink je npr. kofaktor za karboanhidrazu. Kofaktore, koji su tijesno vezani za enzim, neki autori nazivaju prostetičnim grupama. Mnogi koenzimski oblici hidrosolubilnih vitamina služe kao kofaktori u enzimski katalizovanim reakcijama. Razlika između koenzima i prostetičnih grupa nije apsolutna, jer komponenta koja je koenzim za jedan enzim može da bude prostetična grupa za drugi enzim. Koenzim se vezuje za apoenzim kovalentnim vezama, ali tu mogu da budu prisutne Van der Waalsove sile. Enzimi koji sadrže jedan, ili više atoma nekog metala, kao strukturnu komponentu, nazivaju se metaloenzimi. Odstranjivanje metala iz molekule metaloenzima uslovljava gubitak katalitičke aktivnosti tog enzima. Nasuprot tome, neki metali samo aktiviraju enzime, ali nisu neophodni. Ovakvi metaloenzimski kompleksi imaju labavo vezan atom metala, koji lako može da se izdvoji dijalizom. Metali mogu da učestvuju u izgradnji aktivnog centra, da povezuju enzim sa supstratom u toku enzimske reakcije, ili da povezuju enzim sa koenzimom, što povećava stabilnost proteid enzima. Molekule svih enzima posjeduju tri nivoa strukturne organizacije proteina, a samo oni molekuli enzima koji se sastoje od dva ili više peptidnih lanaca (subjedinica) posjeduju i kvaternernu strukturu. Primarna struktura je specifična za svaki molekul enzima i predstavlja linearnu sekvencu aminokiselina povezanih peptidnim vezama između karboksilnih i α-amino grupa. Svi sintetisani polipeptidni lanci se uvijaju gradeći trodimenzionalnu strukturu sekundarne i tercijarne organizacije proteina. Sekundarna struktura se odnosi na konformacione promjene ograničenih dijelova polipeptidnog lanca u vidu α-heliksa, β-nabrane strukture, nepravilnih namotaja, ili β-usmjerene strukture. Ova struktura nastaje obrazovanjem dopunskih, uglavnom vodoničnih veza između susjednih aminokiselina. Kompleksna trodimenzionalna struktura, koju poprima cijeli polipeptidni lanac se naziva tercijarna struktura. Ova se struktura obrazuje uspostavljanjem hemijskih veza između udaljenih aminokiselina, a molekul dobija izgled loptaste, globularne formacije. U tome pomažu određene veze privlačenja: elektrostatičke, Van der Waalsove sile, vodonične veze i hidrofobne interakcije. Sekvenca aminokiselina u primarnoj strukturi određuje konformaciju viših nivoa molekulske strukture, koju polipeptidni lanac spontano poprima u toku sinteze. Zbog toga su sekundarna i tercijarna struktura isto toliko specifične, kao i primarna struktura.

Kvaternerni nivo strukture nastaje udruživanjem manjeg broja subjedinica, nazvanih protomeri (monomeri) koji se sastoje od jednog polipeptidnog lanca sa karakterističnom konformacionom strukturom. Na ovakav način nastaje oligomerni (polimerni) molekul proteina, npr. tetramerna molekula laktat dehidrogenaze. Ukoliko su protomeri identični, enzim se naziva homopolimer, a ukoliko sadrži različite protomere zove se heteropolimer (ili hibridni oblik). Enzimi jedino u oligomernom obliku ispoljavaju katalitičku aktivnost, odnosno, aktivnost enzima se gubi u slučaju razdvajanja subjedinica. Svako narušavanje strukture enzima dovodi do gubitka aktivnosti, a proces se naziva denaturacija proteina. Ukoliko proces denaturacije nije otišao suviše daleko, moguće je da bude reverzibilan, jer molekuli enzima imaju tendenciju da povrate svoju uobičajenu konformaciju. Za renaturaciju je neophodno da se postignu optimalni uslovi, koji su vezani za temperaturu, pH, pufer, jonsku jačinu, rastvarač i koncentraciju proteina. Dugotrajna, ali snažna denaturacija dovodi do trajnog gubitka enzimske aktivnosti, jer enzim prelazi iz nativnog stanja u koloidni gel, koji ima drukčije fizičke osobine. Pri tom procesu raskidaju se intramolekulske hemijske veze, pri čemu dolazi do promjene sekundarne i tercijarne strukture. Denaturacija može da se dogodi usljed povišene temperature, a nastaje trenutno ako je temeratura viša od 60°C. Mehanička i hemijska energija, oksidaciona i redukciona sredstva, organski rastvarači i ekstremne vrijednosti pH sredine takođe mogu da dovedu do denaturacije. Posebnu grupu sredstava za denaturaciju sačinjavaju niskomolekularna jedinjenja visoke rastvorljivosti, urea i gvanidin, koji kidaju vodonične veze i hidrofobne interakcije. AKTIVNI CENTAR ENZIMA Prilikom ispitivanja strukture enzima konstatovano je da za katalitičku aktivnost enzima nije neophodan cjelokupni peptidni lanac. Regija u molekulu enzima koja neposredno učestvuje u vezivanju supstrata naziva se aktivni centar. Sastavljen je iz malog broja funkcionalnih grupa, a ukoliko se radi o proteid-enzimu, u sastav aktivnog centra ulazi i kofaktor (koenzim, metalni jon…). Osnovna je karakteristika aktivnog centra da hemijske grupe koje ga izgrađuju pripadaju veoma udaljenim aminokiselinskim ostacima, ali su one približene zahvaljujući sekundarnoj i tercijarnoj strukturi enzima. U sastav aktivnog centra najčešće ulaze: imidazolov prsten histidina, epsilon amino grupa lizina, karboksilne grupe glutaminske i asparaginske kiseline, gvanidino grupa i hidroksilna grupa serina i treonina. Iako aktivni centri više enzima mogu da imaju istu građu, to ne znači da katalizuju iste reakcije. Ovu pojavu objašnjava činjenica da u procesu vezivanja supstrata za enzim ne učestvuje samo aktivni centar, već i susjedne, prostorno bliske, hemijske grupe. Neke od hemijskih grupa aktivnog centra direktno učestvuju u spajanju supstrata sa enzimom i u transformaciji supstrata u produkt. Ovakve hemijske grupe se nazivaju katalitičke grupe. Njima znatno pomaže tzv. kontaktne grupe, koje utiču na približavanje molekule supstrata. Svaka molekula enzima ima najmanje jedan, ali je moguće i više aktivnih centara. Neki enzimi imaju blokiran aktivni centar određenim fragmentom peptidnog lanca, a u takvom obliku nazivaju se proenzimi. Obično se otcjepljenjem jednog dijela peptidnog lanca "deblokira" molekula enzima i prelazi u aktivan oblik.

Fisherov model

Koshlandov model Odgovor na pitanje, kako se vezuju enzim i supstrat, prvi je pokušao da dâ Emil Fisher 1890. On je postavio model po kome enzim i supstrat pokazuju strogu podudarnost, kao ključ prema bravi. Ovakav model bilo je moguće primijeniti samo na mali broj enzima, a jedna u početku samo atraktivna hipoteza, o induktivnoj adaptaciji aktivnog centra, postala je danas opšte prihvaćena. Na slici je prikazan model Daniela E. Koshlanda, koji je postuliran 1958. Fleksibilnost enzima je njegova bitna karakteristika i zahvaljujući njoj dolazi do prostornog prilagođavanja (adaptacije) enzima prema supstratu. Ove promjene indukuje prisustvo supstrata, koji se vezuje prvo za kontaktne grupe enzima, što vodi ka njegovoj konformacionoj promjeni, tj. nastanku specifičnog prostornog rasporeda reaktivnih hemijskih grupa. SPECIFIČNOST ENZIMA Svaki enzim katalizuje samo jednu reakciju, ili ograničen broj različitih hemijskih reakcija. Ovo, svakako, nije slučaj i sa neproteinskim katalizatorima. Stepen specifičnosti se razlikuje od jednog do drugog enzima. Veliki broj enzima ispoljava apsulutnu specifičnost. Ovakvi enzimi katalizuju samo jednu reakciju, tj. selektivno djeluju na samo jedan određeni supstrat. Tako, arginaza katalizuje samo razlaganje arginina na ureu i ornitin, a ne može da

razlaže druge aminokiseline. Piruvat kinaza omogućava prenos fosfatne grupe između fosfoenolpiruvata i ADP-a i katališe samo ovu reakciju. Nešto niži stepen supstratne specifičnosti je nađen kod heksokinaze. Ovaj enzim prenosi fosfatnu grupu sa ATP-a na D-glukozu, ali može da fosforiliše i D-fruktozu, Dmanozu i 2-deoksi-D-glukozu. Fosfataze su primjer enzima sa grupnom specifičnošću. Ovi enzimi otcjepljuju fosfatne grupe od različitih organskih fosfatnih estara i pri tome imaju različit stepen specifičnosti. Dakle, grupna specifičnost se ogleda u tome što enzim katalizuje isti tip hemijskih reakcija u jedinjenjima bliske hemijske strukture. Karakteristika mnogih enzima je stereoizomerna specifičnost. Enzimi uključeni u proces glikolize djeluju samo na D-stereoizomere glukoze i njene derivate, ali nikada na Loblike. Aminotransferaze prevode ketokiseline samo u L-izomerne aminokiseline. Laktat dehidrogenaza djeluje samo na L-mliječnu kiselinu. Prostetična grupa, odnosno koenzim, određuje specifičnost enzima prema tipu hemijske reakcije, dok je specifičnost prema supstratu uslovljena strukturom proteinske komponente. ENZIMI KAO KATALIZATORI Mali broj molekula enzima je u stanju da veoma brzo transformiše znatno veći broj molekula supstrata. Pri tome enzimi povećavaju brzinu hemijske reakcije do uspostavljanja ravnoteže između reaktanata i proizvoda reakcije, ne mijenjajući konstantu ravnoteže. Enzimi katalizuju biohemijske reakcije tako što značajno smanjuju energiju potrebnu za aktivaciju, a sami se pri tome ne mijenjaju. Da bi tekla reakcija transformacije supstrata (S) do proizvoda (P) potrebno je da određeni broj molekula supstrata posjeduje višu energiju od drugih, tako da se dostigne nivo "aktivnog stanja". Energija aktivacije predstavlja iznos energije koji je potreban da se ove molekule supstrata dovedu u aktivno stanje. U prisustvu enzima smanjuje se potrebna slobodna energija za prevođenje supstrata u proizvod reakcije, zbog čega reakcija teče znatno brže. Formiranje kompleksa enzimsupstrat (ES) je prvi korak u enzimskikatalizovanim reakcijama. Vezujući se za enzim molekul supstrata prelazi u aktivni oblik, a energija potrebna za ovu aktivaciju se dobija od oslobođene energije u toku spajanja S sa E.

Energija aktivacije A-rekcija teče bez enzima; B-reakcija katalizovana enzimom

Zbog toga se energetska barijera reakcije snižava, povećavajući brzinu stvaranja proizvoda reakcije. Kompleks ES se razlaže dajući proizvod reakcije (P) i slobodni enzim (E):
E + S k1 k2 ES k3 E + P.............................................(1)

Konstanta brzine za reakciju koja se odvija u smijeru ES označena je sa k1, dok k2 označava konstantu brzine iste reakcije suprotnog smjera. Konstanta brzine reakcije nastajanja P iz kompleksa ES označena je sa k3. Kada je stvaranje i razlaganje ES kompleksa uravnoteženo (k1-k2= k3) uspostavlja se stacionarna koncentracija intermedijarnog ES kompleksa, tj. nastaje stabilno, stacionarno stanje. Ovakvo uravnoteženo stanje predstavlja dinamičku ravnotežu, pri kojoj je koncentracija ES kompleksa konstantna, a slobodni enzim je u ravnoteži sa ES kompleksom. U stacionarnom stanju koncentracije supstrata i proizvoda su promjenljive. Dakle, pri stacionarnoj ravnoteži koncentracija ES kompleksa je konstantna, a brzina kojom kompleks nastaje jednaka je brzini njegove razgradnje:

k1 cE x cS = k cES + k cES....................................(2) 2 3

k1 cE x cS = (k + k3) cES........................................(3) 2 cE x cS cES k + k3 2 k1

=

= K m........................................(4)

Km je Michaelis-Menten-ova konstanta i jednaka je cS pri polovini maksimalne brzine. Km ima veliki značaj pri određivanju afiniteta nekog enzima prema supstratu. Ukoliko je Km veća, znak je da je afinitet enzima prema supstratu manji. Da bi se aktivnost nekog enzima odvijala u takvim uslovima neophodno je prisustvo supstrata u većoj koncentraciji. Nasuprot tome, pri niskim Km enzim ima veliki afinitet prema supstratu. Inicijalna brzina (v) enzimski katalizovane reakcije proporcionalna je koncentraciji ES kompleksa: V= k cE............................................................(5) Pri jako velikim koncentracijama supstrata sav enzim se nalazi u kompleksu ES, pa je ukupna koncentracija enzima cEt jednaka cES, a brzina reakcije je maksimalna (V=Vmax): V= k cEt..............................................................(6) Koncentracija slobodnog enzima, koji nije uključen u kompleks sa supstratom može da se izračuna iz slijedećeg izraza: cE= cEt – cES.................................(7)

Kada se podaci iz jednačine 5 i 6 uključe u jednačinu 7 dobija se:

cE =

V k

-

v = k

V- v k

.................(8)

Izraz za cE može da se supstituiše u jednačinu 4, dakle:

Km =

(V-v)

x cS

............................(9)

k x cES
a zamjenom v = k cES, iz č ega slijedi cES = v/k , dobije se :

Km=

(V-v)

x cS

...........................(10)

v
Posljednja jednač ina mož e da se napiše i na slijedeć i nač in:

v=

V x cS Km + cS

...............................(11)

Ovakav izraz je poznat pod nazivom Michaelis- Menten-ova jednačina, a dobila je naziv po autorima L. Michaelis-u, enzimologu i M.L. Menten-ovoj, pedijatru. Ovaj izraz omogućava razumijevanje enzimskih reakcija. Iz jednačine proizilazi da kada je inicijalna brzina jednaka polovini maksimalne brzine ( v = Vmax/2), tada je koncentracija supstrata jednaka Km. Kada je cS = Km, tada je oko ½ molekula enzima u kompleksu sa supstratom. Vmax je indikator katalitičke efikasnosti i afiniteta enzima prema supstratu. Pri visokim koncentracijama supstrata, pod uslovom da je postignuta maksimalna brzina, svi molekuli enzima su zasićeni supstratom, tj. nalaze se u ES kompleksu. U takvim okolnostima brzina je konstantna i ne zavisi od koncentracije supstrata, ali je direktno proporcionalna koncentraciji enzima. Pri eksperimentima in vitro potrebno je da su koncentracije supstrata oko 10 puta veće od Km, da bi se postigle maksimalne brzine. Zato Km ima praktični značaj u standardizaciji enzimskih metoda. Teži se ka optimalnim metodama, pri kojima je koncentracija supstrata i do 20 puta veća od Km. Km i Vmax su konstantne i specifične karakteristike za određeni enzim i njegov supstrat. Koncentracija supstrata u ćelijama in vivo treba da bude bliska vrijednostima Km, kako bi biohemijski procesi bili racionalni. Vrijednosti Km i Vmax determinišu tip inhibicije enzimske aktivnosti i doprinose razjašnjavanju regulacije metaboličkih procesa u kojima na isti supstrat djeluje dva, ili više enzima. Fosforilisanje glukoze katalizuju glukokinaza i heksokinaza. Ova dva enzima, iako katalizuju isti biohemijski proces pretvaranja glukoze u glukozo-6- fosfat, razlikuju se ne samo po lokalizaciji, već i po kinetičkim karakteristikama.

Glukokinaza je prisutna u jetri, a heksokinaza u svim tkivima. Dok je vrijednost Km glukokinaze za glukozu oko 10 mmol/L, Km heksokinaze za glukozu je manji od 0,1 mmol/L. Dakle, afinitet heksokinaze prema glukozi, kao supstratu, je značajno veći. Fosforilisanje glukoze u hepatocitima jetre intenzivira se nakon unošenja obroka bogatog ugljenim hidratima, kada glukoza u krvi v. portae dosegne nivo iznad 10 mmol/L. Glukokinaza je inducibilan enzim, na koji djeluje visok nivo glukoze u hepatocitima, uzrokujući sintezu novih molekula glukokinaze. Nastali proizvod reakcije glukozo-6-fosfat ne inhibiše glukokinazu, za razliku od heksokinaze. Međutim, u fiziološkim uslovima, kada je koncentracija glukoze u hepatocitima bliska koncentraciji glukoze u krvi, glukokinaza je u stanju da fosforiliše glukozu u jetri u glukozo6-fosfat, koji se zatim uključuje u metaboličke procese. Heksokinaza se zasiti glukozom već pri glikemiji od 1 mmol/L, tako da hiperglikemija ne utiče na heksokinazu. FAKTORI KOJI UTIČU NA BRZINU ENZIMSKI-KATALIZOVANIH REAKCIJA TEMPERATURA U okviru ograničenog temperaturnog intervala, brzina enzimski-katalizovanih reakcija raste sa porastom temperature. Toplotna energija se prevodi u kinetičku energiju čestica koje reaguju, što utiče na porast brzine reakcije ispod optimalne temperature. Međutim, ako temperatura i dalje raste, kinetička energija molekula enzima i sama postaje tako velika da prevazilazi energetsku barijeru za raskidanje sekundarnih veza koje drže enzim (kao proteinsku molekulu) u nativnom, ili katalitički aktivnom stanju. Zbog toga dolazi do narušavanja sekundarne i tercijarne strukture i paralelnog gubitka katalitičke aktivnosti, enzima. Inaktivacija enzima visokom temperaturom je ireverzibilan proces. Postoji optimalna temperatura, za svaki enzim, na kojoj je enzimski-katalizovana reakcija najbrža i ona se za većinu enzima nalazi između 30oC i 40oC. Porast temperature iznad optimalne dovodi do naglog pada brzine reakcije. Većina enzima se denaturiše na temperaturi iznad 50oC, ali taj proces zavisi od dužine vremenskog intervala u kome je enzim izložen povišenoj temperaturi. Postoje i izuzeci , kao što su enzimi iz nekih mikroorganizama adaptiranih na rast u prirodnim toplim izvorima, koji mogu da imaju optimalne temperature blizu tačke ključanja vode. Ribonukleaza je postojana na 100oC tokom nekoliko minuta. Tačna razmjera promjene brzine reakcje za svakih 10oC porasta temperature se označava kao temperaturni koeficijent (Q10). Brzina mnogih bioloških reakcija se približno udvostruči pri porastu temperature za 10oC (Q10=2), a prepolovi pri opadanju temperature za 10oC. Pri mnogim fiziološkim procesima, na pr. pri brzini kontrakcije ekscitovanog srca, Q10 takođe iznosi 2. Na 0oC aktivnost enzima se ne manifestuje, ali ovaj proces je reverzibilan, jer sa porastom temperature, do optimalne, aktivnost se u potpunost obnovi. Iz ovog razloga niske temperature (ispod –20oC) se koriste za čuvanje enzima.

pH pH vrijednost na više načina značajno utiče na brzinu enzimski-katalizovanih reakcija. Najbitniji je uticaj pH na molekulu enzima, pri čemu se mijenja jonsko stanje enzima, ali se istovremeno mijenja i jonizacija supstrata. Uticaj pH na molekule enzima rezultat je njihove

proteinske prirode. Pri optimalnom pH molekule enzima imaju jonski oblik koji je najadekvatniji za kontakt njegovog aktivnog centra sa supstratom. Samo pri odgovarajućoj tercijarnoj strukturi enzima, na koju utiče pH vrijednost, moguća je enzimska kataliza. Oblik krive zavisnosti brzine enzimske reakcije od pH određuju slijedeći faktori:  Denaturacija enzima na suviše visokim i niskim pH vrijednostima.  Uticaj na naelektrisano stanje supstrata, ili enzima. Kod enzima, promjene naelektrisanja mogu da utiču na aktivnost bilo mijenjajući strukturu, bilo mijenjajući naelektrisanje nekog ostatka molekule bitnog za vezivanje supstrata, ili katalizu. Drugi važan faktor je promjena konformacije enzima pri variranju pH. Naelektrisana grupa distalno od oblasti gdje je supstrat vezan može da bude neophodna za održavanje tercijarne, ili kvaternarne strukture. Ako se naelektrisanje ove grupe promijeni molekul proteina može da se raspadne, postane kompaktniji, ili da disosuje dajući protomere, što sve dovodi do gubitka aktivnosti. Optimalne pH vrijednosti za većinu enzima se nalaze u pH-intervalu od 5 do 9. Međutim, mali broj enzima je aktivan pri pH vrijednostima koje su sasvim izvan ovog intervala. Pepsin ima optimalno dejstvo pri pH 1,5, a arginaza pri pH 7. KONCENTRACIJA ENZIMA U mnogim situacijama korisno je da se zna ne samo da li je dati enzim prisutan, nego koliko ga ima. Pod optimalnim uslovima (optimalnoj temperaturi i pH, višku supstrata i eventualnom prisustvu aktivatora i koenzima) brzina jedne enzimski- katalizovane reakcije direktno je proporcionalna količini prisutnog enzima. Enzim je reaktant koji se vezuje sa supstratom dajući enzim-supstrat kompleks, ES, koji se razlaže dajući produkt P i slobodni enzim. U najjednostavnijem obliku ovo može da se prikaže:

E+S

k1 k -1

ES

k2 k -2

E+P

Izostavljanjem međuproizvoda ES dobijamo:

E+S

k1 k2

E+P

U stanju ravnoteže:

brzina1 = k1(cE x cS) brzina2 = k-2(cE x cP) k1 (cE x cS) = k-2 (cE x cP)

cE x cP cP k1 = = cE x cS cS k-2
K eq = k1 k-2 ; K eq = cP cS

Zapaža se da iako izrazi za brzine reakcija u oba smjera, kao i za cjelokupnu reakciju sadrže enzim, on izostaje za konstantu ravnoteže ( Keq ) cjelokupne reakcije.

Prema tome, enzim ne utiče na konstantu ravnoteže. Drugačije rečeno, pošto enzimi utiču na brzine, a ne na konstante brzina, oni ne mogu da utiču na Keq, koja je odnos konstanti brzina. Keq neke reakcije je ista, bez obzira da li se ravnoteža postiže sa, ili bez enzimske katalize. Enzimi ne utiču na početne i završne koncentracije reaktanata i produkata u ravnoteži–faktore koji određuju Keq i ΔG° (promjenu standardne slobodne energije).

KONCENTRACIJA SUPSTRATA Jedna od karakteristika enzimski-katalizovanih reakcija jeste zasićenje enzima supstratom. U slijedećoj diskusiji enzimske reakcije se tretiraju kao da imaju samo jedan supstrat i jedan proizvod. Iako postoje i takve enzimski-katalizovane reakcije, većina ih ima dva ili više supstrata i proizvoda. Ipak, ono što važi za jedan, važi i za dva supstrata. Ako se koncentracija supstrata poveća, a svi ostali uslovi održavaju konstantnim, mjerena početna brzina vi (brzina mjerena kada je sasvim malo supstrata izreagovalo) raste do maksimalne vrijednosti, ali ne dalje. Brzina raste sa porastom koncentracije supstrata do tačke gdje je enzim "zasićen" supstratom. Mjerena početna brzina dostiže maksimalnu vrijednost i ostaje nepromijenjena pri daljem povećanju koncentracije supstrata, zato što je broj molova supstrata mnogo veći od broja molova enzima. Na dijagramu je predstavljen uticaj koncentracije supstrata cS na brzinu (v) enzimskikatalizovane reakcije. Grafički prikaz ima izgled hiperbole, kada enzim nije alosterijski. Za alosterijske enzime karakteristična je sigmoidna kriva.

v

V
V

3 2 a 1

2

Km

cS

Grafički prikaz zavisnosti brzine enzimski-katalizovane reakcije od promjene koncentracije supstrata Dio krive predstavlja linearnu zavisnost (označen brojevima 1 i 2) brzine enzimske reakcije od koncentracije supstrata i koncentracije enzima (jednačina prvoga reda). Konstanta ravnoteže reakcije, (nastajanje kompleksa ES) nije beskonačno velika.
E+S ES

Tako u dijelovima krive (1 i 2), povećanje, ili smanjenje koncentracije supstrata dovodi do povećanja, odnosno smanjenja količine enzima vezanog za supstrat u kompleksu (ES), pa će i v da zavisi od koncentracije supstrata. U dijelu krive (3) praktično je sav enzim vezan sa supstratom, tako da dalje povećanje koncentracije supstrata, iako povećava broj sudara između molekula enzima i supstrata, ne dovodi do povećanja brzine reakcije, pošto nema slobodnog enzima sposobnog da reaguje. Brzina reakcije u dijelu krive (3) zavisi samo od koncentracije enzima i zato je to reakcija nultoga reda, sa maksimalnom ili graničnom brzinom (Vmax). U takvim se okolnostima povećanje brzine reakcije ne može da postigne povećanjem koncentracije supstrata, ali može dodatkom nove količine enzima. Slučaj u tački a predstavlja teoretski veoma značajnu situaciju u kojoj je tačno polovina molekula enzima "zasićena supstratom". Brzina reakcije je tada ravna polovini maksimalne brzine (Vmax/2). Koncentracija supstrata pri kojoj brzina dostiže polovinu svoje maksimalne vrijednosti, kao što smo ranije naglasili, označava se kao Km, ili Michaelis-Menten-ova konstanta. Ovaj parametar je konstantna vrijednost, za određeni enzim i određeni supstrat. Kada jedan enzim djeluje na više supstrata, onda ima i više različitih Km vrijednosti. Km se izražava u mol/L, a kod najvećeg broja enzima vrijednosti Km su od 10-5 do 10-2 mol/L. Pri fiziološkim uslovima, u ćelijama, koncentracija supstrata je najčešće bliska Km vrijednosti za određeni enzim, tako da enzim nije zasićen supstratom. Zato je u ovakvim okolnostima brzina enzimski-katalizovanih reakcija pod uticajem koncentracije supstrata. GRAFIČKO ODREĐIVANJE MICHAELIS-MENTEN-ove KONSTANTE Vrijednost Km može da se odredi eksperimentalno pomoću grafičkog prikazivanja brzine reakcije (v) u funkciji koncentracije supstrata (cS). Kada je cS približno jednaka Km , v jako zavsi od promjena cS, a enzim radi sa polovinom maksimalne brzine. U stvari, mnogi enzimi imaju Km čija je vrijednost približna fiziološkoj koncentraciji njihovih supstrata. Michaelis-Menten-ov izraz: V x cS v= Km + cS opisuje ponašanje mnogih enzima prilikom mijenjanja koncentracije supstrata. Zavisnost brzine jedne enzimski-katalizovane reakcije od cS i Km može da se pokaže rješavanjem gore navedene reakcije. 1. cS je mnogo manja od Km, cS<< Km: ( tačka 1 na dijagramu 1. ) Ako se cS doda na Km u nazivniku, vrijednost Km se vrlo malo mijenja, pa se cS može da zanemari. Pošto su Vmax i Km konstante, njihov se odnos može da zamijeni novom konstantom K. Drugim riječima, kada je koncentracija supstrata ispod one koja je potrebna da se dostigne polovina maksimalne brzine (tj. ispod Km vrijednosti) početna brzina v zavisi od koncentracije supstrata cS. 2. cS mnogo veća od Km, cS >>Km ( tačka 3 na dijagramu 1.)

Ako sada u nazivniku vrijednosti cS dodamo Km, njegova vrijednost se veoma malo mijenja, tako da Km može da se zanemari.

V x cS v ~ V x cS ~ V ~ ~ K m + cS cS Iz gore navedenog slijedi, da kada koncentracija supstrata cS daleko premašuje vrijednost K m, tada je brzina v maksimalna, dostiže Vmax. v=
3. Kada je cS = Km ( tačka a na dijagramu 1.)

v=

V x cS K m + cS

V x cS V v = V x cS = = cS + cS 2cS 2

Ovim se tvrdi da kada je koncentracija supstrata jednaka Km vrijednosti, brzina v je ravna polovini maksimalne brzine. Pošto se, prilikom grafičkog prikazivanja v u zavisnosti od Km, za mnoge enzime dobija kriva zasićenja iz koje se ne može lako da odredi V (a samim tim ni Km ) pogodnije je da se Michaelis-Menten-ov izraz transformiše tako da se određivanje Km i V uprosti. Michaelis-Menten-ova jednačina može da se preuredi i razloži na slijedeći način:

v=

V x cS K m + cS

inverzija

K m + cS 1 = v V x cS

1 v

= 1 v

Km V = Km V

x

1 + cS

cS V x cS

x

1 1 + cS V

Gornji izraz je jednačina prave: y = ax + b ; y = 1/v ; x = 1/cS. Ako se y, ili 1/v, grafički prikaže kao funkcija od x, ili 1/cS, odsječak b na y-osi je 1/V, a nagib α , je Km/V.

1

v

Nagib = K V  1

Km
1

b

V
1

cS

Dvostruko recipročni Lineweaver-Burk-ov dijagram Negativni odsječak na x-osi može da se odredi ako je y = 0, a tada je

x=- b =- 1 a Km
Ovakav dijagram se zove dvostruko recipročni Lineweaver-Burk-ov dijagram. Km vrijednost se može da odredi iz navedenog dijagrama, upotrebom bilo nagiba i yodsječka, ili negativnog x-odsječka. Brzina v može da bude izražena u bilo kojim jedinicama, pošto je Km nezavisna od cE. Km vrijednost je značajna u praksi, kod ispitivanja enzima. Pri koncentraciji supstrata koja je 100 puta veća od Km, enzim će da djeluje praktično maksimalnom brzinom. Km pokazuje koliko supstrata treba da se upotrijebi da bi se izmjerila Vmax . Iako je istorijski gledano Lineweaver-Burkov dijagram prvi dijagram ovakve vrste, a ujedno i danas najkorišteniji, on posjeduje ozbiljna ograničenja. Pri niskim vrijednostima koncentracije supstrata, tj. visokim vrijednostima 1/cS podaci teže da se razlikuju od očekivanih, budući da se cS, a kao posljedica toga i v, drastično mijenjaju tokom reakcije. Dešava se da pri malim vrijednosti cS devijacija rezultata utiče na nagib, a stoga i preciznost prave.

NOMENKLATURA I KLASIFIKACIJA ENZIMA Enzim obično dobija ime na taj način što se na ime supstrata, koji treba da se transformiše, doda sufiks –aza: ureaza za enzim koji hidrolizuje ureu, ili fosfataza u slučaju enzima koji hidrolizuje fosfatne grupe fosforilisanih organskih jedinjenja. Drugi enzimi dobijaju imena koja se odnose na njihovu aktivnost, kao npr. katalaza enzim koji razgrađuje peroksid, ili proteaza proteolitički enzim digestivnog trakta (tripsin i pepsin). Da bi se izbjegla konfuzija stvorena ovakvom aproksimativnom nomenklaturom, 1961. god. je osnovana Inernacionalna enzimska komisija (International Enzyme Commission; E.C.). Ona je definisala sistematsku osnovu za nomenklaturu enzima. Iako trivijalna imena mnogih enzima i dalje ostaju u upotrebi, svi se enzimi sada klasifikuju i dobijaju imena u saglasnosti sa reakcijom koju katalizuju.

Enzimska komisija je uzela u obzir šest klasa reakcija (Tabela 3). U svakoj klasi postoje podklase, a svaka od ovih je podijeljena u podpodklase u okviru kojih su nabrojani pojedinačni enzimi. Klase, podklase, podpodklase i pojedinačni (individualni) brojevi su označeni ciframa. Na taj način čine seriju od četiri cifre koje označavaju jedan enzim. Svakom enzimu, takođe, se daje i sistemsko ime, koje opisuje reakciju katalizovanu enzimom. Kao primjer možemo da uzmemo enzim koji katalizuje slijedeću reakciju:

ATP D-glukoza

ADP D-glukozo-6-fosfat

Fosfatna grupa sa ATP-a se esterifikuje sa -OH grupom na C6 glukoze, te je zato enzim transferaza (klasa 2, vidi Tabelu 3.). Podklasa 7 transferaza sadrži enzime koji transportuju grupe koje sadrže fosfor, a podpodklasa 1 sadrži fosfotransferaze koje kao akceptor koriste alkoholnu grupu. Individualni broj 2 u ovoj podpodklasi je ATP:D-glukoza 6-fosfotransferaza i njen klasifikacioni broj je 2.7.1.2 . Uobičajeno je da se ispred ovih cifri napišu i slova E.C, inicijali "Enzyme Commission". Iza individualnog broja enzima se ne stavlja tačka. Šest klasa enzima: Oksidoreduktaze: katalizuju oksidoredukcione procese u ćelijama Transferaze: omogućavaju prenošenje hemijskih grupa sa donatora na akceptor. Hidrolaze: katalizuju razlaganje organskih materija uz učešće molekula vode. Liaze: katalizuju odvajanje (nehidrolitičkim putem) neke hemijske grupe od supstrata uz stvaranje dvostruke veze, ili obrnuto, omogućavaju pripajanje neke hemijske grupe na dvostruku vezu supstrata. 5. Izomeraze: omogućavaju stvaranje izomera. 6. Ligaze (sintetaze): omogućavaju stvaranje hemijskih veza između kiseonika i ugljenika, između ugljenika i azota, između ugljenika i sumpora, između ugljenikovih atoma, uz utrošak hemijske energije (ATP, GTP, UTP ili CTP). 1. 2. 3. 4. JEDINICE ZA IZRAŽAVANJE AKTIVNOSTI ENZIMA Nekada je u izražavanju aktivnosti enzima vladalo veliko šarenilo, pošto je svaki autor uz svoju metodu davao i svoju jedinicu. U takvim uslovima nije bilo moguće da se porede nalazi dobijeni raznim metodama, a nije mogao da se ima ni uvid u međusobni odnos aktivnosti različitih enzima. Zato je uvedena internacionalna jedinica (IU ili U). Jedna internacionalna jedinica (U) je aktivnost određenog enzima koja u jednoj minuti katalizuje promjenu jednog mikromola supstrata, pod optimalnim standardnim uslovima. U = μmolΔ[S] / min = μmol · min-1 Uvođenjem novog sistema mjera i jedinica, SI, uvedena je nova jedinica za aktivnost enzima. Ova se jedinica naziva katal. Jedan katal (kat) odgovara aktivnosti enzima koja u jednoj sekundi katalizuje promjenu jednog mola supstrata, pod optimalnim standardnim uslovima.

kat = molΔ[S] / sek = mol · sek-1 Za preračunavanje U/L u nkat/L vrijedi slijedeći izraz: 1U = 1μmol / min = 1μmol / 60sek = 1/60 μmol / sek = 1 / 60μkat = 16,67 nkat Aktivnosti enzima izražene u katalima predstavljaju vrlo male brojeve (koji numerički ne odgovaraju zahtjevima SI), pa ih zato treba izražavati u nanokatalima. Katalitička koncentracija enzima (koncentracija enzimske aktivnosti) predstavlja aktivnost enzima u jedinici zapremine seruma, plazme, ili rastvora, a izražava se brojem internacionalnih jedinica, ili katala na jedan litar. Katalitička koncentracija enzima može da se izražava i na jedinicu težine tkiva, na cijeli organ, ukupni azot, ili sadržaj proteina. Ukoliko se aktivnost enzima određuje u biološkim tkivima najčešće se koristi izražavanje katalitičke koncentracije enzima na proteine (u tkivima najmanje promjenljive veličine).

VITAMINI I KOENZIMI Vitamini su organska jedinjenja razliĉitog hemijskog sastava, neproteinske prirode, koja su neophodna u ishrani ţivotinja i ĉovjeka. Biljna ćelija i mikroorganizmiimaju sposobnost da sintetišu vitamine u vrlo malim koliĉinama. Unošenjem preko hrane animalni svijet i ĉovjek obezbjeĊuju prisustvo ovih znaĉajnih jedinjenja za normalno funkcionisanje tkiva i organa. Nedovoljno prisustvo u ishrani dovodi do avitaminoze, koju karakterišu razliĉiti poremećaji. Potrebe za odreĊenim vitaminima zavise od vrste organizma, jer svi organizmi nemaju potrebu za istim vitaminima. Ove vaţne supstance se tradicionalno dijele na: hidrosolubilne i liposolubilne vitamine. Osim vitamina C (askorbinska kiselina), svi hidrosolubilni vitamini, ĉine dijelove, ili prekursore koenzima. Koenzimi su molekule sa malom molekulskom masom, koje obezbjeĊuju specifiĉnu hemijsku funkciju odreĊenim enzimski-katalizovanim reakcijama. Koenzimi mogu da obavljaju ulogu prenosioca specifiĉnih funkcionalnih grupa, kao što su metil grupa i acil grupe. Djelujući zajedno sa enzimima koenzimi daju mnogo širi spektar katalitiĉkih osobina metaboliĉkim reakcijama. U ovim reakcijama koenzimi se prvo modifikuju, a zatim vraćaju na poĉetni oblik djelovanjem drugih enzima. Na taj naĉin male koliĉine ovih supstanci mogu da budu obnovljene i ponovo iskorištene. Liposolubilni vitamini nisu u direktnoj vezi sa koenzimima, ali obavljaju esencijalne uloge u mnogim vaţnim biološkim procesima, kao što su vid, odrţavanje strukture kostiju i koagulacija krvi. Mehanizmi djelovanja liposolubilnih vitamina nisu još uvijek dovoljno objašnjeni, u poreĊenju sa mehanizmima djelovanja hidrosolubilnih vitamina, ali moderna istraţivanja postepeno popunjavaju praznine. VITAMINI I KOENZIMI
Vitamini Hidrosolubilni Tiamin (vitamin B1 ) Niacin (nikotinska kiselina) Riboflavin (vitamin B2) Pantotenska kiselina Piridoksal, piridoksin, piridoksamin (vitamin B 6) Kobalamini (vitamin B12) Biotin Liponska kiselina Folna kiselina Askorbinska kiselina ( vitamin C) Liposolubilni Retinol (vitamin A) Ergokalciferol (vitamin D2) Holekalciferol (vitamin D3) α-tokoferol (vitamin E) Vitamin K Vitamin F Koenzimi u čiji sastav ulaze

Tiamin pirofosfat Nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+) Nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADP +) Flavin adenin dinukleotid (FAD) Flavin mononukleotid (FMN) Koenzim A (Co A) Piridoksal fosfat 5'-deoksiadenozil-kobalamin Metilkobalamin Kompleks biotin-lizin (biocitin) Kompleks lipoil-lizin (lipoamid) Tetrahidrofolat

VITAMIN B1 (TIAMIN, ANEURIN)
ATP N NH 2 + N ADP N NH 2

+ N

N

S

OH

N

S

OP

Tiamin

Tiaminmonofosfat (TMP)
ATP

ADP + N ADP ATP N NH 2

N NH 2

+ N

N

S

OPOPOP

N

S

OPOP

Tiamintrifosfat (TTP)

Tiamindifosfat (TDP)

     

SASTOJAK JE KOENZIMA TIAMINPIROFOSFATA SINTETIŠE SE U BILJKAMA I NEKIM MIKROORGANIZMIMA, ŢIVOTINJE GA UNOSE HRANOM DNEVNE POTREBE SU ZA KRUPNU STOKU 3-5 mg BOGATI IZVORI SU NEPRERAĐENE ŢITARICE, JETRA, SRCE, BUBREZI I KVASAC PRI NEDOSTATKU NARUŠAVA SE METABOLIZAM UGLJENIH HIDRATA I AMINOKISELINA, REMETE SE FUNKCIJE NERVNOG SISTEMA MIKROORGANIZMI U PROBAVNOM TRAKTU KRUPNE STOKE SINTETIŠU TIAMIN I STVARAJU POTREBNE REZERVE

VITAMIN B2 (RIBOFLAVIN, LAKTOFLAVIN)

     

IMA ULOGU KOENZIMA U VIŠE OD 60 ENZIMA NALAZI SE SLOBODAN SAMO U MLIJEKU U ĆELIJAMA ŢIVOTINJA KAO PROSTETIĈNA GRUPA KOENZIMA FMN I FAD NAJOSJETLJIVIJI NA NEDOSTATAK B2 SU SVINJE, PSI I PTICE KONJI, KRAVE I OVCE POMOĆU MIKROORGANIZAMA PROBAVNOG TRAKTA SINTETIŠU VITAMIN B2 U VETERINI RIBOFLAVIN SE KORISTI ZA LIJEĈENJE HEPATITISA, DERMATITISA I POREMEĆAJA METABOLIZMA

PANTOTENSKA KISELINA

CH3 H HOCH C C C 2 CH OH 3

O O NH CH CH C 2 2 OH

   

SASTOJAK JE CoA UĈESTVUJE U SINTEZI LIMUNSKE KISELINE, MASNIH KISELINA, STEROLA ŢIVOTINJE GA UNOSE HRANOM, A MIKROFLORA PREŢIVARA SINTETIŠE U PROBAVNOM TRAKTU NEDOSTATAK IZAZIVA PELAGRU PILIĆA I DRUGIH DOMAĆIH ŢIVOTINJA

VITAMIN PP (NIACIN)

O C OH C

O NH 2

N

N

Nikotinska kiselina

Amid nikotinske kiseline-niacin amid

    

U ORGANIZMU ŢIVOTINJA SE NALAZI KAO NIKOTINSKA KISELINA SINTETIŠE SE IZ TRIPTOFANA UKOLIKO SE ŢIVOTINJE HRANE PRETEŢNO KUKURUZOM POTREBNO JE HRANI DODAVATI NIACIN VITAMIN PP JE SASTAVNI DIO KOENZIMA NAD+ I NADP+ KOJI SU SASTOJCI OKO 150 ENZIMA NEDOSTATAK SE MANIFESTUJE DERMATITISOM SA MRKO OBOJENOM KOŢOM

VITAMIN B6
O CH2 OH HOH2 C OH HOH C 2 C H OH HOH C 2 CH NH 2 2 OH

N

CH3

N

CH3

N

CH3

Piridoksol (Piridoksin)

Piridoksal

Piridoksamin

O C C P -OH2 H OH C P -OH2 CH2NH2 OH

N

CH3

N

CH

3

, Piridoksal -5-fosfat

Piridoksamin-5 -fosfat

,

  

KOENZIM U METABOLIZMU AMINOKISELINA POTREBE ŢIVOTINJA SU RAZLIĈITE (NAJMANJE SVINJE, NAJVIŠE PILIĆI) NEDOSTATAK IZAZIVA USPOREN RAST, GUBITAK PIGMENTA DLAKE, ANEMIJU I NERVNE POREMEĆAJE

VITAMIN B12 (CIJANKOBALAMIN)

         

STRUKTURA SLIĈNA HLOROFILU U SREDIŠTU KORINSKOG PRSTENA NALAZI SE KOBALT, A NA PRSTEN JE VEZAN PSEUDONUKLEOTID ZNAĈAJAN JE U OBLIKU KOENZIMA UĈESTVUJE U METABOLIZMU LIPIDA POVEĆAVA KOLIĈINU GLIKOGENA U MIŠIĆIMA ŢIVOTINJA RESORBUJE SE POMOĆU CASTLEOVOG UNUTRAŠNJEG FAKTORA JEDINO KROZ CRIJEVNU MUKOZU DALJE SE TRANSPORTUJE TRANSKOBALAMINOM ZA NORMALAN METABOLIZAM ŢIVOTINJA POTREBNO JE DNEVNO OD 10-20 mg/kg HRANIVA NEDOSTATAK IZAZIVA ANEMIJU PRODUKUJE GA BAKTERIJSKA FLORA

VITAMIN C (L-askorbinska kiselina)

OH OH -2H O O HO-C-H +2H O

O

O O HO-C-H

CH OH 2

CH OH 2

     

UĈESTVUJE U OKSIDOREDUKCIONIM PROCESIMA SASTOJAK JE OKSIDOREDUKTAZA I AKTIVATOR NEKIH ENZIMA NEOPHODAN JE ZA BIOSINTEZU HRSKAVICE I KOSTIJU,VEZIVNOG TKIVA, ZUBA (kofaktor enzima protokolagen hidroksilaze) DNEVNE POTREBE ZA ŢIVOTINJE SU OD 50-250 mg/kg HRANIVA NEDOSTATAK IZAZIVA OŠTEĆENJE KAPILARA, KRVARENJE, UPALU DESNI, LABAVLJENJE ZUBA REGENERACIJA POVREDA I PROPUSTLJIVOST KAPILARA ZAVISI OD VITAMINA C VITAMIN A
7 8 , 14 15
,

9 10

11 12

13 14

15

, 12 , 13 , 11

, 10 , 9

, 8 , 7

-karotin
-karotin dioksigenaza
O2

o
C

2 Retinal
NADPH + H+

H

Retinal reduktaza

NADP+

CH OH 2

2

Retinol-vitamin A 1

NEOPHODAN JE ZA RAST, RAZVOJ, REPRODUKCIJU

   

RETINOL JE NEOPHODNA KOMPONENTA VIDNOG PIGMENTA RODOPSINA, DJELUJE NA GENSKU EKSPRESIJU RETINSKA KISELINA POVEĆAVA BROJ RECEPTORA ZA EPIDERMALNI FAKTOR RASTA, UĈESTVUJE U BIOSINTEZI GLIKOPROTEINA VITAMIN A IMA ANTIOKSIDANTNU I ANTIKANCERSKU AKTIVNOST NEDOSTATAK: MLADE ŢIVOTINJE ZAOSTAJU U RASTU, USPOREN JE RAST KOSTIJU I NERVNOG SISTEMA, JAVLJAJU SE KOŢNE PROMJENE I STERILITET VITAMIN D (Kalciferol)

CH

2

h kod biljaka
HO HO

Ergosterol

Vitamin D 2

CH 2

h kod animalaca
HO HO

7-dehidroholesterol

Vitamin D 3

      

APSORPCIJA U PROKSIMALNOM DIJELU TANKOG CRIJEVA U KRVI VEZANI ZA SPECIFIĈNE PROTEINE U JETRI HIDROKSILACIJA U POLOŢAJU 25 25-HIDROKSI VITAMIN D (KALCIDIOL) GLAVNI OBLIK DEPONOVANJA U JETRI, MIŠIĆIMA I MASNOM TKIVU D3 INDUKUJE KOD DOMAĆIH ŢIVOTINJA POJAVU SPECIFIĈNIH CaVEZUJUĆIH PROTEINA REGULIŠE METABOLIZAM KALCIJUMA I FOSFORA NEDOSTATAK KOD DOMAĆIH ŢIVOTINJA IZAZIVA RAHITIS, KAO POSLJEDICU NARUŠENE RAZMJENE MINERALNIH MATERIJA

VITAMIN E (tokoferol)

HO

O

-tokoferol +H O 2 -H O 2

HO OH OH tokoferol-hidrohinon

      

NAJVEĆI SADRŢAJ U ULJIMA BILJNIH KLICA U ZELENIM BILJKAMA SINTETIŠU SE U HLOROPLASIMA NEOPHODAN ZA REPRODUKCIJU I PREVENCIJU MUSKULARNE DISTROFIJE KOD JAGNJADI KAO ANTIOKSIDANS ŠTITI VITAMIN A OD DEGRADACIJE ODSTRANJUJE SLOBODNE RADIKALE ŠTITI MITOHONDRIJE OD LIPIDNE PEROKSIDACIJE TOKOFEROLI KAO ANTIOKSIDATIVNE SUPSTANCE KORISTE SE KAO STABILIZATORI PREHRAMBENIH PROIZVODA

VITAMIN K

O

H

O

n

 

K1-K6 IMAJU 3-4 IZOPRENSKE JEDINICE U BOĈNOM LANCU K1 (FILOHINON) IMA 3 IZOPRENSKE JEDINICE I PRISUTAN JE SAMO U BILJKAMA (lucerka,kopriva, spanać)

   

VITAMIN K JE NEOPHODAN ZA SINTEZU NEKIH FAKTORA KOAGULACIJE U PREHRAMBENOJ INDUSTRIJI SE KORISTI KAO FUNGICID DIKUMAROL JE PRIRODNI ANTAGONIST K VITAMINA, IZOLOVAN JE IZ TRULOG SIJENA SLATKE DJETELINE, KOD ŢIVOTINJA IZAZIVA BOLEST „slatke djeteline“ (unutrašnja krvarenja) MLADIM ŢIVOTINJAMA JE POTREBNO 1-5mg/kg HRANIVA

VITAMIN F

13 18

12

10

9

1 COOH

Linolna kiselina
16 15 13 12 10 9 1 COOH

18

Linolenska kiselina

15 20

14

12

11

9

8

6

5

1 COOH

Arahidonska kiselina

    

VITAMIN F SE SASTOJI IZ 3 NEZASIĆENE KISELINE PRVE DVIJE SU RASPROSTRANJENE U BILJKAMA, A TREĆA U ŢIVOTINJSKIM ORGANIZMIMA KOD ŢIVOTINJA UĈESTVUJE U METABOLIZMU MASTI NAJVIŠE GA IMA U MOZGU, JETRI I RIBLJEM ULJU OTKRIVEN JE KADA JE KOD ŢIVITINJA IZAZVANA AVITAMINOZA, USLJED NEHRANJENJA ULJARICAMA (suvoća koţe; ekcemi; ispadanje dlake)

TRANSPORT ELEKTRONA I OKSIDATIVNA FOSFORILACIJA U respiratornom lancu prisutne su razliĉite molekule, meĊu kojima su: a) Flavoproteini, koji sadrže FMN, ili FAD kao prostetiĉne grupe, a uĉestvuju u transferu jednog, ili dva elektrona; b) Koenzim Q, ili ubihinon (CoQ ili UQ) koji transportuje jedan, ili dva elektrona; c) Razliĉiti citohromi, koji kao prostetiĉnu grupu sadrže hem i koji transportuju jedan elektron; d) Fe-S proteini, koji prenose jedan elektron, pri promjeni redoks broja željeza Fe2+ i Fe3+; e) Joni bakra povezani sa proteinima, koji takoĊe prenose jedan elektron, oscilirajući izmeĊu Cu+ i Cu2+. Sve su navedene molekule, izuzev citohroma-c, povezane sa unutrašnjom membranom mitohondrija eukariota, ili plazmatskom membranom prokariota. Respiratorni niz funcioniše kroz ĉetiri asimetriĉno orijentisana, meĊusobno nezavisna, transmembranska kompleksa, koji ĉine slijedeće funkcionalno-strukturne cjeline:  Kompleks I: NADH-koenzim Q-reduktaza  Kompleks II:Sukcinat-koenzim Q-reduktaza  Kompleks III: Koenzim Q-citohrom -c-reduktaza  Kompleks IV: Citohrom-c-oksidaza Kompleks I, prihvatajući elektrone od NADH, povezuje glikolizu, Krebsov ciklus, oksidaciju masti i lanac transporta elektrona. Kompleks II sadrži enzim sukcinat dehidrogenazu, te stoga direktno povezuje ciklus limunske kiseline i transport elektrona. Kompleksi I i II vode ka redukciji koenzima Q, koji je supstrat kompleksa III. Postoje i dva druga puta za prenos elektrona na CoQ: preko flavoproteina od acil-CoA dehidrogenaza masti i glicerofosfatnih dehidrogenaza. Kompleks III oksidiše CoQH2, a istovremeno redukuje citohrom-c, koji je supstrat kompleksa IV, citohrom-c-oksidaze. Na kraju, kompleks IV transportuje elektrone na molekulski kiseonik, redukuje ga i stvara vodu.

Kompleks I: NADH-CoQ reduktaza Ovaj kompleks, kao što samo ime kaže, transportuje jedan elektronski par sa NADH na CoQ. Drugo ime za ovaj kompleks je NADH dehidrogenaza. Kompleks ukljuĉuje više od 30 polipeptidnih lanaca, jedan molekul FMN i više molekula Fe-S. Na osnovu ove zavisnosti od FMN, NADH-CoQ reduktaza je flavoprotein. Iako precizni mehanizam djelovanja kompleksa I nije poznat, ipak je sigurno da je prvi korak vezivanje NADH za enzim sa unutrašnje strane unutrašnje mitohondrijalne membrane, pri ĉemu redukuje FMN, koji ĉini dio samog enzima, dajući FMNH2. Slijedeći korak je transfer elektrona sa FMNH2 na niz Fe-S proteina, a zatim u krajnjoj fazi elektroni bivaju upućeni ka CoQ, koji je mobilni transporter elektrona.

Struktura kompleksa I CoQ može da se slobodno kreće kroz hidrofobni centar mitohondrijalne unutrašnje membrane zahvaljujući svojim jakim hidrofobnim osobinama. Zatim, CoQ putuje ka kompleksu III. Istovremeno sa transportom elektrona odvija se i transport protona iz matriksa prema meĊumembranskom prostoru. Ovaj proces crpi potrebnu energiju iz uporednog procesa transporta elektrona preko kompleksa I.

Kompleks II: sukcinat-koenzim Q reduktaza Kompleks II je bolje poznat pod imenom kompleks sukcinat dehidrogenaze, koji je jedini enzim ciklusa limunske kiseline povezan sa unutrašnjom mitohondrijalnom membranom. Pri transformaciji sukcinata u fumarat dešava se i redukcija FAD-a, koji ĉini sastavni dio kompleksa II, u FADH2. Odmah nakon ove redukcije, FADH2 prebacuje elektrone na CoQ, a uvijek preko Fe-S proteina. Mala varijacija slobodne energije reakcija, pri ovom kompleksu, nije dovoljna za transport protona preko membrane. Ovo je fundamentalna taĉka, budući da je transport protona blisko povezan sa sistemom ATP-a. Oksidacija FADH2 u nizu transporta elektrona prevodi se zato u sintezu manjeg broja ATP-a, u odnosu na broj ATP molekula koje potiĉu iz oksidacije NADH.

Struktura kompleksa II

Kompleks III: KoenzimQ-citohrom-c-reduktaza U kompleksu III lanca transporta elektrona CoQH2 predaje elektrone citohromu-c putem posebnog sistema, koji se zove ciklus Q. Ciklus poĉinje kada jedna molekula CoQH2 preĊe na mjesto kompleksa III, koje se zove Qp, a nalazi se u dijelu kompleksa III okrenutom ka intramembranskom prostoru. Oksidacija CoQH2 dešava se u dvije faze. Prvo se jedan elektron sa CoQH2 prebacuje na jedan Fe-S protein, a zatim na citohrom-c1. Ovaj proces oslobaĊa dva H+ jona u intermembranski prostor i proizvodi CoQ, anjonski oblik semihinona CoQ. Drugi elektron se prebacuje na hem grupu citohroma-bL, koji se inaĉe nalazi u citosolnoj strani membrane, a zatim odlazi na hem grupu citohroma-bH, koji se nalazi unutar kompleksa bliže matriksu. Elektron zatim prelazi na CoQ lokalizovan u drugoj poziciji, koja se zove Qn, prevodeći tako CoQ u CoQ-. Ova posljednja hemijska struktura ostaje ĉvrsto vezana za poziciju Qn, ĉime se završava prva polovina cilkusa Q. Druga polovina ciklusa Q je sliĉna prvoj, sa jednom drugom molekulom CoQH2, koja se oksidiše na mjestu Qp, a ĉiji se elektroni transportuju na slijedeći naĉin: jedan na citohrom-c1, a drugi prvo na citohrom-bL, a zatim na citohrom-bH. Ipak, u ovom posljednjem dijelu ciklusa Q, elektron sa citohroma-bH prelazi na semihinonski anjon CoQ-, koji potiĉe iz prvog dijela ciklusa. Preuzimajući dva H+ iz mitohondrijalnog matriksa, formira se molekula CoQH2, koja zatim može da se vrati u pul CoQ, a na taj naĉin se završava ciklus Q.

Na slici može da uoĉi se da za svaka dva elektrona, transportovana na citohrom-c, iz matriksa se uzimaju dva H+, a u intermembranski prostor se izbace ĉetiri H+. Ono što povezuje kompleks III i slijedeći, kompleks IV, je citohrom-c, jedini hidrosolubilni citohrom. On prenosi elektrone "klizajući se" preko membrane do kompleksa IV.

Q ciklus

Kompleks IV: citohrom-c-oksidaza Kompleks IV je tako nazvan zato što prima elektrone od citohroma-c i predaje ih kiseoniku, sintetišući vodu. Ovaj kompleks takoĊe vrši i transport protona preko unutrašnje mitohondrijalne membrane. Citohrom-c se oksidiše na citosolnoj strani membrane, a zatim elektroni, jednim složenim sistemom od deset podjedinica, redukuju kiseonik, koji se nalazi sa druge strane membrane.

Prenos elektrona u kompleksu IV Transport elektrona u kompleksu IV ukljuĉuje dvije hem grupe (citohroma-a i citohrom aa3) i dva jona bakra. Ovaj proces služi za redukciju O2, kroz jedan složeni proces, koji prevazilazi didaktiĉki cilj ovog udžbenika. Redukcija kiseonika, u kompleksu IV, praćena je i transferom H+ preko unutrašnje mitohondrijalne membrane. Mehanizam ovog transporta nije poznat. Za svaka dva protona, prebaĉena na citosolsku stranu membrane, proces uzima ĉetiri H+ iz matriksa. Ĉetiri kompleksa respiratornog lanca u potpunosti su nezavisna jedan od drugog i razliĉitim brzinama se kreću kroz membranu.

Model respiratornog niza (lanca) Protonski gradijent, stvoren pri transportu elektrona, predstavlja veliki izvor potencijalne energije. 1961. godine Peter Mitchell, engleski biohemiĉar, dao je ideju da je upravo ovaj gradijent izvor energije za sintezu ATP-a. Ovaj prijedlog je poznat kao hemiosmotska hipoteza. Odnos broja H+ jona, transportovanih uz svaki elektronski par, poznat je pod imenom odnos H+/2e-. Kroz dugi niz godina ovaj odnos je bio predmet velikog interesovanja, ali ipak ga je veoma teško odrediti. Danas, veliki broj nauĉnika prihvata hipotezu da je ovaj odnos pri transportu elektrona sa sukcinata na O2 6 H+ / 2e-. Odnos koji se odnosi na kompleks I ostaje i dalje nepoznanica, iako se misli da bi on trebao da bude 6 H+ / 2e-. Na osnovu ovih vrijednosti, stehiometrija transporta sa NADH na O2 je 10 H+/ 2e. Iako su ovi podaci predstavljeni i na slici treba ih ipak uzeti sa zadrškom, jer bi stvarne vrijednosti mogli da budu i brojevi koji nisu cijeli.

ATP-SINTETAZA ATP-sintetaza je kompleks koji omogućava sintezu ATP-a koristeći gradijent protona stvoren pri transportu elektrona. Enzim se sastoji iz dva osnovna dijela: jedinice F o i jedinice F1. Jedinica Fo je sastavljena iz tri podjedinice oznaĉene kao a, b i c (stehiometrija a1 b2 c10-12). F1 se sastoji iz pet polipeptidnih lanaca: α, β, γ, δ i ε. Podjedinice α i β predstavljaju katalitiĉko mjesto za sintezu ATP-a, podjedinice δ i ε regulišu interakciju F1 sa Fo, dok podjedinica γ ima ulogu da reguliše protok protona prema F1. Fo saĉinjava transmembranski kanal, preko koga protoni struje ka F1 i na taj naĉin obezbjeĊuju sintezu ATP-a.

ATP sintetaza Gore navedeno, potvrĊeno je u eksperimentima in vitro. Jedinica F1 i odvojena od membrane i jedinice Fo može da vrši sintezu ATP-a, a sama jedinica Fo služi kao protonska pumpa. Michell-ova hemiosmotska hipoteza, o tome da je gradijent protona pokretaĉ sinteze ATP-a, je potvrĊena i rezultatima eksperimenta u kome je vještaĉki stvoren gradijent pH u mitohondrijama, koje nisu bile sposobne za transport elektrona i u tom sluĉaju ATP-sintetaza je funkcionisala, dakle samo zahvaljujući prisustvu protonskog gradijenta. Nakon mnogih istraživanja, Paul Boyer je razjasnio i predložio mehanizam djelovanja ATP-sintetaze. Ustanovio je da sama sinteza ATP-a ne zahtijeva potrošnju energije, već da se potencijalna energija protonskog gradijenta koristi za otpuštanje novosintetisanog ATP-a od enzima. Mehanizam podrazumijeva katalitiĉku kooperativnost triju mijesta na molekuli enzima. Pomenuta mjesta imaju razliĉite afinitete za vezivanje ATP-a. Ĉitav proces je jedan ciklus. Na poĉetku, jedno od katalitiĉkih mjesta na enzimu je zauzeto ATP-om i samo to mjesto ima visoki afinitet za ATP. Istovremeno, jedno drugo katalitiĉko mjesto enzima prihvata ADP i P i. Potencijalna energija protonskog gradijenta je iskorištena za konformacione promjene enzima, koje dovode do promjene afiniteta mjesta za ATP, koje je u poĉetku vezalo ATP. Tako se ATP otpušta, dok će enzimsko mjesto koje je prihvatilo ADP i Pi izvršiti sintezu ATP-a. Kao rezultat imaćemo ponovno enzim povezan sa jednom molekulom ATP-a (kao i na poĉetku ciklusa) i jednu novosintetisanu molekulu ATP-a. IZLAZAK SINTETISANOG ATP IZ MITOHONDRIJA Da bi energija sadržana u molekulu ATP-a bila iskorištena tamo gdje je to u ćelijama potrebno, molekula ATP mora da izaĊe iz mitohondrija. ADP mora da bude ubaĉen u mitohondrije, da bi bio iskorišten za sintezu ATP-a. Niti jedan od ovih procesa nije spontan, a razlog je veliko naelektrisanje molekula ATP-a i ADP-a, koje spreĉava da ove molekule lako proĊu kroz biološku membranu. Proces se odvija sistemom transporta ADP-ATP translokaze. Radi se o proteinu, koji efikasno izbacuje jedan molekul ATP, pri istovremenom ulasku jednog molekula ADP-a. Na taj

naĉin nivo nukleotida u mitohondrijama se stalno održava manje-više konstantnim. U mehanizam je ukljuĉeno samo jedno mjesto za vezanje nukleotida, a nalazi se alternativno izloženo prema citozolu i prema matriksu.

Sistem transporta ADP-ATP translokaze ATP se veže na strani matriksa, a zatim se mjesto vezanja pomjera prema citozolnoj strani membrane, gdje otpušta ATP, veže ADP i zatim ga transportuje u matriks. Naelektrisanje, prisutno na molekuli ATP-a, pri pH = 7,2 je oko –4, dok je naelektrisanje ADP-a, pri istoj vrijednosti pH, oko –3. Na taj naĉin, razmjena jedne molekule ATP-a (koja izlazi) i jedne molekule ADP-a (koja ulazi) izaziva transfer jednog negativnog naelektrisanja iz matriksa prema citozolu. Proces je ekvivalentan prelasku jednog protona iz citozola u matriks. Unutrašnja mitohondrijalna membrana je pozitivno naelektrisana sa spoljne strane. Zato je evidentno, da je izlazak ATP-a favorizovan u odnosu na transport ADP-a u istom smjeru. Iz istog razloga ulazak ADP-a je lakši u odnosu na ulazak ATP-a. Dakle, specifiĉnost ADP-ATP translokaze je kontrolisana elektrohemijskim potencijalom, koji je ipak smanjen djelovanjem ove pumpe, pa iz tog razloga mora da se troši i metaboliĉka energija. Ćelija mora da odgovori na ovaj energetski izdatak povećanjem protoka elektrona preko lanca za transport elektrona. Koliki je energetski izdatak razmjene ATP-ADP, u odnosu na ukupnu energiju potrebnu za sintezu ATP-a? Već smo vidjeli da izbacivanje jednog molekula ATP-a, u odnosu na ulazak jednog molekula ATP-a, znaĉi prelazak jednog protona iz citozola u matriks. Za sintezu ATP-a je potrebno utrošiti tri protona, koji preko Fo jedinice prelaze iz citozola u matriks. To znaĉi da za svaki molekul ATP-a, koji se sintetiše, moraju da preĊu ukupno ĉetiri protona iz citozola u matriks. Stoga, oko ¼ energije, koju nam daje respiratorni lanac (transprt elektrona i oksidativna fosforilacija) moramo da upotrijebimo kao elektrohemijsku energiju za transport ATP-ADP. IZLAZAK SINTETISANOG ATP IZ MITOHONDRIJA Da bi energija sadržana u molekulu ATP-a bila iskorištena tamo gdje je to u ćelijama potrebno, molekula ATP mora da izaĊe iz mitohondrija. ADP mora da bude ubaĉen u mitohondrije, da bi bio iskorišten za sintezu ATP-a. Niti jedan od ovih procesa nije spontan, a razlog je veliko naelektrisanje molekula ATP-a i ADP-a, koje spreĉava da ove molekule lako proĊu kroz biološku membranu. Proces se odvija sistemom transporta ADP-ATP translokaze. Radi se o proteinu, koji

efikasno izbacuje jedan molekul ATP, pri istovremenom ulasku jednog molekula ADP-a. Na taj naĉin nivo nukleotida u mitohondrijama se stalno održava manje-više konstantnim. U mehanizam je ukljuĉeno samo jedno mjesto za vezanje nukleotida, a nalazi se alternativno izloženo prema citozolu i prema matriksu.

Sistem transporta ADP-ATP translokaze ATP se veže na strani matriksa, a zatim se mjesto vezanja pomjera prema citozolnoj strani membrane, gdje otpušta ATP, veže ADP i zatim ga transportuje u matriks. Naelektrisanje, prisutno na molekuli ATP-a, pri pH = 7,2 je oko –4, dok je naelektrisanje ADP-a, pri istoj vrijednosti pH, oko –3. Na taj naĉin, razmjena jedne molekule ATP-a (koja izlazi) i jedne molekule ADP-a (koja ulazi) izaziva transfer jednog negativnog naelektrisanja iz matriksa prema citozolu. Proces je ekvivalentan prelasku jednog protona iz citozola u matriks. Unutrašnja mitohondrijalna membrana je pozitivno naelektrisana sa spoljne strane. Zato je evidentno, da je izlazak ATP-a favorizovan u odnosu na transport ADP-a u istom smjeru. Iz istog razloga ulazak ADP-a je lakši u odnosu na ulazak ATP-a. Dakle, specifiĉnost ADP-ATP translokaze je kontrolisana elektrohemijskim potencijalom, koji je ipak smanjen djelovanjem ove pumpe, pa iz tog razloga mora da se troši i metaboliĉka energija. Ćelija mora da odgovori na ovaj energetski izdatak povećanjem protoka elektrona preko lanca za transport elektrona. Koliki je energetski izdatak razmjene ATP-ADP, u odnosu na ukupnu energiju potrebnu za sintezu ATP-a? Već smo vidjeli da izbacivanje jednog molekula ATP-a, u odnosu na ulazak jednog molekula ATP-a, znaĉi prelazak jednog protona iz citozola u matriks. Za sintezu ATP-a je potrebno utrošiti tri protona, koji preko Fo jedinice prelaze iz citozola u matriks. To znaĉi da za svaki molekul ATP-a, koji se sintetiše, moraju da preĊu ukupno ĉetiri protona iz citozola u matriks. Stoga, oko ¼ energije, koju nam daje respiratorni lanac (transprt elektrona i oksidativna fosforilacija) moramo da upotrijebimo kao elektrohemijsku energiju za transport ATP-ADP. ODNOS P/O U RESPIRATORNOM LANCU Odnos P/O je broj mola ATP-a pri oksidativnoj fosforilaciji po svakom elektro-nskom paru koji proĊe kroz transportni lanac elektrona. Iako su brojni nauĉnici proveli intenzivna istraživanja, njegova vrijednost se i dalje razmatra. Ako se prihvati vrijednost od 10 H+, koji izaĊu iz matriksa, za svaka dva elektrona koja preĊu put lanca za transport elektrona sa NADH na O2 i da je za sintezu

jednog molekula ATP-a neophodno da iz citozola u matriks preĊu 4 protona, onda je odnos P/O u mitohondrijama 10/4 = 2,5 (radi se o sluĉaju kada elektroni ulaze u lanac transporta u obliku NADH). Ova vrijednost je nešto niža u odnosu na ranije pretpostavke, koje su ovom odnosu pripisivale vrijednost 3. Što se tiĉe dijela lanca koji polazi od sukcinata, vrijednost H+/ 2e- je 6, te je zato odnos 6/4 = 1,5 , dok je po ranijim pretpostavkama bio 2. Iako i eksperimentalni podaci potvrĊuju ovakve vrijednosti, mnogi biohemiĉari, koji su naviknuti na cijele brojeve vrijednosti P/O, pokazuju veliki skepticizam i negodovanje u odnosu na gore navedene decimalne vrijednosti.

UGLJENI HIDRATI
Ugljeni hidrati, ili saharidi (grčki: sacharon, šećer) su heterogena grupa organskih jedinjenja. Veoma su rasprostranjeni u prirodi, tako da čine najveći dio organske materije na Zemlji. Za organizme su od višestrukog značaja, prvenstveno se koriste u energetske svrhe, ali imaju i značajne specifične funkcije ( strukturna uloga celuloze kod biljaka, mukoproteini, kojih ima u kostima životinja, ulaze u sastav nukleinskih kiselina, glikolipida, krvnih grupa i dr. ). Ugljeni hidrati su najvećim dijelom biljnog porijekla, ali su glavni sastojci ishrane animalnih organizama. Ime ugljenih hidrata u potpunosti ne odgovara, ali se kao takvo odomaćilo, te je i dalje u uptrebi. Naziv potiče otuda što je odnos ugljenika i vode u nekim ugljenim hidratima 1:1; tako, kada posmatramo glukozu čija je formula: C6H12O6 = C6(H2O)6 odnos ugljenika i vode je upravo 1:1 Međutim, kasnije je nađeno da kod mnogih ugljenih hidrata nije takav odnos ugljenika i vode, kao na primjer kod 2-deoksiriboze, ali je naziv, zbog opšte prihvaćenosti, zadržan. Po hemijskom sastavu ugljeni hidrati su polihidroksialdehidi, ili polihidroksiketoni, ili su jedinjenja koja hidrolizom daju polihidroksialdehide i polihidroksiketone. Kvalitativno i kvantitativno najvažnijim biohemijskim procesom na Zemlji, fotosintezom, autotrofni organizmi (biljke) vrše sintezu ugljenih hidrata iz ugljendioksida i vode uz pomoć sunčeve energije i hlorofila.

nCO2+ nH2O

h hlorofil

CnH2nOn

Svi ugljeni hidrati koji se nalaze u živim sistemima pripadaju D-seriji. Naknadno je razvijen jedinstven sistem nomenklature ugljenih hidrata, jer IUPAC-ov sistem, kao veoma nepodesan, dovodi do dugih i nezgrapnih naziva.

PODJELA UGLJENIH HIDRATA Ugljeni hidrati se prema proizvodima hidrolize dijele na : 1. 2. 3. Monosaharide Oligosaharide i Polisaharide Monosaharidi (prosti šećeri ) ne podliježu hidrolizi, a dobijaju se hidrolizom oligo- i polisaharida. U zavisnosti od funkcionalne grupe dijele se na: 1. 2. Aldoze (ugljeni hidrati koji sadrže aldehidnu funkcionalnu grupu) i Ketoze (ugljeni hidrati koji sadrže keto funkcionalnu grupu)

Monosaharidi se prema broju ugljenikovih atoma dijele na: 1. 2. 3. 4. 5. Trioze Tetroze Pentoze Heksoze Heptoze (3- C-atoma) ( 4-C-atoma) (5-C-atoma) (6-C-atoma) (7-C-atoma) i tako dalje.

Iz navedenih imena nekoliko monosaharida vidi se da je za imena monosaharida karakterističan nastavak (sufiks) –oza. Imena monosaharida mogu da se kombinuju, pa imamo: aldotrioze aldotetroze aldopentoze aldoheksoze ketotrioze ketotetroze ketopentoze ketoheksoze

Glicerinaldehid je aldotrioza iz koje se izvode sve ostale aldoze, dok je dioksiaceton ketotrioza iz koje se izvode sve ketoze. Svi se monosaharidi dobro rastvaraju u vodi, kristalna su jedinjenja i imaju sladak ukus. Oligosaharidi (složeni šećeri) hidrolizom daju nekoliko monosaharidnih jedinica. Mogu da budu izgrađeni od istih, ili različitih monosaharidnih jedinica. Sjedinjavanjem dvije monosaharidne jedinice nastaje disaharid, iz tri monosaharidne jedinice nastaje trisaharid itd. Ako je molekul disaharida izgrađen samo od jedne vrste monosaharidnih jedinica, onda je to homoglikan, a ako je disaharidna jedinica izgrađena od različitih monosaharidnih jedinica, onda je to heteroglikan. U prirodi su rašireni disaharidi: saharoza (u šećernoj trsci i šećernoj repi), laktoza (u mlijeku) i maltoza (nastaje hidrolizom skroba). Zavisno od načina povezivanja monosaharidnih jedinica oligosaharidi mogu da budu redukujući i neredukujući. Sve oligosaharidne jedinice su dobro rastvorljive u vodi i slatkog su ukusa. Polisaharidi (makromolekulski šećeri) su izgrđeni od velikog broja monosaharidnih jedinica (nekoliko desetina hiljada), a potpunom hidrolizom polisaharida nastaje veliki broj monosaharidnih jedinica. Nemaju određenu molekulsku masu. Kada je molekul polisaharida izgrađen samo od jedne vrste monosaharidnih jedinica onda spada u homopolisaharide (homoglikane), a ako je molekul polisaharida izgrađen od različitih monosaharidnih jedinica onda je to heteropolisaharid (heteroglikan). U zavisnosti od toga da li su u izgradnji polisaharida zastupljene heksoze, ili pentoze, polisaharidi mogu da budu heksozani, ili pentozani, a najveći broj polisaharida su heksozani. Nerastvorni su u vodi, nemaju sladak ukus i nemaju izrazitu kristalnu strukturu. Za polisaharide se uglavnom koriste trivijalna imena, kao što su celuloza, skrob, glikogen… Polisaharidi predstavljaju osnovnu masu organske materije na Zemlji. Tako je celuloza osnovni gradivni materijal biljaka, a hitin gradivni matrijal insekata. Polisaharidi su glavni izvor energije za žive sisteme.

Monosaharidi Najjednostavniji monosaharidi su trioze, od aldotrioza najvažniji je glicerinaldehid, dok je od ketotrioza najznačajni dioksiaceton. Navedene trioze su od posebnog značaja kao međuproizvodi pri intermedijarnom metabolizmu ugljenih hidrata.
O C H C
2

H OH

CH2 OH C O

CH OH Glicerinaldehid

CH2 OH Dioksiaceton

Od tetroza treba spomenuti:

O C HO H C C H H OH H H C C C

O H OH OH H CH2 OH C C
2

O OH

CH 2 OH D-Treoza

CH 2 OH D-Eritroza

CH OH D-Eritruloza

Pentoze su od posebnog značaja za žive organizme jer neke od njih ulaze u sastav nukleinskih kiselina. Najvažniji predstavnici aldopentoza su:

O C H HO H C C C H OH H OH HO H H C C C

O H H OH H H H C C C C

O H OH OH OH

C OH CH2 OH D-Arabinoza

CH2 OH D-Ksiloza

CH2 OH D-Riboza

Ketopentoze su dvije:
CH 2 OH C HO H C C
2

CH2 OH C H H C C
2

O H OH

O OH OH

CH OH D-Ksiluloza

CH OH D-Ribuloza

Keto grupa je gotovo uvijek na drugom C-atomu. Heksoze spadaju u najrasprostranjenije monosaharide i veoma su važne za živi svijet, a metabolizam svih ugljenog hidrata, in vivo, odvija se preko aldoheksoze D-(+)-glukoze. Od ketoheksoza najznačajnija je fruktoza
CH2 OH C HO H H C C C
2

O H OH OH

CH OH D-Fruktoza

Monosaharidne jedinice se najčešće u rastvorima nalaze u obliku prstena, pri čemu se grade najstabilniji sistemi, a to su peto- i šestočlani prstenovi, tj. alkoholna grupa sa petog, ili četvrtog C-atoma kod aldoheksoza, reaguje sa aldehidnom grupom na prvom C atomu, pri čemu nastaju poluacetali, dok kod ketoheksoza reaguje alkoholna grupa sa petog, ili šestog Catoma, sa keto grupom na drugom C-atomu, pri čemu nastaju poluketali.

Hawort-ova formula za β-D-(+)-glukozu

Kada se hidroksilna grupa na 1. C-atomu (anomerni C-atom) nalazi desno onda je to α-D-(+)-glukoza, a kada se nalazi lijevo onda je to β-D-(+)-glukoza. Hawort-ove formule samo djelimično zadovoljavaju u predstavljanju molekula ugljenih hidrata, jer je šestočlani prsten prikazan kao planarni šestougaonik, a danas je poznato da atomi koji izgrađuju molekul heksoza ne leže u istoj ravni, već su raspoređeni u prostoru, pa iz tih razloga mogu da imaju konformaciju stolice, ili čamca.
CH2OH O O CH2OH

Konformacija stolice aldoheksoza

Konformacija ~amca aldoheksoza

Kod konformacionih formula nisu naznačene hidroksilne grupe i vodonikovi atomi.

SKROB Skrob je najrašireniji polimer biljnog svijeta i predstavlja jedan od proizvoda procesa fotosinteze. Nagomilava se u biljnim organima u obliku skrobnih zrnaca. Kao rezervni polisaharid služi za ishranu biljaka, a indirektno ima neprocjenjivu vrijednost za ishranu životinja i ljudi. Kompleksni polimer skroba izgrađen je iz linearnog polisaharida amiloze i razgranatog polisaharida amilopektina.

AMILOZA

AMILOPEKTIN

CELULOZA

Učestvuje u izgradnji ćelijskih struktura Homopolisaharid, sastavljen je od 300-1500 molukula glukoze povezanih β(1-4) glikozidnom vezom, linearan i sličan amilozi, samo se razlikuju u orijentaciji glikozidnih veza

Dobija se iz raznih sirovina biljnog porekla.

GLIKOLIZA Glikoliza je osnovni katabolički put svih monosaharida. Pored glukoze, ovim putem se razlažu i fruktoza, galaktoza i manoza, kao i pentoze, tetroze i trioze. Većina detalja glikolitičkog puta bila je razjašnjena u prvoj polovini dvadesetog vijeka, radovima njemačkih biohemičara O. Warburg-a, G. Embden-a i O. Meyerhof-a. Zato se, često, tok reakcija glikolize označava kao Embden-Meyerhof-ov put. Glikoliza se odvija u svakoj ćeliji organizma, a energija dobijena ovim procesom koristi se za sintezu najraznovrsnijih proizvoda, kao i brojne fiziološke potrebe organizma. Razlaganje glukoze, putem glikolize, nesmetano se odvija u anaerobnim uslovima, tj. bez prisustva kiseonika. Zahvaljujući tome skeletni, mišići mogu da funkcionišu i u anoksemičnoj epizodi, tj. u prvoj fazi aktivnosi, kada dopremanje kiseonika nije još prikladno potrebama. U anaerobnim uslovima krajnji proizvod razlaganja jedne molekule glukoze su dvije molekule laktata. Laktat se nakuplja u tkivima, a zatim prenosi u jetru, u kojoj se veći dio koristi za resintezu glukoze (glikogena) procesom glukoneogeneze. Glikoliza je i aeroban proces, pri kome iz jedne molekule glukoze nastaju dvije molekule piruvata, koje se uključuju u Krebsov ciklus trikarbonskih kiselina, tako da se početna glukoza potpuno razlaže do CO2 i H2O. U prisustvu kiseonika efikasnost glikolize, u energatskom smislu, značajno raste, što je posebno važno za obezbjeđenje normalne fiziološke funkcije ćelije. Svi enzimi neophodni za odvijanje procesa glikolize se nalaze u citosolu, solubilnoj ekstramitohondrijalnoj frakciji ćelije. Tok reakcija glikolize može da se podijeli u dvije faze: 1. Prva faza glikolize: fosforilacija glukoze i prevođenje u dvije molekule 3fosfoglicerinaldehida (uz utrošak 2 ATP-a); 2. Druga faza glikolize: konverzija 3-fosfoglicerinaldehida u piruvat (uz nastajanje 4 ATP). Tok reakcija Embden-Meyerhof-ovog puta glikolize pokazan je na Slici 17.

Glikoliza Početna reakcija toka glikolize je fosforilacija neutralnog molekula α-D-glukoze, pri čemu se dobija negativno naelektrisan molekul glukozo-6-fosfata. Reakciju katalizuje heksokinaza, enzim prisutan u svim ćelijama (sa izuzetkom jetre), kao i glukokinaza, prisutna samo u hepatocitima. Navedeni enzimi razlikuju se ne samo prema lokaciji, već i prema različitom afinitetu za supstrat, molekulu glukoze. Heksokinaza, koja katalizuje fosforilaciju, ne samo glukoze, već i drugih heksoza, ima veliki afinitet prema glukozi (Km= 100 μmol). To osigurava snabdijevanje tkiva glukozom, čak i u uslovima kada je koncentracija glukoze u krvi niska (ispod 4 mmol/L). Heksokinaza je alosterijski enzim, inhibira se produktom svoje reakcije, glukozo-6-fosfatom. Nasuprot tome, glukokinaza se ne ihibira proizvodom svoje katalize, a ima Km za glukozu 10 mmol. Sa tako visokim Km za glukozu, glukokinaza postaje značajna u metabolizmu samo kada je nivo glukoze u jetri visok (npr. kada osoba konzumira

velike količine šećera). Katjoni Mg2+ su neophodni za reakcije fosforilacije, pošto sa ATP grade MgATP2- kompleks. Reakcija fosforilacije glukoze postiže se uz utrošak jednog molekula ATP: α-D-glukoza + ATP4- → α-D-glukozo-6-fosfat2- + ADP3- +H+ Glukozo-6-fosfat je višestruko značajan proizvod, pošto može da se uključi u više metaboličkih tokova: glikolizu, pentozofosfatni put, glikogenezu, a takođe se dobija i tokom glukoneogeneze i glikogenolize. Zbog toga, da bi glukozo-6-fosfat bio uključen u daljnji glikolitički put potebno je katalitičko djelovanje fosfoheksoizomeraze, pri čemu se fosforilisana glukoza izomerizuje u fruktozo-6-fosfat (aldozno-ketozna reakcija). Reakcija je reverzibilna. Slijedeći korak je fosforilacija fruktozo-6-fosfata. Reakciju katalizuje fosfofruktokinaza, uz učešće Mg2+ i utrošak još jednog mola ATP. Proizvod je fruktozo-1,6difosfat. ΔGo'= -14,2 kJ/mol, dakle reakcija je egzergonična, i ireverzibilna. Navedena reakcija je ključna za cijeli tok glikolize, njenom regulacijom se prekida, ili nastavlja reakcija. Visoka koncentracija ATP u ćeliji, kao i visoke koncentracije citrata i viših masnih kiselina, inhibiraju aktivnost enzima fosfofruktokinaze. Nasuprot, porast koncentracije AMP, ADP i fruktozo-6fosfata djeluju aktivirajuće na isti enzim glikolize. Dejstvom aldolaze (fruktozo-1,6-difosfat aldolaza) difosfatni estar glukoze se cijepa, između C3 i C4, na dvije trioze: dihidroksiacetonfosfat i 3fosfoglicerinaldehid. I pored toga što je u ovoj reakciji ΔGo'= +23,9 kJ/mol ona je reverzibilna, što ne izgleda logično. Međutim, u ovoj reakciji od jedne molekule nastaju dvije i ravnoteža značajno zavisi od koncentracije. Dodatno objašnjenje je da se u toku reakcija fosforilacije, glukoze i fruktozo-6-fosfata, oslobađa dovoljno energije, što omogućava reverzibilni tok reakcije nastajanja fruktozo-1,6-difosfata. Dvije trioze, 3-fosfoglicerinaldehid i dihidroksiacetonfosfat, nastale u prethodno opisanoj reakciji, dejstvom specifične fosfotriozo izomeraze, mogu nesmetano da prelaze jedna u drugu. Međutim, pošto samo 3-fosfoglicerinaldehid direktno prelazi u drugu fazu glikolize, drugi triozo fosfat dihidroksiacetonfosfat mora da se nepresano prevodi u 3-fosfoglicerinaldehid. Ovom reakcijom, koju katalizuje fosfotriozo izomeraza, kompletirana je prva faza glikolize. Iako je, sudeći po ΔGo'= +2,2 kJ/mol, reakcija endergonična, potrebna energija se lako nadoknađuje iz prethodnih egzergoničnih reakcija.
Prva faza glikolize
CH OH 2 5 O H OH H H

H

H 1 OH

HO

OH

glukoza ATP 2+ Mg ADP 2CH O-PO 3 2 O H H H OH H HO OH H OH D-glukozo-6-fosfat fosfoheksoizomeraza 2O P - OCH2 3

heksokinaza glukokinaza

O

CH OH 2 OH

H

H HO

OH H D-fruktozo-6-fosfat fosfofruktokinaza 2O P - OCH 2 3 O H HO H OH H D-fruktozo-1,6-difosfat aldozno cijepanje ATP 2+ Mg ADP 2CH O-PO 3 2 OH

aldolaza CH2 OH C O C HC

O H OH

2CH O- PO 2 3 Dihidroksiacetonfosfat

2CH O- PO 3 2 D-3-fosfoglicerinaldehid

Druga faza toka reakcija glikolize
Ova faza glikolitičkog puta uključuje reakcije koje prevode metaboličku energiju sadržanu u molekuli glukoze u ATP. Nastaju četiri nove molekule ATP, ali kada se uračuna i utrošak od dvije molekule ATP, u prvoj fazi glikolize, preostaju dva ATP. U reakciji oksidacije 3-fosfoglicerinaldehida nastaje organofosfat bogat energijom 1,3-difosfoglocerat (1,3DPG). Reakciju katalizuje NAD zavisni enzim, 3fosfoglicerinaldehid dehidrogenaza, čiji se apoenzimski dio sastoji iz 4 subjedinice (4 peptidna lanca), od kojih svaka ima po jednu tio grupu. Jedna SH grupa je i u katalitičkom centru. Oksidacija 3-fosfoglicerinaldehida se odvija postepeno. Prvo se vezuje NAD+ koenzim za apoenzim, u blizini SH grupe. Tako kompletirani enzim reaguje sa supstratom, gradeći prolazni kompleks enzima i supstrata, tipa poluacetalnog tio estra. Dovođenje 3fosfoglicerinaldehida na kritično rastojanje od NAD+ omogućava oksido-redukciju u sastavu kompleksa enzimsupstrat. Tada se aldehidna grupa oksidiše u karboksilnu, a kovalentno vezani vodonik sa 3-fosfoglicerinaldehida se prenosi na NAD+. U kompleksu enzim-supstrat nastaje energijom bogati tioestar acil~enzim. Oksido-redukcija unutar kompleksa enzim-supstrat je izrazito egzergonična reakcija (ΔGo'= - 43,0 kJ/mol). NAD+ zavisne dehidrogenaze su holoezimi koji lako disosuju na koenzim NAD i apoenzim, pa će nakon završene oksido-redukcije redukovani koenzim NADH++H+ preći na apoenzim drugog enzima glikolize laktat dehidrogenazu, koja piruvat u završnoj reakciji glikolize (pod anaerobnim uslovima) prevodi u laktat. U ovoj reoksidaciji nastaje NAD+, koji se vraća na apoenzim 3-fosfoglicerinaldehid dehidrogenaze omogućavajući oksidaciju novog molekula supstrata. U gore navedenom kompleksu acil~enzim slijedi razlaganje, fosforiliza. 1,3-difosfoglicerat ima visokoenergetsku fosfatnu vezu na C1 položaju, tako da u ovoj reakciji glikolize, uz jedan molekul ADP i Mg2+, nastaje uz 3-fosfoglicerat i jedan molekul ATP. Ovu reakciju, izrazito egzergoničnu (ΔGo'= - 18,9 kJ/mol) katalizuje enzim fosfoglicerat kinaza. Jedan dio energije koristi se za poravnanje energetskog deficita oksidacije 3-fosfoglicerinaldehida u 1,3difosfoglicerat. Reakcija nastajanja ATP može da bude onemogućena u prisustvu arsenata. U toku druge faze glikolitičkog puta, slijedi reakcija konverzije 3-fosfoglicerata u 2-fosfoglicerat, što katalizuje enzim fosfoglicerat mutaza.

Druga faza glikolize
O C HC H OH

2CH OPO3 2 D--3-fosfoglicerinaldehid D-3-fosfoglicerinaldehid dehidrogenaza P 2O PO 3 NADH+H O C HC OH + NAD +

2CH OPO 3 2 1,3-difosfoglicerat ADP 2+ Mg ATP C OO HC OH

fosfoglicerat kinaza

2CH OPO 3 2 3-fosfoglicerat fosfoglicerat mutaza 2+ Mg -

CO O

2HC-OPO 3 CH OH 2 2-fosfoglicerat + K 2+ enolaza Mg H O 2 COO 2C-OPO 3 CH2 fosfoenolpiruvat ADP 2+ Mg O H C 3 C Piruvat ATP COO

Zatim, 2-fosfoglicerat, uz katalitičko djelovanje enolaze (uz Mg2+ ili Mn2+) prelazi u fosfoenolpiruvat, uz izdvajanje molekula vode. U toku ove reverzibilne reakcije drugi C atom 2-fosfoglicerata gubi H (oksidiše se), dok treći C atom gubi OH (redukuje se). Fosfoenolpiruvat je visokoenergetski proizvod glikolize. Pod uticajem enzima piruvat kinaze, fosfatna grupa sa dijelom energije prenosi se sa fosfoenolpiruvata na molekul ADP i nastaje piruvat, uz izdvajanje molekula ATP. Reakcija je značajno egzergonična (ΔG o'= 31,7 kJ/mol), što objašnjava njen ireverzibilni karakter. K+ je fiziološki aktivator piruvat kinaze. Za piruvat kinazu karakteristična su dva oblika: L, tipičan za jetru i M, mišićni oblik. L oblik piruvat kinaze se aktivira sa fruktozo-1,6-difosfatom, a inhibiše cAMP-om i alaninom. Aminokiselina alanin transaminacijom daje piruvat, a pošto je piruvat i krajnji proizvod aerobne glikolize, da ne bi došlo do nepotrebnog nagomilavanja ovog proizvoda, nastaje privremena alosterička inhibicija alaninom enzima piruvat kinaze. Nastali piruvat prvo se oslobađa u nestabilnom enolnom obliku, a zatim spontano prelazi u mnogo stabilniji keto oblik piruvata. U anaerobnim uslovima, iz piruvata, djelovanjem laktat dehidrogenaze nastaje laktat. Iako je za ovu reakciju ΔGo'= +25,0 kJ/mol, ona je reverzibilna, najvjerovatnije što se tokom glikolize oslobodilo toliko energije, da je povratni tok reakcije sasvim izvodljiv. Detalji energetskog bilansa gikolize izloženi su nakon Krebsovog ciklusa trikarbonskih kiselina.

Regulacija glikolize
Regulacija toka reakcija glikolize počinje već u prvoj reakciji, koju katalizuju heksokinaza ili glukokinaza. Glukozo-6-fostat u povišenoj koncentraciji inhibiše heksokinazu, što prekida fosforilaciju novih molekula glukoze. Navedeno se dešava u ekstrahepatičnim tkivima. U jetri ne postoji heksokinaza, već isključivo glukokinaza, koja nije osjetljiva na nakupljanje produkta svoje katalize, tako da izostaje prva regulatorna tačka, navedena za ekstrahepatična tkiva. Druga regulatorna tačka u ekstrahepatičnim tkivima, a prva u jetri je aktivnost enzima fosfofruktokinaze, ključnog enzima glikolize. Od aktivnosti ovog enzima zavisi da li će glikoliza da se nastavi, ili će da bude prekinuta. Alosterički inhibitori fosfofruktokinaze su citrati i ATP, a aktivatori su AMP, fruktozo-6-fosfat i fruktozo-2,6-difosfat. Citrati djeluju indirektno na glikolizu. Njihovo nakupljanje omogućava brzu i efikasnu sintezu ATP-a, kroz ciklus trikarbonskih kiselina, dok je glikoliza manje efikasan metabolički put. Tako da citrati "štede" glukozu. Što se tiče dejstva ATP-a, logično je da kada su rezerve ATP-a popunjene nema potrebe za razlaganjem glukoze glikolizom. Nasuprot tome, svako smanjenje broja molekula ATP-a predstavlja alarm koji pokreće glikolizu u cjelini. Porast lokalnog nivoa fruktozo-6-fosfata djeluje kao moćan alosterijski aktivator fosfofruktokinaze. Pokretanjem ovog enzima nastaju nove molekule fruktozo-1,6-difosfata i uspostavlja se ekvimolaran odnos sa fruktozo-6-fosfatom. Porast ćelijskog nivoa fosfoenolpiruvata takođe djeluje regulatorno na glikolizu. Hormoni su značajno uključeni u proces regulacije glikolize. Glukagon i adrenalin inhibišu glikolizu, kako bi što više molekula glukoze bilo iskorišteno za održavanje glikemije. Insulin povećava efikasnost enzima glukokinaze, a sa njom i efikasnost glikolize u cjelini.

CIKLUS TRIKARBONSKIH KISELINA
Ciklus limunske kiseline, ili ciklus trikarbonskih kiselina, predstavlja put razlaganja acetilnih ostataka do krajnjeg kataboličkog proizvoda CO2. Odvija se u ćelijama svih aerobnih organizama. U razjašnjenju reakcija ovog metaboličkog puta veliki doprinos je, svojim radovima u periodu od 1932. do 1937. godine, dao Hans Krebs, u čiju čast se ciklus limunske kiseline označava i kao Krebsov ciklus trikarbonskih kiselina. Ciklus trikarbonskih kiselina predstavlja univrzalni put metabolisanja zajedničkog međuproizvoda razlaganja (acetilnih ostataka) ugljenih hidrata, proteina i masti. Pored toga, Krebsov ciklus je izvor brojnih molekula neophodnih za anaboličke procese, kojima nastaju masne kiseline, ugljeni hidrati i aminokiseline. Energetski učinak ovog ciklusa je veoma značajan, pošto se odvija u aerobnim uslovima i tako priključuje na respiratorni lanac. Svi enzimi ciklusa limunske kiseline se nalaze u mitohondrijalnoj frakciji ćelije, prvenstveno u matriksu. Ovakva lokalizacija ciklusa je veoma značajna, jer je u susjedstvu respiratornog lanca, što omogućuje lako uključivanje brojnih molekula redukovanih koenzima, koji nastaju u ciklusu limunske kiseline, u respiratorni lanac. Da bi se krajnji proizvod glikolize, piruvat, uključio u Krebsov ciklus potrebno je da se prevede u acetil-CoA, što se odvija nakon prelaska piruvata u matriks mitohondrija. Oksidativna dekarboksilacija piruvata Piruvat se zajedno sa jednim protonom (H+), posebnim mehanizmom transportuje kroz unutrašnju mitohondrijalnu membranu, a zatim počinje njegova oksidativna dekarboksilacija u acetil-CoA: CH3-CO-COOH + NAD+ + CoA → CH3-CO~S-CoA + CO2 + NADH+ + H+ Proces je katalizovan piruvat dehidrogenaznim kompleksom, kojeg sačinjavaju tri enzima: piruvat dehidrogenaza, dihidrolipoil transacetilaza i dihidrolipoil dehidrogenaza. Piruvat prvo reaguje sa piruvat dehidrogenazom, koja kao koenzim sadrži tiaminpirofosfat (TPP), pri čemu piruvat gubi CO2. Poslije ove dekarboksilacije dobija se ostatak-hidroksietil, koji privremeno ostaje vezan za TPP. Dejstvom dihidrolipoil transacetilaze, pomoću oksidisane liponske kiseline, nastaje S-acetil lipoat. Pri ovoj reakciji hidroksietil ostatak se oksidiše, lipoat redukuje, a istovremeno oslobađa TPP. U prisustvu enzima dihidrolipoil transacetilaze S-acetil lipoat reaguje sa CoA, te nastaje acetil-CoA i redukovana liponska kiselina. Redukovani lipoat se oksidiše pomoću enzima dihidrolipoil dehidrogenaze, koja kao koenzim sadrži FAD, uz stvaranje FADH2, a oksidisani lipoat se ponovo uključuje u novi ciklus. Redukovani koenzim FADH se oksidiše pomoću NAD. Nastali NADH++H+ predaje elektrone i protone respiratornom lancu. Energetski efekat oksidativne dekarbiksilacije piruvata je značajan.

Oksidativna dekarboksilacija piruvata Osim reakcije oksidativne dekarboksilacije α-ketoglutarata (iz ciklusa limunske kiseline), navedena reakcija oksidativne dekarboksilacije piruvata je jedina reakcija u organizmu gdje se vrši predavanje vodonika sa flavin enzima na nikotiamid enzime, a u svim ostalim reakcijama reoksidacija koenzima se vrši u obrnutom smjeru. Sinteza oksalacetata Pored molekula acetil-CoA, nastalih u oksidativnoj dekarboksilaciji piruvata, aktivisani acetilni ostaci, u velikom broju, vode porijeklo od katabolizma masnih kiselina, ali i od bezazotnih ostataka aminokiselina. Da bi Krebsov ciklus mogao da otpočne potrebno je da se u mitohondrijama nađe odgovarajući broj molekula oksalacetata. Oksalacetat se sintetiše u mitohondrijama iz piruvata, karboksilacijom, uz enzim piruvat karboksilazu: COOH COOH ADP + P CO H2 O 2 ATP 2+ CH 2 C O Mg biotin O C CH 3 piruvat COOH karboksilaza oksalacetat Piruvat Za reakciju sinteze uz jedan molekul ATP potreban je katjon Mg2+. Enzim piruvat karboksilaza na svaku od svoje četiri podjedinice kovalentno vezuje po jednu molekulu biotina, kao i jedan Mg2+. Biotin ima ulogu aktivnog mjesta enzima piruvat karboksilaze, jer služi za aktivaciju CO2 i prenos karboksilne grupe na piruvat. Iako je po karakteru navedena reakcija izrazito reverzibilna, pravac reakcije je pomjeren ka sintezi oksalacetata. To objašnjava činjenica da je rastući broj molekula piruvata, koje nastaju u procesu glikolize u citosolu, veliki.

Acetil-CoA, kao univerzalni međuproizvod katabolizma masti, ugljenih hidrata i proteina, snažan je alosterijski regulator piruvat karboksilaze, djelujući na proteinski nosač tog enzima. Kao alosterijski aktivator piruvat karboksilaze, acetil-CoA utiče na prevođenje piruvata u oksalacetat, što obezbjeđuje ravnomjerno katabolisanje acetil ostataka. U protivnom, došlo bi do narušavanja acidobazne ravnoteže. Interesantno je da je acetil-CoA istovremeno i alosterijski inhibitor kompleksa piruvat dehidrogenaze, tj. usporava dobijanje novih molekula acetil-CoA. Navedeni alosterijski efekti su uravnoteženi. Reakcije ciklusa trikarbonskih kiselina Krebsov ciklus počinje reagovanjem oksalacetata i aktivnog acetil ostatka (acetilCoA), pri čemu nastaje citrat, prvi međuproizvod ciklusa. Reakciju katalizuje enzim citrat sintaza, pri čemu se dešava aldolna kondenzacija između metil grupe acetil-CoA i karbonilne grupe oksalacetata. Dobijeni citroil-CoA, kao labilni tioestar, lako se hidrolizuje na citrat i slobodni CoA. U fiziološkim uslovima prva reakcija Krebsovog ciklusa je ireverzibilna (ΔGo= -31,4) Citrat, prvi od četiri međuproizvoda sa tri karboksilne grupe, spontano ulazi u reakciju koju katalizuje akonitaza. Ovaj enzim u svom aktivnom mjestu sadrži Fe2+ i u dvostepenoj reakciji ciklusa trikarbonskih kiselina prevodi prvo citrat u cis-akonitat, a zatim ovo prolazno jedinjenje u izocitrat. Na Slici 19. pokazano je aktivno mjesto akonitaze.

Aktivni centar akonitaze Zbirna reakcija konverzije citrata u izocitrat je reverzibilna po svom karakteru (ΔGo= +6,7), ali pravac reakcije diktira brza oksidacija izocitrata, tj. naredna reakcija ciklusa trikarbonskih kiselina. Inhibitor akonitaze je fluoroacetat, jer se fluoroacetat-CoA kondenzuje sa oksalacetatom u fluorocitrat, koji inhibira dejstvo akonitaze. Oksidaciju izocitrata katalizuje mitohondrijalni enzim NAD+izocitrat dehidro-genaza. Pored ove izocitrat dehidrogenaze dokazane su još dvije, i to NADP+ zavisne, lokalizovane u citoplazmi i mitohondrijama. NAD+ izocitrat dehidrogenaza vrši oksidaciju izocitrata u oksalsukcinat, a potom dekarboksilaciju u α-ketoglutarat (ΔGo= - 8,4). α-ketoglutarat je prvi dikarbonski

međuproizvod ciklusa trikarbonskih kiselina i sa njim otpočinje serija oksidoredukcionih reakcija. NADH+H+ nastao u reakciji prevođenja izocitrata odlazi u respiratorni lanac.

Ciklus trikarbonskih kiselina α-keto glutarat se oksidiše dejstvom multienzimskog kompleksa α-keto glutarat dehidrogenaze, koji sadrži tiaminpirofosfat, lipoat, CoA, FAD i NAD+. ΔGo' ove reakcije iznosi – 30,0 kJ/mol, pa je reakcija ireverzibilna. Nastali sukcinil–CoA je tioestar bogat energijom, pa se sukcinil lako odvaja od CoA. Reakcija nije prosta hidroliza, već reakcija konverzije energije. Ostvaruje se uz pomoć GDF i neorganskog fosfata, pri čemu se izdvaja

GTP. Nastajanje ATP iz GTP vrši se posredovanjem enzima fosfokinaze, pri čemu se jedan labilno vezani ortofosfat, zajedno sa energijom, prenosi sa GTP na ADP. Sukcinat se oksidiše uz pomoć enzima sukcinat dehidrogenaze i u reverzibilnoj reakciji nastaje fumarat. Sukcinat dehidrogenaza se sastoji iz dvije subjedinice, jednog kovalentno vezanog FAD, 4 atoma željeza i 4 acidolabilna sumpora. Mijenjanjem valence joni željeza prenose elektrone. Pri ovoj reakciji nastaje FADH. Na fumarat, nezasićeni međuproizvod, adira se molekul vode, katalitičkim djelovanje fumaraze, pri čemu nastaje malat. Oksidacijom malata, uz malat dehidrogenazu i njen koenzim NAD+, nastaje oksalacetat. Reakcija je endergonična (ΔGo'=+29,7 kJ/mol), a potrebna energija za izvođenje reakcije se obezbjeđuje na račun prethodnih egzergoničnih reakcija. Oksalacetat ulazi u naredni krug ciklusa trikarbonskih kiselina. Međuproizvodi Krebsovog ciklusa imaju značaj u anaboličkim procesima. Tako, αketo kiseline predstavljaju početne molekule u biosintezi bjelančevina. Regulacija ciklusa trikarbonskih kiselina Kontrola odvijanja ciklusa trikarbonskih kiselina otpočinje regulacijom piruvat dehidrogenaznog kompleksa, kroz kovalentnu modifikaciju piruvat dehidrogenaze. Piruvat dehidrogenazni kompleks se inaktivira fosforilisanjem, a aktivira defosforilisanjem. Brza kontrola se postiže pomoću produkata navedene enzimske reakcije, acetil-CoA i NADH++ H+. U samom ciklusu, prva reakcija, koju katalizuje citrat sintaza, može da se uspori alosterijskom inhibicijom enzima pomoću ATP-a i aktiviranih masnih kiselina (acil-CoA) sa dugim lancima, kada se navedene molekule nađu u suvišku, na intraćelijskom nivou. ATP i NADH su alosterički inhibitori izocitrat dehidrogenaze, dok je ADP moćan alosterijski aktivator. α-ketoglutarat dehidrogenazni kompleks reguliše se analogno piruvat dehidrogenaznom kompleksu; u višku ATP-a, NADH i sukcinil-CoA enzimski kompleks se inaktiviše. Sukcinat dehidrogenaza se inhibira viškom oksalacetata, čija se količina kontroliše aktivnošću malat dehidrogenaze, koja zavisi od odnosa NADH/NAD+. Pošto su sve enzimske reakcije ciklusa međuzavisne, a njihovi proizvodi se nalaze u ekvimolarnom odnosu, to će svaki porast intraćelijskog nivoa oksalacetata djelovati inhibitorno na sukcinat dehidrogenazu, sve do uspostavljanja normalnih odnosa. Oksalacetat nije samo polazni supstrat ciklusa trikarbonskih kiselina, već je takođe polazni supstrat u sintezi glukoze glukoneogenezom. U uslovima kada nedostaje glukoza, tada se donekle suprimira ciklus trikarbonskih kiselina, a prednost dobijaju anabolički procesi. ENERGETSKI EFEKTI OKSIDACIJE GLUKOZE Kompletna razgradnja molekule glukoze do CO2 i H2O praćenjena je kroz tok reakcija glikolize i ciklusa limunske kiseline. Pretpostavljajući aproksimativni P/O odnos, broj ATP molekula proizvedenih potpunom oksidacijom molekule glukoze moguće je izračunati. Kao što je objašnjeno u okviru respiratornog lanca i oksidativne fosforilacije, smatramo da su vrijednosti za P/O 2,5 za oksidaciju NADH preko malat-aspartatnog Shuttle-a, odnosno 1,5 za oksidaciju preko glicerol- fosfatnog Shuttle-a. Tako ukupno dobijamo po molekuli glukoze 30, ili 32 ATP-a, a većina ATP-a, 26 od 30 i 28 od 32 je proizvedena oksidativnom fosforilacijom, a samo su 4 ATP-a rezultat

direktne sinteze tokom glikolize i ciklusa limunske kiseline (obično se za ovakve ATP kaže da su proizvedeni na nivou supstrata). Uzimajući u obzir da oksidacija glukoze u ćeliji ima ΔG= -2937 kJ/mol, možemo da izračunamo da efikasnost svih procesa (glikoliza, ciklus limunske kiseline, transport elektrona i oksidativna fosforilacija) iznosi 54%, što je ranije i pokazano

NASTANAK ATP-a U OKSIDACIJI GLUKOZE ATP osobođene iz glukoze REAKCIJE Shuttle glicerol- Shuttle malatfosfat aspartat Glikoliza: glukoza do piruvata ( citosol) fosforilacija glukoze -1 -1 fosforilacija fruktozo-6-fosfata -1 -1 defosforilacija 2 molekule 1,3-DPG +2 +2 defosforilacija 2 molekule fosfoenolpiruvata +2 +2 oksidacija 2 molekule 3-fosfogliceraldehida daje 2 NADH Prevođenje piruvata u acetil-CoA (mitohondrije) 2 NADH Ciklus trikarbonskih kiselina (mitohondrije) 2 molekule GTP iz 2 molekule sukcinil-CoA +2 +2 oksidacija 2 molekule svakog od izocitrata, α-ketoglutarata i malata daje ukupno 6 NADH oksidacija 2 molekule sukcinata daje 2 FADH2 Oksidativna fosforilacija (mitohondrije) 2 NADH iz glikolize daje 1,5 ATP za svaki, ako je NADH oksidisan +3 +5 shuttle sistemom glicerol-fosfata, ili 2,5 ATP-a preko malat-aspartatnog shuttle-a oksidativna dekarboksilacija 2 piruvata do 2 acetil-CoA: +5 +5 2 NADH daju svaki po 2,5 ATP-a 2 FADH2 iz svakog ciklusa trikarbonskih kiselina daje po 1,5 ATP +3 +3 6 NADH iz ciklusa trikarbonskih kiselina daje po 2,5 ATP +15 +15 UKUPNO +30 +32 * Dobijanje ATP može da bude izmijenjeno zavisno od metaboličkih uslova.

GLIKOGENOLIZA Proces razlaganja glikogena, glikogenoliza, tj. pokretanje, ili mobilizacija deponovanih molekula glukoze iz glikogena je složen, enzimski katalizovan proces. Glikogen je u organizmu čovjeka prisutan u svim ćelijama, ali ga najviše ima u jetri i mišićima (do 5% težine jetre i oko 0,5-1% mišićne mase). Glikogen jetre učestvuje u održavanju glikemije, dok glikogen mišića služi kao izvor energije. Glikogenoliza je katalizovana brojnim enzimima, a prvi u nizu je fosforilaza (glikogen fosforilaza), koja raskida α-1,4-glikozidnu vezu. Fosforilaze jetre i mišića, iako imaju istu funkciju, donekle se razlikuju.

Glikogenoliza Glikogen fosforilaza jetre se javlja u dva oblika: glikogen fosforilaza a je aktivni oblik, a glikogen fosforilaza b je neaktivni oblik. Glikogen fosforilaza sadrži ostatak serina, a za OH grupu ove aminokiseline estarski je vezana ortofosforna kiselina. Djelovanjem regulatornog enzima protein fosfataze-1 hidrolitički se uklanja ortofosfat, pri čemu fosforilaza a postaje neaktivna, tj. fosforilaza b. Drugi regulatorni enzim, kinaza glikogen fosforilaze, odgovorna je za reaktivaciju glikogen fosforilaze b, pri čemu se utroši jedna molekula ATP. Glikogen fosforilaza mišića je funkcionalno slična sa istoimenim enzimom jetre, ali se imunološki i genetski značajno razlikuju. Glikogen fosforilaza je dimer, a svaka podjedinica sadrži piridoksal-fosfat. Aktivni su samo dimerni oblici enzima. Hepatociti posjeduju α1 i β2 receptore za kateholamine, kao i receptore za glukagon. Vezivanje glukagona za receptore aktivira membranski enzim adenil ciklazu, a posljedično nastajanje cAMP-a vodi aktivaciji glikogen sintetaze. Za α1 receptore vezuje se noradrenalin, što pokreće mobilizaciju Ca2+ iz mitohondrija, a porast koncentracije ovog katjona aktivira kalmodulinsku komponentu kinaze. Kinaza fosforiliše glikogen fosforilazu b, u aktivni oblik, što vodi razlaganju glikogena. Suprotno kateholaminima i glukagonu djeluje insulin. Posredstvom svojih intraćelijskih medijatora, insulin djeluje inhibitorno na glikogenolizu, prekida njen lanac aktivacije enzima, pomoću fosfodiesteraze, odnosno, posredstvom protein fosfataze. Porast koncentracije insulina u krvi, uz pad koncentracije kateholamina i glukagona, dovodi do usporavanja glikogenolize, a favorizovanja glikogeneze. Hormonska aktivacija mišićne glikogen fosforilaze moguća je pomoću hormonskih signala, ili odgovarajućih nervnih impulsa koji povećavaju membransku propustljivost i tako uslovljavaju oslobađanje Ca2+ iz intraćelijskih mišićnih depoa. Adrenalin uslovljava aktivisanje adenil ciklaze, a nastali cAMP je pokretač aktivnosti cAMP zavisne protein kinaze

koja, uz utrošak ATP, fosforiliše kinazu b u aktivnu formu. Nastala kinaza a djeluje na supstrat glikogen i razlaže ga na određeni broj molekula glukozo-1-fosfata. Enzim cAMP protein kinaza (ranije nazivana protein kinaza) građen je od dva para subjedinica, a u svakom paru se nalazi po jedna regulatorna (R) i katalitička (C) subjedinica. Prilikom pokretanja aktivnosti cAMP zavisne protein kinaze (R2C2) cAMP se vezuje za R subjedinicu, izdvaja je od katalitičke (C) subjedinice koja, kao aktivisani enzim, djeluje na naredni enzim (kinazu b). Pošto je glikogenoliza u mišićima energetski veoma značajna, ona se i nekoliko stotina puta ubrza u trenutku započinjanja mišićne kontrakcije. U svemu veliki značaj ima uključivanje kalmodulinske komponente kinaze u glikogenolizu. Tako se u mišićima, ovim mehanizmom, glikogenoliza pokreće po skraćenom postupku. Nervni impulsi, preko nervnomišićne sinapse, uzrokuju porast permeabilnosti membrane i oslobađanje Ca2+ iz intraćelijskog depoa. Razgradnja glikogena otpočinje dejstvom aktivirane glikogen fosforilaze ( u mišićima, ili jetri). Pri tome se dešava fosforilitička razgradnja, tj. uvođenje molekule neorganskog fosfata. Dakle, to je proces koji se razlikuje od hidrolitičke razgradnje, koja uključuje molekul vode. Kidanjem α-1,4-glikozidnih veza iz glikogena se, sa neredukcionog kraja, odvaja odgovarajući broj molekula glukozo-1-fosfata: (glukoza)n + HPO42glikogen fosforilaza

(glukoza)n-1 + glukozo-1-fosfat

Skraćenje lanca makromolekule glikogena teče sve do onog trenutka dok se ne približi mjestu grananja glavnog lanca α-1,6-glikozidnim vezama, na rastojanje od četiri glikozil ostatka. Tada djeluje enzim trisaharid transferaza, koja trisaharidni segment prenosi na glavni lanac, koji se tako produžava. Poslije premještanja tri glukozil ostatka mjesto grananja je dostupno dejstvu enzima degrananja (amilo-1,6-glukozidaza), koji raskida α-1,6-glikozidnu vezu. To se odvija hidrolitičkim putem, pa se logično dobija molekula D-glukoze, a ne glukozo-1-fosfat. Molekul glukozo-1-fosfata niti može da napusti ćelijsku sredinu i pređe u krv, niti direktno može da se koristi kao energetski materijal, jer se ne razlaže glikolizom. Zato je neophodno, da se dejstvom fosfoglukomutaze, prevede u glukozo-6-fosfat, koji može da se uključi u glikolizu. U jetri, i u manjoj mjeri u bubrezima, nalazi se specifičan enzim glukozo-6-fosfataza, koja razlaže glukozo–6-fosfat, dajući slobodnu glukozu, koja odlazi u cirkulaciju.

PENTOZOFOSFATNI PUT Stalna potreba ćelija za molekulama NADPH, potrebnim za brojne anaboličke reakcije, obezbjeđuje se velikim dijelom razgradnjom glukoze pentozofosfatnim putem, koji se takođe naziva i heksozo-monofosfatni šant, ili fosfoglukonski put. Redukovani koenzim NADPH neophodan je u sintezi viših masnih kiselina i steroida, pa je razumljivo da se pentozofosfatni put odvija u jetri, mliječnoj žlijezdi za vrijeme laktacije, masnom tkivu, testisima i kori nadbubrega. U skeletnim mišićima ovaj metabolički put se odvija veoma slabim intenzitetom. Energatski efekti heksozo-monofosfatnog šanta su zanemarljivi, ali njegovi međuproizvodi mu daju poseban značaj, pa ne može da se smatra sporednim procesom razgradnje glukoze. Generalno gledano, biohemijski značaj pentozofosfatnog puta je slijedeći:  nastajanje NADPH;  konverzija heksoza u pentoze (ribozo-5-fosfat je neophodan za sintezu nukleotida i nukleinskih kiselina);  konverzija pentoza u heksoze, koje zatim mogu da se razlažu uobičajenim tokom glikolize;  mogućnost oksidativnog razlaganja glukoze do CO2;  očuvanje funkcionalne sposobnosti eritrocita (značaj enzima G6PDH). Razlaganje glukoze do CO2 može sumarno da se predstavi slijedećom jednačinom: 3glukozo-6-fosfat + 6NADP+ → 3CO2 + 2glukozo-6-fosfat + 3-fosfoglicerinaldehid + 6NADPH + 6H+ Lanac enzimskih reakcija pentozofosfatnog puta odvija se u citosolu ćelije. Sve reakcije ovog puta mogu da se podijele u dvije faze: oksidativnu i neoksidativnu. Tokom oksidativne faze fosforilisani oblik glukoze, glukozo-6-fosfat, prvo dva se puta oksidiše, a potom dekarboksiliše. Nastaje prvi pentozni međuproizvod, ribulozo-5-fosfat U drugoj, neoksidativnoj fazi, ribulozo-5-fosfat se izomerizuje u ribozo-5-fosfat, odnosno ksilulozo-5-fosfat, da bi zatim transketolaznom i transaldolaznom reakcijom nastali fruktozo-6-fosfat i eritrozo-4-fosfat, odnosno 3-fosfatglicerinaldehid.

COO 22CH OPO3 + + CH OPO3 2 NADPH + H  2 NADP O O OH H 2+ H Mg H 1 H  OH H OH H glukozo-6-fosfat HO H HO  dehidrogenaza  H OH H OH Glukozo-6-fosfat 6-fosfoglukono-lakton HC 2 C HO C HC HC O H OH HC OH
2-

HC HO 2+ Mg H2O 2 CH HC HC

OH

OH

O

laktonaza

OH 2CH OPO 3 2

6-fosfoglukonat sinteza nukleinskih kiselina

OH O C OH OH OH HC HC HC O H OH OH

6-fosfoglukonolakton dehidrogenaza + Mg2+ CO NADP 2 3 + NADPH + H fosfopentozo izomeraza 4 CH OH 2 O C HC HC OH OH

CH HC HC

CH OPO 3 2 eritrozo-4-fosfat 7 CH OH 2 O C HO CH HC HC OH

2CH OPO 3 2 sedoheptulozo-7-fosfat 6 C O H OH

OH 2CH OPO 3 2 ribozo-5-fosfat

5 ribulozo-5-fosfat epimeraza

2CH OPO 2 3 ribulozo-5-fosfat

transaldolaza HC

transketolaza CH OH 2 C O HO CH HC OH

CH OPO2 2 3

gliceraldehid-3-fosfat OH 2CH OPO 3 2 fruktozo-6-fosfat

2CH OPO 2 3

ksilulozo-5-fosfat

Pentozofosfatni put 3-fosfoglicerinaldehid je međuproizvod glikolize, a kako se glikoliza i pentozofosfatni put odvijaju u citosolu, 3-fosfoglicerinaldehid se lako uključuje u glikolitički put razgradnje glukoze. To je jedna od više metaboličkih veza pentozofosfatnog puta i glikolize (fruktozo-6fosfat je takođe međuproizvod glikolize). Iz Šeme 5. pentozofosfatnog puta se vidi raznovrsnost ovog puta, jer se dobijaju trioze, tetroze, pentoze, heksoze i jedna heptoza. To je značajno, jer u nekim tkivima, npr. mišićima, uprkos slabom intenzitetu odvijanja pentozofosfatnog puta, obezbjeđuje se dovoljna količina ribozo-5-fosfata za sintezu purinskih nukleotida. Što se tiče regulacije pentozofosfatnog puta, ne postoji neki posebni regulatorni mehanizam. Smatra se da sinteza glavnih enzima, ovog metaboličkog puta, zavisi od NADP/NADPH količnika i da njegova promjena nastala sniženjem lokalnog nivoa NADPH pokreće sintezu ključnih enzima heksozo-monofosfatnog šanta.

GLUKONEOGENEZA Glukoneogeneza je proces sinteze glukoze iz neugljikohidratnih komponenti. To su prije svega laktat i piruvat, nastali razgradnjom glukoze glikolizom, zatim glicerol i glukogene aminokiseline. Glukoneogeneza nije obrnuti tok glikolize. Glikoliza nije reverzibilan proces, zbog odgovarajućih barijera, koje onemogućavaju prostu reverziju, od piruvata, ili laktata, do glukoze. Na Slici 22. to je predstavljeno: Tri reakcije glikolize su ireverzibilne: završna reakcija, u kojoj se od fosfoenolpiruvata dobija piruvat, zatim reakcija u kojoj od fruktozo-6-fosfata nastaje fruktozo-1,6-difosfat i konačno ona reakcija, u kojoj se glukoza fosforiliše u glikozo-6-fosfat. U termodinamskom smislu to su tri izrazito egzergonične reakcije, što smo konstatovali kod proučavanja glikolize. Sve tri barijere su premostive, uz prisustvo odgovarajućih enzima. Konverzija piruvata u fosfoenolpiruvat Pošto je fosfoenolpiruvat visokoenergetski organofosfat, ne postoji mogućnost direktne konverzije u fosfoenolpiruvat. Za to je potreban složen metabolički tok. Prvo, piruvat prelazi u mitohondrije hepatocita, ili tubulocita, a zatim slijedi karboksilacija (uvođenje COOH grupe u molekul piruvata). Reakciju katalizuje enzim piruvat karboksilaza, koja sadrži biotin kao koenzim. Uz prisustvo Mg2+ i acetil-CoA, uz utrošak ATP i samog CO2, iz piruvata nastaje oksalacetat. Pošto oksalacetat ne prolazi kroz unutrašnju membranu mitohondrija, mora da se redukuje u malat, djelovanjem malat dehidrogenaze. Malat se izbacuje iz mitohondrija na principu njegove jonske zamjene sa citratom. U citosolu, dejstvom malat dehidrogenaze, malat se oksidiše u oksalacetat. Da bi iz oksalacetata nastao fosfoenolpiruvat potreban je molekul guanozintrifosfata (GTP). Reakciju katalizuje fosfoenolpiruvat karboksilaza. Iz je uočljivo da je "cijena" konverzije piruvata u fosfoenolpiruvat jedna molekula ATP i jedna molekula GTP.

Putevi glukoneogeneze i glikolize

Nastanak i defosforilacija fruktozo-1,6-difosfata Nastankom fosfoenolpiruvata iz piruvata, stvoreni su uslovi za pokretanje reverzibilnog toka lanca enzimskih reakcija glikolize. Za sintezu fruktozo-1,6-difosfata potrebna su polazna dva molekula fosfoenolpiruvata, što znač i da se sve reakcije do ovog koraka moraju da dupliraju, uključ ujuć i i piruvat. Enzim 1,6-difosfataza hidrolitički uklanja ortofosfat sa C1 atoma fruktozo-1,6difosfata, pa se na taj način dobija fruktozo-6-fosfat. Reakcija je egzergonična (ΔGo'= - 16,7 kJ/mol) i lako se odvija. Fruktozo-6-fosfat se izomerizuje u glukozo-6-fosfat, pod uticajem fosfohekso izomeraze, enzima glikolize i nastaje glukozo-6-fosfat. Defosforilacija glukozo-6-fosfata u glukozu Ovo je posljednja, od ukupno tri, energetske prepreke u procesu sinteze glikoze glukoneogenezom. To se postiže dejstvom enzima glukozo-6-fosfataze, koga ima u velikoj količini u jetri i bubrezima. Hidrolitičkom reakcijom defosforiliše se supstrat glukozo-6fosfat, a nastala glukoza napušta ćelijsku sredinu hepatocita, ili tubulocita i odlazi u cirkulaciju. Pomenuti enzim se ne nalazi u masnom tkivu i skeletnim mišićima, tako da navedena tkiva ne utiču na regulisanje glikemije. Većina međuproizvoda ciklusa trikarbonskih kiselina može da posluži kao polazni materijal glukoneogeneze. Svi ti međuproizvodi razlažu se ciklusom trikarbonskih kiselina do oksalacetata, a ovaj uključuje u glukoneogenezu. Pojedine aminokiseline transaminacijom daju bezazotni ostatak tipa piruvata, dok druge daju međuproizvode ciklusa trikarbonskih kiselina tipa α-ketoglutarata. Sve su to supstrati za glukoneogenezu. Energetski efekti glukoneogeneze Zbirna reakcija konverzije piruvata u glukozu prikazana je jednačinom: 2 piruvata + 4 ATP + 2 GTP + 2 NADH + 2 H+ + 6 H2O ↓ Glukoza + 4 ADP + 2 GDP + 6 Pi + 2 NAD+ U energetskom smislu, čini se da je glukoneogeneza rasipnički proces, pošto se troše četiri molekule visokoenergetskih fosfata. Međutim, u organizmu postoje određene situacije, kao što je prijeteća hipoglikemija, ili kada nastaje prekomjerno oslobađanje laktata, kada glukoza mora da se sintetiše, čak i po cijenu energetskog deficita. GLIKOGENEZA Proces sinteze glikogena označava se kao glikogeneza. Glikogen je rasprostranjen u svim ćelijama, ali se deponuje samo u jetri i mišićima. Glikogen mišića ima isključivo energatsku ulogu, dok glikogen jetre održava glikemiju u okviru fizioloških vrijednosti.

Glikogeneza započinje fosforilacijom glukoze u glukozo-6-fosfat, u jetri djelovanjem glukokinaze, a u mišićima djelovanjem heksokinaze. U oba slučaja neophodan je ATP i Mg2+. U narednoj reakciji glukozo-6-fosfat se prevodi u glukozo-1-fosfat, dejstvom enzima fosfoglukomutaze. Glukozo-1-fosfat i uridin-trifosfat (UTP) pod uticajem UDPG-pirofosforilaze reaguju i nastaje aktivni nukleotid uridin-difosfat-glukoza (UDPG).

2CH2OH CH OH CH2OPO3 2 ADP O H ATP oH O H H H H 2+ 2+ Mg Mg H H H OH H OH H fosfoglukomutaza OH H heksokinaza 2OH HO OH OPO3 HO HO H OH H H OH OH -D-glukoza -D-glukozo-6-fosfat -D-glukozo-1-fosfat UTP UDP-glukozo pirofosforilaza 2 Mg +

PPi O

H

CH O H 2 O H H H OH N O- OI I O-P-O-P - O - CH 2O I- I OH O O H H H H OH OH

NH

O

HO H

uridindifosfat-glukoza

Sinteza UDP-glukoze Hidroliza nastalog neorganskog pirofosfata pomjera reakciju na desnu stranu. UDPglukoza je direktni izvor glikozil ostataka sa aktivisanom OH grupom na C1 atomu. Enzim glikogen sintaza (glukozil transferaza) prenosi aktivisani glukozil ostatak na neredukujući kraj glikogena i katalizuje nastanak α-1,4-glikozidne veze, između C1 aktivnog glukozil ostatka i C4 terminalne glukoze lanca glikogena. Tako se molekul glikogena produžio za jedan molekul glukoze. Ponavljajućim djelovanjem enzima glikogen sintaze uvećava se osnovni lanac glikogena do dužine od najmanje 11 glukozil ostataka Tada su stvoreni uslovi za dejstvo enzima grananja glikogena, koji prenosi najmanje 6 glukozil ostataka i formira račvu lanca glikogena sa α-1,6glikozidnom vezom. Zahvaljujući dejstvu ovog enzima molekul glikogena je izrazito račvast. Smatra se da je za početnu biosintezu glikogena potreban početni segment glikogena, koji je glikoproteinske prirode, a prvi glukozil ostatak vezuje se za polipeptidni lanac, sa čijim hidroksi aminokiselinama uspostavlja O-glikozidnu vezu. Naredni ostatak glukoze nadovezuje se na prethodni stvaranjem α-1,4-glikozidne veze. Početni segment glikogena ostaje sačuvan i u uslovima gladovanja, kada preovladava glikogenoliza.

Regulacija glikogeneze U mišićima postoje dva oblika glikogen sintaze: fosforilisani, ili neaktivni b oblik i defosforilisani, tj. aktivni oblik a. Ova dva oblika mogu da prelaze jedan u drugi. U fiziološkim uslovima sinteza glikogena zavisi od glikogen sintaze a, koja nastaje iz glikogen sintaze b djelovanjem dva enzima: protein fosfataze i protein fosfataze-1. Obrnutu reakciju katalizuje drugi enzim, a to je jedan od niza kinaznog dejstva. Protein fosfataza je pod direktnim dejstvom insulina, dok protein fosfataza-1 zavisi od lokalnog nivoa cAMP, a ne zavisi od insulina. Adrenalin pojačava aktivnost enzima adenil ciklaze i time povećava nivo cAMP, što u kaskadi reakcija inhibiše aktivnu protein fosforilazu-1. Regulacija glikogeneze u jetri je složenija. I u jetri postoji aktivna (a) i neaktivna (b) glikogen sintaza. Glikogen sintaza a fosforilisanjem postaje, dejstvom cAMP zavisne protein kinaze, neaktivni enzim (b). Inaktivacija glikogen sintaze jetre odvija se i dejstvom kalmodulin zavisne protein kinaze. Najmoćniji i najvažniji aktivator glikogeneze u jetri je insulin, koji pokreće aktivnost regulatornih enzima, tipa protein fosfataza i fosfodiesteraza. Protein fosfataza defosforiliše i time aktiviše glikogen sintazu, a sa njom počinje glikogeneza. Insulin, aktivacijom fosfodiesteraze, razlaže cAMP u AMP i time onemogućava pokretanje glikogenolize. Suprotno dejstvo insulinu imaju: kateholamini, vazopresin, oksitocin, angiotenzin II, glukagon i tiroksin.

FOTOSINTEZA Fotosinteza je proces u kome se apsorbovana svjetlosna energija transformiše u korisnu hemijsku energiju. To je jedinstven proces u živom svijetu, a odvija se u zelenim biljkama. 6 CO2 + 12 H2O C6H12O6 + 6 O2 +6 H2O

Pored klasičnog fotosintetskog procesa koji se odigrava u hloroplasima zelenih biljaka, postoje i drugi tipovi fotosinteze. Molekul O2 vodi porijeklo iz vode, a ne iz ugljendioksida. Fotosinteza se odvija u dva dijela:  Reakcije koje se odvijaju u svjetlosti (tzv. svijetle reakcije)  Reakcije koje se odvijaju u tami (tzv. tamne reakcije) Fotosintetski proces počinje transformacijom svjetlosne energije u korisnu hemijsku energiju. U ovoj fazi nastaje ATP i NADPH+H+ . Ova jedinjenja se koriste za proces redukcije ugljendioksida i njegovo prevodjenje u ugljene hidrate. U hloroplastima zelenih biljaka nalaze se različiti pigmenti i enzimski sistemi, koji omogućavaju proces fotosinteze. Svi ovi pigmenti grupisani su u fotosistem I i fotosistem II u zavisnosti od vrijednosti talasne dužine vidljivog dijela spektra koga apsorbuju. Pored hlorofila a, hlorofila b i karotenoida, u fotosistem I i II ulaze i citohromi i plastohinoni. Svi hlorofili i ostali pigmenti posjeduju sposobnost apsorpcije svjetlosne energije, zahvaljujući velikom broju konjugovanih veza u strukturi molekula. Hlorofili u centru tetrapirolnog prstena sadrže Mg2+ jon. Usvajanjem kvanta svjetlosne energije molekul hlorofila prelazi u ekscitirano stanje. Sa hlorofila elektroni prelaze na odgovarajući elektron-transportni sistem (ETS), a nakon

prelaska kružnog puta elektroni se ponovo vraćaju na hlorofil. Svaki par ekvivalenta elektrona, kada napusti molekul hlorofila, oslobađa veliku količinu korisne hemijske energije (ATP i NADPH+H+). Ovaj način obrazovanja ATP-a naziva se fotosintetska fosforilacija. Polazeći od činjenice da svaki par elektrona ne završi svoj ciklični put, tj. vrati se na hlorofil, već preko feredoksina učestvuje u redukciji NADP+-a. U ovom slučaju regeneracija hlorofila vrši se na račun elektrona koji dolaze od nekog spoljašnjeg donora. Proces se odvija u subćelijskim organelama hloroplastima, koji su okruženi dvoslojnom membranom. Unutrašnji dio hloroplasta ispunjen je sistemom membrana koje se označavaju kao tilakoidi. Svi pigmenti koji učestvuju u fotosintetskom procesu nalaze se unutar ovog membranskog sistema, gdje se i odigrava svjetlosna faza fotosinteze. Unutrašnjost hloroplasta van tilakoida naziva se stroma.

tilakoidi

Ddoslojna membrana

stroma

hloroplast
Tamni dio fotosinteze, tj. redukcija ugljendioksida odvija se u stroma lamelama. Većina tilakoida su vrlo blisko povezani, tako da ostavljaju utisak nagomilanih spiralnih membrana, koje se nazivaju grane lamele. Membrane koje su slobodne u prostoru i nisu blisko povezane nazivaju se stroma lamele. Reakcije fotosinteze u tami obuhvataju reakcije u kojima se uz upotrebu proizvoda primarnih (svjetlosnih) reakcija fotosinteze ATP-a i NADPH redukuje CO2 i stvaraju ugljeni hidrati. Calvin je 1961. godine za predloženi redoslijed reakcija u tamnoj fazi fotosinteze dobio Nobelovu nagradu. Calvinov ciklus može da se podijeli u tri faze: 1. karboksilacija akceptora CO2, ribuloza-1,5-difosfata i stvaranje dvije molekule 3-fosfoglicerata, prvog stabilnog međuproizvoda 2. redukcija tokom koje nastaje gliceraldehid-3-fosfat 3. regeneracija akceptora CO2, ribuloza-1,5-difosfata.

Zbirna jednačina sekundarnih reakcija fotosinteze: 6 CO2 +12 H2O +12 NADPH + 18 ATP

C6H12O6 + 12 NADP+ + 6 H+ + 18 ADP + 18 PI U prvoj fazi Calvinovog ciklusa karboksilaciji ribulozo-1,5-difosfata nastaje 3fosfoglicerat:
H2C O H H C C C H2C OH OH OPO32-O

OPO32-

O C C OH OPO3
2-

H

H2C

Ribuloza-1,5-difosfat

3-fosfoglicerat

Zatim slijedi transformacija 3-fosfoglicerata:

O C H C H2C

O OH

Fosfoglicerat kinaza
ATP ADP
O C H
2

OPO3 OH

gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza 2
NADPH NADP+
H
2

CHO C H2C OH OPO3
2

C H2C

OPO3

OPO3

Pi

3fosfoglicerat

1,3-difosfoglicerat

gliceraldehid3-fosfat

Neprekidna fiksacija CO2 nužno zahtijeva da se akceptor CO2 stalno regeneriše. Da bi se spriječilo iscrpljivanje međujedinjenja ciklusa, pregrupisanjem ugljenika iz 10 molekula triozo-fosfata stvara se 6 molekula ribuloza-1,5-difosfata.

MASNE KISELINE U prirodnim mastima nalaze se samo masne kiseline sa parnim brojem ugljenikovih atoma, što je razumljivo pošto se sinteza masnih kiselina in vivo odvija ugradnjom po dvije Cjedinice, koje potiču od acetil-CoA. Masne kiseline koje se najčešće susreću u prirodnim mastima date su niže.
16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4   3 2  COOH 1

heksadekanska kiselina (palmitinska kiselina)

18 COOH 1 oktadekanska kiselina (stearinska kiselina)

10

9

COOH 1

oleinska kiselina 18:1

cis-9-oktadecenska kiselina (oleinska kiselina)

13

12

10

9

COOH 1

linolna kiselina 18:2

cis-9-cis-12-oktadecenska kiselina (linolna kiaselina)

18 16 15 13 12

10

9

COOH linolenska kiselina 18:3 1

cis-9-cis-12-cis-15- oktadecenska kiselina (linolenska kiselina)

15

14

12

11

9

8

6

5

COOH 1

arahidonska kiselina 20:4

cis-5-cis-8-cis-11-cis-14-ajkozanska kiselina (arahidonska kiselina)

Formule masnih kiselina su napisane tako, da krajnja CH3 grupa nije naznačena, da nisu napisane metilenske grupe (CH2), a iste se nalaze na svim prevojnim tačkama. Obilježavanje ugljenikovih atoma, arapskim brojevima, vrši se od ugljenikovog atoma karboksilne grupe. Ako se ugljenikovi atomi obilježavaju grčkim slovima ugljenikov atom karboksilne grupe se ne obilježava, već obilježavanje počinje od susjednog ugljenikovog atoma, u odnosu na ugljenikov atom karboksilne grupe. Sasvim desno data su trivijalna imena sa brojevima, gdje prvi broj označava broj ugljenikovih atoma, dok drugi broj označava broj dvostrukih veza. Za organizam čovjeka od velike su važnosti masne kiseline sa više dvostrukih veza, kao i masne kiseline račvastog niza, jer ne može da ih sintetiše, pa moraju da

se unose hranom. Neunošenje linolenske i arahidonske kiseline (esencijalnih masnih kiselina) uzrokuje zastoj u rastu, promjene na koži, a u krajnjem slučaju i smrt.

KATABOLIZAM MASNIH KISELINA Osnovni put za metabolizam masnih kiselina, koje nastaju kao proizvod varenja masti, je β-oksidacija, koja se odvija u mitohondrijama. Krajnji proizvod katabolizma masnih kiselina sa parnim brojem C atoma je odgovarajući broj acetil-CoA, koji se dalje razgrađuju u ciklusu limunske kiseline. Dugolančane masne kiseline se oksidišu do ugljendioksida i vode skoro u svim tkivima kičmenjaka, osim u mozgu. β-OKSIDACIJA MASNIH KISELINA Prije uključenja u proces oksidacije, masne kiseline moraju da se povežu sa transportnim proteinom, Z-proteinom, što im daje hidrosolubilnost. Međutim, pošto su masne kiseline, zbog dugačkog ugljovodoničnog niza, nereaktivne, inertne, neophodno je da se aktivišu. To se postiže prevođenjem u tioestre, visokoenergetska i reaktivna jedinjenja. Tioalkoholna grupa potiče od cisteamina, koji je sastavna komponenta koenzima-A (CoA). Masna kiselina se prvo aktiviše ATP-om, a nastali intermedijat prenosi se na CoA i pri tome formira tioestar. Aktivacija je pokazana na primjeru palmitinske kiseline. Reakciju aktivacije katalizuje jedna od tri acil-CoA-sintetaze, koje pokazuju specifičnost prema dužini lanca masne kiseline. Detektovane su acil~SCoA-sintetaze za aktivaciju masnih kiselina sa kratkim nizom, sa nizom srednje dužine (4-12 C atoma) i one koje aktivišu više masne kiseline (12-24 C atoma). Acil-CoA-sintetaze su vezane za endoplazmatski retikulum, ili spoljašnju membranu mitohondrija, a proces aktivacije se odvija u citoplazmi ćelija. Nastali acil-CoA je visokoenergetsko jedinjenje, njegova hidroliza do slobodne masne kiseline i CoA ima ΔG'0 ≈ 31kJ/mol. Aktivacija masnih kiselina unutar mitohondrija fiziološki je prisutna u neznatnoj mjeri, a zahtijeva prisustvo guanin nukleotida. Mitohondrijske membrane su nepropustljive za acil-CoA, pa se ovo jedinjenje prevodi u acilkarnitin i kao takav dospijeva u mitohondrije. U mitohondrijama se acilkarnitin ponovo prevodi u acil-CoA.
O  + C~ SCoA + HO-CH-CH - N (CH 3) 3 2  H C-COO 2 Karnitin

-

Palmitoil-CoA

O  + C ~ O-CH-CH - N (CH3 )3 + H SCoA 2  H C-COO 2

-

Palmitoilkarnitin

Aktivacija palmitinske kiseline

Kao što se iz formule vidi, karnitin je β-hidroksi-γ-trimetilamonijum butirat, sa osobinama bipolarnog jona. Takve hemijske karakteristike omogućavaju karnitinu da lagano klizi između lipidnih struktura membrane, omogućavajući transport acil ostataka. U navedenom transportnom sistemu učestvuju dva enzima: karnitin-aciltransferaza I (CAT I), enzim spoljašnje površine unutrašnje membrane mitohondrija i karnitinaciltransferaza II (CAT II), koja acetilni ostatak prenosi na matriksni CoA.

O citosol H3 C-(CH ) -C ~ SCoA 214 palmitoilkoenzim A Karnitin karnitin-palmitoil transferaza O HSCoA H C-(CH ) -C- karnitin 2 3 14

matriks mitohondrija Karnitin karnitin-palmitoil transferaza O H C-(CH2 ) - C - karnitin 3 14 HSCoA

O H C-(CH 2 ) -C ~ SCoA 3 14

karnitinski transporter

Transport palmitoil ~SCoA kroz unutrašnju membranu mitohondrija Kratkolančane masne kiseline direktno prolaze kroz unutrašnju membranu mitohondrija, tj. ne zavise od karnitina.

R=H(CH -CH )n 2 2 O R H 3 C   C H 2 H C ~ CoA 1 H

FAD

FADH2 H 3 C  O  C 2 H C ~ CoA 1

1

R

H2O O R C ~ SCoA 6 O 7 R 5 8 9 O R C ~ SCoA 3 4 O CH -C ~SCoA 2 3 1 R 3 C  H 3 O  C 2 O C ~ CoA 1 H + NAD HO 3 C  H  C 2 C ~ CoA 1 H 2

H

+ NADH+H

HSCoA

β-oksidacija masnih kiselina u matriksu mitohondrija U prvoj reakciji β-oksidacije masnih kiselina vrši se dehidrogenizacija (odstranjenje vodonikovih atoma sa 2 i 3 C-atoma), pri čemu nastaje α,β-nezasićeni acil-CoA. Nezasićena masna kiselina je trans izomer (trans-Δ2-enoil-CoA). Reakciju katalizuje enzim acil-CoA dehidrogenaza, koja za koenzim ima FAD. Na nezasićeni derivat masne kiseline adira se molekul vode, pri čemu nastaje βhidroksi-acil-CoA. Adiciju vode katalizuje enzim enoil-CoA-hidrataza. Sekundarna alkoholna grupa se veoma lako osidiše, pri čemu nastaje β-keto-acil-CoA. Reakciju katalizuje enzim βhidroksi-acil-CoA dehidrogenaza, čiji je koenzim NAD+. Pod uticajem još jednog molekula HSCoA dolazi do ketonskog raspadanja, pri čemu nastaju acetil-CoA i acil-CoA, skraćen za dva C-atoma u odnosu na početni. Ketonsko raspadanje, u ovom slučaju, poznato je kao tiolitičko cijepanje, katalizuje enzim β-keto-acilCoA transferaza (ili samo tiolaza). Proces se dalje ponavlja, što je u šemi naznačeno brojevima 5,6,7,8 i 9, sve dok se molekul masne kiseline ne razgradi u potpunosti do n molekula acetil-CoA. Redukovani koenzimi, nastali u toku β-oksidacije, reoksidišu se u respiratornom lancu mitohondrija. ENERGETSKI BILANS β-OKSIDACIJE MASNIH KISELINA Pri β-oksidaciji masnih kiselina nastaje n molekula acetil~ScoA, gde je n=polovina od broja C-atoma u molekulu masne kiseline, ako je molekul masne kiseline izgrađen od parnog broja ugljenikovih atoma; ako pak molekul masne kiseline ima neparan broj ugljenikovih

atoma, onda nastaje i molekul propionil ~SCoA. Tako, pri β-oksidaciji palmitinske kiseline, koja sadrži 16 C atoma, nastaje 8 molekula acetil~SCoA. Pri daljoj oksidaciji svakog molekula acetil-CoA, u ciklusu limunske kiseline, nastaju 3 molekula NADH++H+, 1 molekul FADH2 i jedan molekul GTP. Pri potpunoj β-oksidaciji molekula palmitinske kiseline proces se ponovi 7 puta, pri čemu nastaje 7 molekula NADH++H+ i 7 molekula FADH2. Na tabeli 5 pokazan je ukupni broj nastalih NADH+H+, FADH2 i ATP u potpunoj oksidaciji palmitoil~SCoA. Ukupni zbir od 108 molekula ATP treba da se umanji za 2 ATP, koliko se utroši za aktivaciju palmitinske kiseline, pa se ukupno dobija 106 ATP. Pod standardnim uslovima, 106 X 30,5 kJ/mol = 3 230 kJ/mol, što je oko 33% od teoretskog maksimuma, koji iznosi 9 800 kJ/mol. Međutim, ima saznanja da se u intracelularnim uslovima navedeni procenat kreće i preko 60%. Energetski efekat oksidacije molekule palmitoil-CoA do CO2 i H2O Enzim koji katalizuje reakciju Acil-CoA dehidrogenaza β-hidroksiacetil-CoA dehidrogenaza Izocitrat dehidrogenaza α-ketoglutarat dehidrogenaza Sukcinil-Co A sintetaza Sukcinat dehidrogenaza Malat dehidrogenaza Ukupno Broj NADH+H+, ili FADH2 7 FADH2 7 NADH+H+ 8 NADH+H+ 8 NADH+H+ 8 FADH2 8 NADH+H+ Broj formiranih ATP* 10,5 17,5 20 20 8# 12 20 108

* Oksidativna fosforilacija u mitohondrijama daje 1,5 ATP po oksidisanom FADH2 i 2,5 ATP po oksidisanom NADH+H+ . # Direktno iz GTP-a na nivou supstrata.

SPOREDNI PUTEVI OKSIDACIJE MASNIH KISELINA Pored β-oksidacije masnih kiselina, kao kvantitativno najzastupljenijeg kataboličkog puta masnih kiselina, u organizmu se u izvjesnoj mjeri odvija i proces α- i ω-oksidacije. U toku α-oksidacije uklanja se po jedan C atom sa karboksi terminalnog kraja molekula masne kiseline. To je značajan metabolički put cerebrozida u mozgu. α-oksidacija se odvija u endoplazmatskom retikulumu i mitohondrijama, ne zahtijeva aktivaciju masne kiseline, a u energetskom smislu proces je beznačajan. Ovim metaboličkim putem razlaže se fitanska kiselina, metabolički proizvod fitola, koja se pored toga nalazi u mastima mlijeka i životinjskoj masti. Srednje i dugolančane masne kiseline mogu da se oksidišu i putem ω-oksidacije. Proces se odvija u endoplazmatskom retikulumu, a omogućava oksidaciju metil terminalnog kraja masne kiseline, odnosno oksidaciju suprotnog kraja u odnosu na karboksilnu grupu. Proizvod reakcije je α,ω-dikarbonska kiselina, koja može da se podvrgne β-oksidaciji s bilo kojeg kraja molekule.

BIOSINTEZA MASNIH KISELINA Sinteza masnih kiselina odvija se u jetri, masnom tkivu, mliječnoj žlijezdi za vrijeme laktacije, ali i u plućima, bubrezima i mozgu. Svi potrebni enzimi za sintezu masnih kiselina, iz prekursora acetil-CoA do molekula palmitinske kiseline, nalaze se u citosolu ćelije. Ukoliko postoji potreba za biosintezom masnih kiselina sa većim brojem C atoma od 16, onda se produžavanje (elongacija) masnih kiselina odvija u mikrozomima i mitohondrijama. Kada su energetske potrebe ćelije male, oksidacija acetil-CoA i oksidativna fosforilacija su minimalne, pa se mitohondrijalni acetil-CoA deponuje u vidu masti. Prekursor svih C atoma u masnoj kiselini je acetil-CoA. Postoje tri izvora acetil-CoA: 1. Razgradnjom aminokiselina nastaje citosolni acetil-CoA. 2. Oksidacija masnih kiselina produkuje acetil-CoA. 3. Piruvat nastao glikolizom u citosolu prelazi u mitohondrije, gdje se djelovanjem piruvat dehidrogenaze prevodi u acetil-CoA. Acetil-CoA nastao degradacijom aminokiselina je nedovoljan za biosintezu masnih kiselina, a acetil-CoA nastao iz piruvata i oksidacije masnih kiselina ne može da prođe kroz mitohondrijalnu membranu i da se direktno uključi u biosintezu masnih kiselina. Zato se acetil-CoA, u mitohondrijama, vezuje sa oksalacetatom, formirajući citrat, koji se transportuje iz mitohondrijalnog matriksa u citosol. Djelovanjem ATP-citratne liaze, iz citrata u citosolu, ponovo nastaje acetil-CoA. Izdvojeni oksalacetat, pri ovoj reakciji, prevodi se do malata, ili do piruvata, a ovi nesmetano odlaze u mitohondrijalni matriks. Molekule NADPH, koje su neophodne za biosintezu masnih kiselina, potiču iz pentozofosfatnog puta, ili iz reakcije prevođenja malata u piruvat, djelovanjem jabučnog enzima (malic enzyme). Redukcioni ekvivalenti (elektroni) nastali u glikolizi u obliku NADH mogu da se transformišu u NADPH kombinovanim djelovanjem malatne dehidrogenaze i malic enzym-a: Oksalacetat + NADH + H+ → malat + NAD+ Malat + NADP+ → piruvat + CO2 + NADPH + H+ Postavlja se pitanje: koliko od 14 NADPH potrebnih za biosintezu palmitata može da nastane na prethodno navedeni način? Odgovor zavisi od statusa malata. Svaki molekul citrata preveden u citosol produkuje jedan acetil-CoA i jedan molekul malata. Iz svakog oksidisanog malata nastaje jedan NADPH, pri dekarboksilaciji u piruvat. Dakle, kada se malat oksidiše nastaje po jedan NADPH za svaki acetil-CoA. Prevođenje 8 molekula acetil-CoA u jedan palmitat tada je udružen sa produkcijom 8 NADPH. Pošto je potrebno još 6 NADPH oni će da se koriste iz pentozofosfatnog puta. Za biosintezu masnih kiselina potrebno je da se, pored acetil-CoA, obezbijedi i malonilCoA. Acetil-CoA se karboksiliše u malonil-CoA, djelovanjem enzima acetil-CoA karboksilaze, uz utrošak molekule ATP-a i bikarbonata (izvor bikarbonata je CO2) i prisustvo Mg2+ jona. Ovom reakcijom karboksilacije aktiviše se C atom iz metil grupe acetil ostatka, što kasnije služi za vezivanje još jednog acil ostatka i dobijanje međuproizvoda sa 4 C atoma (butiril ostatka), a kasnije i ostalih međuproizvoda tokom sinteze palmitinske kiseline. Koenzim enzima acetil-CoA karboksilaze je biotin, koji se vezuje za proteinski dio enzima i predstavlja proteinski nosač karboksilne grupe. Nastajanje karboksi-biotin enzima je

prolazno. Pošto se enzim acetil-CoA karboksilaza sastoji od 4 podjedinice, prva podjedinica pokazuje aktivnost biotin karboksilaze i katalizuje prolaznu karboksilaciju druge podjedinicebiotin proteinskog nosača u karboksi-biotin. Treća podjedinica ispoljava aktivnost transkarboksilaze (prenos karboksilne grupe na supstrat), dok četvrta podjedinica služi za vezivanje citrata, polimerizaciju i pokretanje aktivnosti ovog složenog enzima. Citrati djeluju aktivirajuće na enzim acetil-CoA karboksilazu, dok acil-CoA masnih kiselina sa većim brojem C atoma u molekulu djeluju inhibitorno. Sinteza palmitinske kiseline se ostvaruje djelovanjem sintaznog sistema palmitinske kiseline. To je multienzimski kompleks koga sačinjava 6 karakterističnih enzima i jedan proteinski nosač acil ostatka (ACP-acyl carrier protein) u svakom od dva identična polipeptidna lanca. Na svakom polipeptidnom lancu razlikuje se "glava" i "rep". Dva peptidna lanca su postavljena antiparalelno, tako da "glava" jednog lanca sa "repom" drugog lanca čini jednu funkcionalnu jedinicu za sintezu palmitinske kiseline. Proizlazi da jedan ovakav makromolekul sintaznog sistema palmitinske kiseline raspolaže sa ukupno dva funkcionalna centra, pa zahvaljujući tome može da istovremeno sintetiše dva molekula palmitinske kiseline. Razdvajanje dva antiparalelna lanca dovodi do gubitka aktivnosti multienzimskog sistema.

Multienzimski kompleks za sintezu palmitinske kiseline Redoslijed enzima u svakom od dva antiparalelno postavljena lanca je: β-ketoacilACP sintaza se nalazi na čelnoj poziciji sa slobodnom –SH (tio) grupom cisteina, potom slijedi acetil-CoA-ACP transacetilaza i malonil-CoA-ACP transacetilaza, sa čime se završava "glava" lanca. U "repnom" dijelu lanca se nalaze: enoil-ACP reduktaza, β-hidroksiacil-ACP dehidrataza, pa β-ketoacil-ACP reduktaza, proteinski nosač acila (ACP) i palmitil tioesteraza.

ACP raspolaže slobodnom –SH grupom 4'-fosfopanteteina. Pošto je pantetein ključni sastojak CoA, proizilazi da završni, "repni" dio lanca ima ulogu upravo navedenog koenzima (CoA-SH). Sinteza palmitinske kiseline počinje reagovanjem acetil-CoA sa cisteinskom -SH grupom β-ketoacil-ACP sintaze. Reakciju katalizuje acetil-CoA-ACP transacilaza. MalonilCoA reaguje sa susjednom –SH grupom panteteina proteinskog nosača ACP. Ovu reakciju katalizuje malonil-CoA-ACP transacilaza. U ovoj fazi sinteze palmitinske kiseline acetil i malonil su vezani za –SH grupe cisteina β-ketoacil-ACP sintaze. Dejstvom enzima β-ketoacilACP sintaze (ili enzima kondenzovanja) kondenzuju se acetil i malonil ostaci, uz neminovnu dekarboksilaciju malonil ostatka i gubitka CO2 u aceto-acetil (3-ketoacil ili β-ketoacil) ostatak. Dakle, kondenzovala su se dva acil COO O O ostatka (acetil i malonil) u CH -C ~ SCoA + HSACP 2 CH -C~ SCoA + HSACP 3 malonil ~ SCoA aceto-acetil. Dejstvom βacetil ~SCoA 1 malonil-CoA-ACP 2b ketoacil-ACP sintaze transacilaza HSCoA acetil-SCoA-ACP HSCoA oslobađa se njegova transacilaza O COO O malonil ~ SACP cisteinska-SH grupa, dok CH -C~ SACP 3 CH -C ~ SACP susjedna –SH grupa 2 aetil ~SACP H-S-E panteteina ACP nosi acil 2a ostatak od 4 C atoma -ketoacil ~ ACP sintaza (aceto-acetil ostatak). H-S~ACP O Cisteinska –SH grupa CH- C ~ S-E 3 3 enzima ostaje slobodna sve dok se ne završi lanac CO+ HS~E O O 2 reakcija i dobije butiril CH -C -CH -C~ SACP 2 3 ostatak, kada ista biva acetoacetil ~ SACP prebačena sa –SH grupe NADPH + H+ panteteina na –SH grupu -ketoacil-ACP reduktaza 4 + NADP cisteina. OH O Nastali aceto-acetil CH3- C-CH -C~ SACP 2 ostatak se u slijedećoj H reakciji redukuje u βD-b-hidroksibutirat ~ SACP hidroksi (3-hidroksi) butiril -hidroksiacil-ACP 5 dehidrataza HO ostatak, uz učešće β2 H O ketoacil-ACP reduktaze, CH -C=C-C SACP ~ koja kao koenzim posjeduje 3 H NADPH. Ranije je  -trans-butenoil ~ SACP + objašnjeno odakle se NADPH + H enoil-ACP reduktaza 6 obezbjeđuju ovi molekuli O + NADP redukovanog koenzima.
CH -CH -CH-C SACP ~ 3 2 2 butiril ~ SACP reakcije 2-6 se ponavljaju jo{ 6 puta O CH -(CH ) - C ~ SACP 2 14 3 palmitoil ~ SACP H2 O palmitoil-tioesteraza 7 HSACP CH3 -(CH )14 -COO 2 palmitat

Sema 17. Biosinteza palmitinske kiseline

v

U daljem toku sinteze palmitinske kiseline nastali β-hidroksi (3-hidroksi) butiril ostatak gubi molekul vode pod dejstvom enzima β-hidroksiacil-ACP dehidrataze i nastaje 2,3trans-butenoil-ACP (ili α,β-butenoil-ACP ili nezasićeni krotonil ostatak). U daljnjim ponovljenim ciklusima sinteze nastajaće 2,3 nezasićeni acil ostaci (ili α,β-nezasićeni ostaci). Dalje se krotonil ostatak redukuje dejstvom enoil-ACP reduktaze (koja kao i prethodna reduktaza sadrži redukovani NADPH koenzim) u butiril-ACP. Konačno, nastankom butiril ostatka, prvi krug reakcija sintaznog sistema palmitinske kiseline se završava dejstvom enzima tioesteraze (deacilaze). Tioesteraza u hidrolitičkoj reakciji raskida tioestarsku vezu butiril ostatka i –SH grupe panteteina ACP. Oslobođeni butiril ostatak prelazi na funkcionalno blisku grupu cisteina β-ketoacil sintaze. Nastaje novi tio estar butirila i –SH grupe cisteina β-ketoacil sintaze, reakciju katalizuje enzim transacilaza, dok susjedna –SH grupa panteteina ACP ostaje privremeno slobodna. Za istu –SH grupu vezuje se novi malonil, iz malonil-CoA uz učešće transacilaze. Tako je sinteza palmitinske kiseline ušla u drugi krug. Reakcije se ponavljaju po tačno opisanom redoslijedu, još ukupno 6 puta, tako da se bilans sinteze palmitinske kiseline može da predstavi na slijedeći način:

Pošto se za sintezu 7 molekula malonil-CoA utroši 7 ATP-a to je, naizgled, veliki energetski utrošak, ali nastala palmitinska kiselina predstavlja visokoenergetsko jedinjenje koje će svojim razlaganjem daleko da nadmaši energiju upotrijebljenu tokom sinteze. ELONGACIJA MASNIH KISELINA Sistem sintaze palmitinske kiseline nije u mogućnosti da sintetiše masne kiseline veće dužine od 16 C atoma. Zahvaljujući mehanizmu elongacije omogućava se produženje lanca do potrebne dužine 22 ili 24 C atoma, pa se dobijaju masne kiseline neophodne za sintezu lipida nervnog sistema. Elongacija može da se vrši u endoplazmatskom retikulumu, odnosno mikrozomima i u mitohondrijama. Glavni sistem elongacije je mikrozomalni sistem, a koristi se ne samo za elongaciju palmitil ostataka, već i svih acil ostataka, počev od onih sa 10 C atoma. Mehanizam elongacije u mikrozomima je sličan mehanizmu sinteze masnih kiselina, pri čemu se kao C 2 jedinica koristi malonil-CoA, a kao davalac redukujućih ekvivalenata NADPH. Elongacija masnih kiselina u mitohondrijama se razlikuje od one u mikrozomima. Za elongaciju se koristi acetil-CoA, a kao redukujuće ekvivalente mogu da se koriste NADPH i NADH. U ovoj vrsi elongacije malonil-CoA nema učešće, a polazni materijal za mitohondrijski mehanizam elongacije je palmitinska kiselina. Ovaj sistem elongacije funkcioniše suprotno procesu β-oksidacije, s tom razlikom što je enoil-CoA reduktaza, koja učestvuje u posljednjoj reakciji elongacije NADPH-zavisni enzim, dok je acil-CoA dehidrogenaza (prva reakcija β-oksidacije) FAD zavisna dehidrogenaza. Elongacija masnih kiselina u mitohondrijama se odvija po principu kondenzovanja palmitil i acetil-CoA, obzirom da je završna reakcija β-oksidacije povratna.

Mitohondrijski sistem elongacije može da se primijeni kako na zasićene, tako i na nezasićene masne kiseline. FOSFOLIPIDI Složene masti su heterogena grupa jedinjenja sa raznolikom funkcijom u ljudskom organizmu. Prvenstveno su strukturne komponente i nemaju energetski značaj. U zavisnosti od toga koja molekula sa lipidnom komponentom gradi složene molekule dobijaju se : fosfolipidi, glikolipidi i lipoproteini. GLICEROFOSFOLIPIDI Fosfolipidi su komponente ćelijskih membrana, pa su otuda u značajnoj količini prisutni u humanom organizmu. Fosfolipidi sadrže alkohol, masne kiseline, azotnu bazu i fosfornu kiselinu. Prema vrsti alkohola koji ulazi u sastav (glicerol ili sfingizin), fosfolipidi se dijele na glicerofosfolipide (fosfogliceridi) i sfingofosfolipide.

Struktura glicerofosfolipida Glicerofosfolipidi se nazivaju i monoamino-monofosfatidima, jer je u njima odnos azota i fosfora 1:1. Molekule fosfolipida su amfifilnog karaktera sa nepolarnim alifatičnim "repom" i polarnom "glavom" fosforil-estra. Najjednostavniji glicerofosfolipid je fosfatidna kiselina, gdje je na slobodnoj OH grupi diacilglicerola vezana fosforna kiselina:

O O R1 -nezasi}ena masna kiselina CH O -C - R 2 R-zasi}ena masna kiselina

R - C- O - C-H 1 CH O- P 2

Fosfatidna kiselina Biosinteza fosfatidne kiseline moguća je na dva načina. Glicerol-3-fosfat može da reaguje sa dvije molekule acil-CoA dajući fosfatidnu kiselinu. Međutim, u endoplazmatskom retikulumu hepatocita i drugih ćelija sinteza fosfatidne kiseline počinje esterifikacijom – CH2OH grupe dihidroksiacetonfosfata sa zasićenom masnom kiselinom. Zatim se keto grupa redukuje u sekundarni alkohol, a nastala OH grupa se acilira uz pomoć drugog enzima, koji kao donatore acilnih grupa prvenstveno uzima nezasićene masne kiseline, prethodno aktivisane sa CoA. Na taj način nastaju fosfatidne kiseline koje na C1 imaju zasićen, a na C2 nezasićeni ostatak masne kiseline. Najzastupljeniji glicerofosfatidi su: fosfatidil-holin (lecitin), fosfatidiletanolamin (kefalin) i fosfatidil-serin. U lecitinu je azotna baza holin, u kefalinu etanolamin, a u fosfatidil-serinu aminokiselina serin. Masne kiseline koje se esterifikuju sa glicerolom u položaju C1 najčešće su palmitinska ili stearinska, a u položaju C2 neka nezasićena kiselina. U lecitinu najčešće je to oleinska, linolna ili linolenska, dok su u kefalinu prisutne polinezasićene masne kiseline sa dužim lancima. Značajan je i fosfatidil-inozitol, kiseli glicerofosfolipid koji u C1 pložaju ima stearinsku kiselinu, a u C2 arahidonsku masnu kiselinu. Nalazi se u moždanom tkivu, jetri i mišićima, a značajan je i za regulisanje koncentracije jonizovanog kalcijuma u ćelijama. Fosfatidil-inozitol je davaoc arahidonske kiseline, prekursora za biosintezu prostaglandina, tromboksana i leukotrijena. Najveće količine lecitina se nalaze u membranama mitohondrija, a značajan je i kao prekursor kardiolipina. Kardiolipin je izgrađen od dva molekula fosfatidne kiseline, vezanih kovalentno preko molekule glicerola. Plazmalogeni se razlikuju od ostalih glicerofosfolipida po tome što se umjesto masne kiseline u položaju C1 nalazi aldehid masne kiseline. Od svih fosfolipida u srcu 59% otpada na plazmalogene. Pored najznačajnije uloge glicerofosfolipida, učešća u izgradnji ćelijskih membrana, imaju i druge uloge. Oni su obavezna komponenta lipoproteina krvne plazme, kojima daju hidrofilna svojstva. Neki od glocerofosfolipida aktiviraju enzime, naročito lokalizovane u unutrašnjoj membrani mitohondrija. Kao i žučne kiseline, glicerofosfolipidi imaju ulogu u solubilizaciji holesterola. Nakon unošenja, putem hrane, fosfolipidi se vare u lumenu tankog crijeva pod dejstvom fosfolipaza: A1, A2, B, C i D. Na šemi su pokazana mjesta djelovanja pojedinih fosfolipaza. Fosfolipaza B hidrolizuje sukcesivno obje estarske veze na C1 i na C2.
O O R-C fosfolipaza A O 2 HC 2 CH HC 2 O O C R fosfolipaza A P 1

O CH -CH -N (CH ) 2 2 33

-

fosfolipaza C fosfolipaza D

Mjesta djelovanja fosfolipaza

Djelovanjem fosfolipaza nastaju glicerol, masne kiseline, fosforna kiselina i azotna baza, koji se zatim transportuju u enterocite. Fosfolipaza A1 hidrolizuje acil ostatak u α položaju glicerola i nastaje lizolecitin, koga ima u zmijskim otrovima, a ispoljava jako hemolitičko dejstvo.

AMINOKISELINE Aminokiseline su supstituisane organske kiseline, gdje je u radikalu organskih kiselina vodonikov atom zamijenjen (supstituisan) amino grupom. Kada se, u biohemiji, govori o aminokiselinama onda se misli na α-aminokiseline, a vrlo rijetke su β-aminokiseline, kao što je β-alanin (koga ima u koenzimu A, dipeptidima karnozinu i anserinu). Sve prirodne aminokiseline pripadaju L-seriji.
COOH HN 2 C R H H COOH C R NH 2

Op{taformula za L-aminokiselinu Op{ta formula za D-aminokiselinu

Aminokiseline su veoma značajne, predstavljaju osnovnu građu za više vrsta biohemijski važnih jedinjenja, kao što su peptidi, proteini, enzimi i neki hormoni. Smatra se da u struktururaynih tipovaprirodnih proteinaulayi oko 26 aminokiselina. Aminokiseline su, radi lakšeg izučavanja, podijeljene u četiri grupe: 1. Aminokiseline sa nepolarnim radikalom 2. Aminokiseline sa polarnim grupama u radikalu 3. Kisele aminokiseline i 4. Bazne (heksuronske) aminokiseline Aminokiseline sa nepolarnim radikalom U ovu grupu aminokiselina spadaju:

COOH H2N C H H H2N

COOH COOH C CH3 H H2N C CH CH CH 3 3 Valin (Val) H

Glicin (Glycin-Gly)

Alanin (Ala)

COOH COOH HN 2 COOH CH CH 2 CH CH 3 HN 2 HC 3 CH CH CH CH 2 3 HN 2 CH CH2 COOH N H

HC 3

Leucin (Leu)

Izoleucin (Ile)

Fenilalanin (Phe)

Prolin (Pro)

Aminokiseline sa polarnim grupama u radikalu
COOH COOH H2 N C H H2N C H H2N COOH C H CH 3 S H2 N

COOH C CH2 CH 2 H

CHOH CH 3 Treonin (Thr)

CH OH 2 Serin (Ser)

CH2SH Cistein (Cys)

Metionin (Met)

COOH HN 2 CH CH 2 HN 2

COOH CH COOH CH2 HN 2 COOH CH CH2 OH CONH2 HN 2 CH CH2 CH 2 CONH 2

N H

Triptofan (Trp)

Tirozin (Tyr)

Asparagin (Asp)

Glutamin (Glu)

Kisele aminokiseline
COOH COOH HN 2 CH CH2 COOH HN 2 CH CH2 CH2 COOH

Asparaginska kiselina Glutaminska kiselina (Asp) (Glu)

Bazne (heksuronske) aminokiseline Naziv heksuronske aminokiseline potiče otuda što sve imaju po šest ugljenikovih atoma.

COOH COOH COOH HN 2 CH (CH ) 2 3 CH NH 2 2 HN 2 CH (CH ) 2 3 NH C NH2 N NH N H HN 2 CH CH2

Lizin (Lys)

Arginin (Arg)

Histidin (His)

Kada su u pitanju prirodne aminokiseline onda se najčešće koriste trivijalna imena. Hemijska graĎa Iz navedenih formula aminokiselina jasno se uočava da one sadrže najmanje dvije funkcionalne grupe: karboksilnu, koja je nosilac kiselih odlika i dodatkom baza odupire se promjeni pH sredine (disocijacijom) i amino grupu, koja je nosilac baznih odlika i dodatkom kiselina odupire se promjeni pH sredine (protonizacijom azota). Prema tome, aminokiseline se u kiseloj sredini ponašaju kao baze, dok se u baznoj sredini ponašaju kao kiseline, a za takva jedinjenja kažemo da su amfoterna.

COOH + HN 3 C R H -H

+

COO + HN 3 C R H -H

+ HN 2

COO C R H

+ +H

+ +H

I

II

III

Formula (II) označava da je, pri nekoj pH vrijednosti, molekul aminokiseline dvostruko naelektrisan, da je dipolaran, i poznat je kao zwitterion. Pri fiziološkim uslovima, aminokiseline se ne nalaze u nedisosovanom obliku, već se nalaze u jednom od oblika I, II ili III, što zavisi od pH sredine. Ona pH vrijednost pri kojoj se molekul aminokiseline nalazi u obliku dipolarnog jona označava se kao izoelektrična tačka. Izoelektrične tačke imaju različite vrijednosti, za različite aminokiseline. Vrijednost izoelektrične tačke može da se izračuna na osnovu izraza:
IET= pK1+ pK2

2 gdje pK1 i pK2 predstavljaju negativne logaritme konstanti disocijacije karboksilne i amino grupe. Iako u fiziološkim uslovima nema nedisosovanih molekula, aminokiseline pri sintezi proteina, peptida i dr. učestvuju kao nedisosovane.

Fizičke osobine Aminokiseline su čvrste, bezbojne supstance, visoke tačke topljenja i pri topljenju se raspadaju, pa ova fizička konstanta ne može da se koristi za njihovu identifikaciju. Dobro se rastvaraju u vodi, a prolin i oksiprolin pored dobre rastvorljivosti u vodi dobro se rastvaraju i u etanolu. Sve su, izuzev glicina, optički aktivne i njihovi vodeni rastvori obrću ravan polarizovane svjetlosti slabo u desno, ili pak slabo u lijevo. Hemijska reaktivnost Aminokiseline pokazuju sve reakcije koje su karakteristične za karboksilnu i za amino grupu. Karboksilne grupe aminokiselina mogu da se esterifikuju, pri čemu nastaju odgovarajući estri, gubitkom CO2 iz aminokiselina nastaju odgovarajući amini, u reakciji sa nekim acetilirajućim agensom nastaju N-acetil-aminokiseline, gubitkom amonijaka iz aminokiselina nastaju keto kiseline, dok karbamino jedinjenja nastaju u reakciji između CO2 i amino grupe aminokiseline. Aminokiseline, kao amfoterna jedinjenja, mogu da reaguju sa kiselinama, ili bazama, pri čemu grade soli. Reakcijom između aminokiselina i amonijaka nastaju amidi. Navedene reakcije predmet su izučavanja organske hemije.

PEPTIDI
O

Po hemijskoj građi peptidi su amidi kiselina. Nastaju sjedinjavanjem aminokiselina peptidnom vezom. Peptidna veza se ostvaruje kada karboksilna grupa jedne aminokiseline reaguje sa aminogrupom druge aminokiseline.

H N

C

Peptidna veza

Formiranje peptidne veze

O + H N 3 CH 2 COO + + HN 3 CH CH 3 Glicin (Gly) Valin (Val) Glicil-valin COO + H3 N CH 2 C NH CH CH3 COO

Dvije aminokiseline grade dipeptid, tri tripeptid, ako u peptidu ima manje od deset aminokiselina radi se o oligopeptidu, a ako je međusobno povezano preko deset aminokiselina onda je to polipeptid. U onim slučajevima gdje je povezano preko sto aminokiselina dobijamo proteine. Imena peptida se grade tako, što se ime aminokiseline koja je u stvaranju peptidne veze reagovala karboksilnom grupom završava nastavkom il, a ime aminokiseline koja je reagovala amino grupom, a karboksilna grupa je ostala slobodna, izgovara se nepromijenjeno, kao što se vidi u primjeru dipeptida glicil-valina. Dogovoreno je, da se slobodna amino grupa piše na lijevom kraju niza, dok se slobodna karboksilna grupa piše na desnom kraju peptidnog (proteinskog) niza. Veoma je važna sekvenca (redoslijed) povezivanja aminokiselina, i između ostalog, sekvenca aminokiselina je odgovorna za konformaciju, a samim tim i za fiziološke aktivnosti peptida, odnosno proteina. Sekvenca aminokiselina u nekom molekulu, peptidnom, ili proteinskom nije slučajna, već je strogo genetski kontrolisana. Zato, npr. dipeptidi glicil-alanin i alanil-glicin, iako imaju isti kvalitativni sastav (izgrađeni su od istih aminokiselina) i isti kvantitativni sastav (imaju iste količine glicina i alanina) nisu isti, već se mora naglasiti da se radi o dva sasvim različita dipeptida, što je uslovljeno različitom sekvencom aminokiselina. PRIRODNI PEPTIDI Neki peptidi se sintetišu in vivo i ispoljavaju izvjesna fiziološka svojstva, pa su takvi peptidi poznati kao prirodni peptidi. Spomenućemo neke od njih. Glutation je tripeptid γ-glutamil-cisteinil-glicin. Lako se može povratno da oksidiše i redukuje, pa je zbog toga uključen u mnoge redoks procese in vivo, kao što je redukcija Fe3+ u methemoglobinu, do Fe2+ pri čemu nastaje hemoglobin. Interesantno je da je kod glutationa reagovala γ-karboksilna grupa glutaminske kiseline, što je veoma rijedak slučaj.
O

NH 2 HOOC O

H N CH2 SH

N H

COOH

 -Glutamil

Cisteinil

Glicin

Glutation - GSH

Karnozin i anserin (N-metilkarnozin) po hemijskom sastavu su dipeptidi β-alanilhistidin, odnosno β-alanil-N-metilhistidin. Značajno su zastupljeni u skeletnim mišićima

kičmenjaka, a u humanim mišićima se nalazi uglavnom karnozin, dok je anserin manje zastupljen. Navedeni dipeptidi pomažu puferovanje skeletnih mišića u toku anaerobne kontrakcije, a eksperimenti in vitro ukazuju na njihov značaj u aktivaciji ATP-aze miozina.
+ HN 3

N O H CH 2

COOH

+ HN 3 O

N H CH 2

COOH

NH

N

CH 3

N

N

Karnozin (-alanil-histidin)

Anserin (-alanil-N-metilhistidin)

. Antibiotici su jedinjenja koja sadrže aminokiseline, kojih nema u proteinima i peptidima. Neuobičajeno povezane aminokiseline, mikroorganizmi ne mogu da metabolišu, što ima za posljedicu otežan razvoj mikroorganizama, odnosno izostaje rast i razvoj mikroorganizama u prisustvu antibiotika. Penicilin, koga luče gljivice Penicillium notatum, sastavljen je iz aminokiselina Val i Cys. Cistein (Cys) je N-acilovan, acil radikali mogu biti različiti, pa na osnovu toga do danas je sintetizovano više vrsta penicilinskih preparata.
H S N O Ako je R= Valin Penicilin Cistein HC 2 N R R= je promjenljivo

H C 3 H C 3 HOOC

O

onda je to benzilpenicilin

Penicilin je otkrio Fleming 1928. godine.

KATABOLIZAM AMINOKISELINA Katabolički put aminokiselina se odvija kroz tri različita procesa, a to su: Transaminacija; Oksidativna dezaminacija; Ciklus sinteze uree.

1. 2. 3.

Transaminacija Pod transaminacijom se podrazumijeva proces prenosa α-amino grupe (-NH2) sa aminokiseline donora, na α- ugljenikov atom odgovarajuće α-keto kiseline, koja ima ulogu

akceptora iste amino grupe. Dakle, od polazne aminokiseline nastaje keto kiselina, dok keto kiselina postaje amino kiselina. Ovaj reverzibilni proces je katalizovan enzimima aminotransferazama (ranije nazivanim transaminaze). Najčešći akceptor amino grupe je α-ketoglutarat. Tako se sakupljaju amino grupe mnogih aminokiselina u obliku L-glutamata, koji može da posluži kao donor amino grupa za biosintezu aminokiselina, ili za puteve eliminacije azotnih jedinjenja. Ćelije sadrže brojne aminotransferaze, koje su dobile ime prema supstratu na koji djeluju (npr. aspartat aminotransferaza, alanin aminotransferaza, vidi poglavlje XII).
COOCOO + HN 3 CH + CH 2 COOC CH2 CH 2 COO -ketoglutarna kiselina O COO + HN 3 O + CH2 COOCOO CH CH2 CH 2 COO Glutaminska kiselina (Glu) -

AST

C

Asparaginska kiselina (Asp)

Oksalsir}etna kiselina

Transaminacija amino grupe sa asparaginske kiseline na α-ketoglutarnu kiselinu
COO C COO + HN 3 CH CH 3 + CH2 CH 2 COO O + HN 3 COO CH CH O 3 + CH 2 2

ALT

COO C CH

COO -

Alanin (Ala)

Transaminacija amino grupe sa alanina na α-ketoglutarnu kiselinu Sve aminotransferaze imaju istu prostetičnu grupu, kao i mehanizam djelovanja. Prostetična grupa je piridoksal-5-fosfat (PLP), koenzimski oblik vitamina B6. PLP se javlja u tautomernim oblicima, što je prikazano formulama:
O C HO H O CH O-P-O 2 ON O C O H O CH O-P-O2 + N H O-

-ketoglutarna kiselina

Pirogro`| ana kiselina

Glutaminska kiselina (Glu)

HC 3

HC 3

Tautomerni oblici piridoksal-5-fosfata PLP, u aktivnom centru aminotransferaza, funkcioniše kao intermedijarni nosač amino grupa. U početnoj fazi, amino grupa reagujuće aminokiseline se vezuje sa aldehidnom grupom PLP, stvarajući intermedijarno jedinjenje aldimin ( naziv aldimin označava da je kompleks dobijen reagovanjem aldehidne grupe jednog i amino grupe drugog

jedinjenja). Tautomerizacijom nastaje ketimin (reagovanjem keto grupe jedne i amino grupe druge supstance). Aldimin i ketimin imaju strukturne odlike Schiff-ove baze ( ─C═N─). Ketimin se u hidrolitičkoj reakciji lako razlaže na odgovarajuću keto kiselinu i piridoksamin-5-fosfatenzim, koji uz odgovarajuću keto kiselinu (akceptor amino grupe) prelazi ponovo u ketimin, a zatim nastaje aldimin, iz koga se oslobađa nova aminokiselina, pri čemu se regeneriše PLP. Oksidativna dezaminacija Pored α-ketoglutarne kiseline, česti akceptori amino grupa, pri procesu transaminacije, su pirogrožđana i oksalsirćetna kiselina, pri čemu one prelaze u alanin i asparaginsku kiselinu. Iz alanina i asparaginske kiseline, novim premještanjem amino grupa, može da nastane glutaminska kiselina, iz koje će procesom oksidativne dezaminacije biti oslobođen amonijak i uključen u ciklus sinteze uree. Na ovaj način, u jetri i bubrezima, sprečava se nagomilavanje molekula glutaminske kiseline. Pored toga, amonijum jon u bubrezima ima značajnu fiziološku ulogu u održavanju acido-bazne ravnoteže. Oksidativna dezaminacija se odigrava postepeno, prvo nastaje imino oblik glutaminske kiseline, a dobijena α-iminoglutarna kiselina reaguje sa molekulom vode i u hidrolitičkoj reakciji nastaje oslobađanje amonijaka i α-ketoglutarne kiseline.
R + HN 3 CH COOaminokiselina E FMN E FAD HN R CH COO iminokiselina H2O O R CH + NH COOketokiselina 3

. .

E FMNH2 E FADH 2

. .

H2O2 katalaza

O2

HO 2

SINTEZA UREE Amonijak se eliminiše iz organizma u vidu različitih terminalnih proizvoda, tako kod amoniotelnih organizama (pijavice, riječni rakovi) izlučuje se u vidu amonijaka, ili amonijumovih soli, kod urikoteličnih organizama (ptice) u obliku mokraćne kiseline, dok ureotelični organizmi (sisari) izlučuju ureu. Urea je netoksično jedinjenje, dobro rastvorljivo, tako da se lako eliminiše putem urina. Do 90% izlučenog neproteinskog azota u urinu čini urea. Biosinteza uree odvija se u jetri, tokom 5 povezanih enzimski-katalizovanih reakcija. Krebs i Henseleit su 1932. godine razjasnili ovaj proces, koji se njima u čast i označava kao Krebs-Henseleit-ov ornitinski ciklus sinteze uree. Tokom ovog ciklusa urea se sintetiše iz 2 molekula amonijaka i jednog molekula ugljendioksida. Dvije molekule amonijaka nastaju tokom katabolizma dvije aminokiseline: glutaminske i asparaginske. Prvi molekul amonijaka nastaje oksidativnom dezaminacijom

glutaminske kiseline, katalitičkim dejstvom glutamat dehidrogenaze, pri čemu nastaje amonijak i α-ketoglutarna kiselina. Proces se odvija u mitohondrijama hepatocita. Dobijeni amonijak se koristi u prvoj reakciji ciklusa uree, sintezi karbamoil-fosfata. Za reakciju je potrebno prisustvo 2 molekula ATP, uz dejstvo enzima karbamoil-fosfat sintetaze I (CPS-I). Jedna molekula ATP-a se koristi za sintezu amidne veze između amonijaka i ugljendioksida, a druga za vezu anhidrida fosforne kiseline i ugljendioksida. Tako istovremeno nastaju dvije kovalentne veze u molekulu karbamoil-fosfata. Za reakciju je neophodno prisustvo Mg2+ i Nacetil-glutaminske kiseline, koja djeluje kao alosterički aktivator enzima CPS-I. Reakcija je ireverzibilna i ujedno limitirajuća za proces sinteze uree. Nastali karbamoil-fosfat, u drugoj reakciji, reaguje sa ornitinom, uz katalitičko dejstvo enzima ornitin transkarbamoilaze (OTC), gradeći citrulin. Ova reakcija je lokalizovana u mitohondrijama, tako da ornitin mora da pređe iz citosola u mitohondrije, što je obezbijeđeno specifičnim transportnim sistemom. Nastali citrulin prelazi u citosol, gdje se nastavlja biosinteza uree. Citrulin reaguje sa asparaginskom kiselinom, koja je izvor drugog atoma azota i nastaje arginin-ćilibarna kiselina. Ovu povratnu reakciju katalizuje arginin-sukcinat sintetaza, uz utrošak jedne molekule ATP-a. Uz AMP oslobađa se pirofosforna kiselina, koja se razlaže pirofosforilazom, što obezbjeđuje odvijanje ove reakcije ka arginin-ćilibarnoj kiselini.

2ADP + Pi O 2ATP + HO-C-O + bikarbonat 1 NH 3 CSP-I O 2H N -C- O- PO3 2 karbamoil-fosfat 2 OTC NH2 C NH 2 NH (CH ) 23 CH COO ornitin + HN 3 O arginino-sukcinat sintetaza 3 COO + HN 3 CH CH2 COO aspartat

+ HN 3

(CH ) 23 ATP CH COO citrulin

AMP + 2P i COO HN 2 NH C N-CH CH 2 COO -

NH 2 O C urea NH 5 2

+ HN 3 arginino-sukcinat liaza HN 2 HC 2 CH C NH
COO

(CH ) 23 CH COO -

HO 2

4

arginino-sukcinat

NH 2

-

H

C C H COO fumarat

+ HN 3

CH 2 CH COO arginin

Ciklus Uree

U narednoj reakciji ciklusa razlaže se arginin-ćilibarna kiselina, katalitičkim dejstvom arginin-sukcinat liaze, pri čemu se oslobađa arginin i fumarna kiselina. Dok fumarna kiselina odlazi u citratni ciklus, arginin se razlaže na molekulu uree i aminokiselinu ornitin. Ova posljednja reakcija u ciklusu uree je katalizovana enzimom arginazom. Ornitin ponovo odlazi u ciklus uree. Arginazu, visokospecifični enzim, aktivišu joni Mn2+ i Mg2+. Sinteza uree je povezana sa ciklusom trikarbonskih kiselina preko fumarne kiseline i preko oksalsirćetne kiseline. To je prikazano na slici 27. KATABOLIZAM UGLJOVODONIČNOG SKELETAAMINOKISELINA Nakon završenog procesa transaminacije nastaju bezazotni ostaci, koji su metabolički iskoristivi, tj. imaju odgovarajuću energetsku vrijednost. Većina bezazotnih ostataka dalje se, na različit način, uključuje u ciklus trikarbonskih kiselina. To se dešava preko jednog od slijedećih intermedijera: piruvata, α-ketoglutarata, sukcinil-CoA, fumarata, oksalacetata, acetil-CoA i acetoacetata. Aminokiseline koje se razgrađuju u piruvat su: alanin, cistein i serin. Treonin i glicin preko serina daju piruvat. ACETALDEHID
TREONIN GLICIN CISTEIN ALANIN SERIN

PIRUVAT

Metabolička razgradnja nekih aminokiselina

ARGININ ORNITIN

PROLIN

HISTIDIN

GLUTAMIN

GLUTAMINSKA KISELINA

α - KETOGLUTARAT
U sukcinil-CoA se razlažu metionin, valin i izoleucin.
METIONIN IZOLEUCIN VALIN

PROPINOL - CoA

SUKCINIL - CoA

PROPIONIL - CoA

Aminokiselina koja istovremeno daje i acetil-CoA i acetosirćetnu kiselinu je leucin.

NUKLEINSKE KISELINE
PURINSKE I PIRIMIDINSKE BAZE Purinske i pirimidinske baze se u ćelijama nalaze u sastavu nukleozida i nukleotida. Otuda imaju znaĉajne uloge u biohemijskim procesima svih ćelija. Kao sastavni dijelovi nukleinskih kiselina (DNA i RNA) neophodni su za ćelijski rast, diobu, sintezu proteina, kao i transfer informacija u procesu rasta i diobe ćelija. Sastavni su dio koenzima (NAD, FAD, CoA, FMN i dr.) makroenergetskih jedinjenja (ATP, CTP, UTP, GTP). Medijatori su djelovanja mnogih hormona, faktora rasta i citokina (cAMP i cGMP). Grade razliĉita intermedijarna jedinjenja u mnogim biosintetskim reakcijama (UDP-glukoza). Glavne purinske baze su adenin i guanin, a hipoksantin i ksantin se javljaju kao metaboliĉki intermedijeri. Citozin, timin i uracil su glavne pirimidinske baze. Nukleozidi su jedinjenja purinskih i pirimidinskih baza sa ribozom, ili 2-dezoksiribozom, koja se vezuje za azot u položaju 3 pirimidinskih, a azot u položaju 9 purinskih baza, glikozidnom vezom.
Purinske baze
NH2 1 N 2 6 5 7 N 8 N 3 4 N9 H Guanin (Gua) NH 2 N N H N N H Hipoksntin (Hyp) HN O N HN O N

Adenin (Ade)

Purinski nukleozidi
NH2 N N , N, O 5 CH OH 1 ,2 H H 4 H , , 3H 2 OH OH Adenozin (A) HN O N O HN O H H H OH OH Guanozin (G) CH2OH N

N

N NH2

N H

N

N H H

O H

CH OH 2 H

OH OH Inozin (I)

Pirimidinske baze
NH 2 6 1N O 2 5 4 N3 H Citozin (Cyt) O N H Uracil (Ura) O N H Timin (Thy) (5-metiluracil) HN O O HN

pirimidinski nukleozidi NH 2 N HN O HN O

O

N H

O H

O CH OH 2 H OH

N H

O H

CH2OH H

O

N H

O H

CH2OH H

H

H

H

OH

Citidin (C)

OH OH Uridin (U)

OH

OH Timidin (T)

DEZOKSIRIBONUKLEINSKA KISELINA Molekula dezoksiribonukleinske kiseline (DNK, DNA) se sastoji iz dvostrukog lanca, a u svakom lancu je veliki broj dezoksiribonukleotida, vezanih stabilnim kovalentnim vezama. Svaki nukleotid sadrži nukleozid i molekulu fosforne kiseline, a svaki nukleozid jednu molekulu dezoksiriboze i jednu purinsku, ili pirimidinsku bazu. Fosforna kiselina je estarski vezana za hidroksilnu grupu na C5 molekule dezoksiriboze, a purinska, ili pirimidinska baza su vezane za dezoksiribozu preko njene hidroksilne grupe na C1. U sastav dezoksiribonukleotida ulaze purinske baze adenin i guanin, a od pirimidinskih baza citozin i timin, tako da monomerne jedinice DNA molekule predstavljaju slijedeći dezoksiribonukleotidi: dezoksiadenozin monofosfat (dAMP), dezoksiguanozin monofosfat (dGMP), dezoksicitidin monofosfat (dCMF) i dezoksitimidin monofosfat (dTMP). Iz formula na slici se vidi da ribozil ostatak ima jednu slobodnu hidroksilnu grupu na C3. Fosforna kiselina je trobazna, tako da su dvije –OH grupe slobodne, pa će jedna od njih da bude iskorištena za uspostavljanje estarske veze sa susjednom molekulom dezoksiribonukleotida preko njegove –OH grupe na C3 riboze. Dakle, niz dezoksiribonukleotida su meĊusobno povezani fosfodiestarskim 5', 3' vezama. Osnovni niz svakog DNA lanca ĉine rezidui dezoksiriboze i fosforne kiseline, a purinske i pirimidinske baze su postavljene boĉno, tako da u dvostrukom lancu molekule DNA baze dolaze u neposrednu blizinu i izmeĊu njih se uspostavljaju kovalentne vodoniĉne veze. Jedan adenin je uvijek spojen sa timinom i to sa dvije vodoniĉne veze, a guanin sa tri vodoniĉne veze sa citozinom. Uspostavljanje vodoniĉnih veza znaĉajno doprinosi stabilizaciji dvostrukog heliksa DNK; meĊutim, postoje i hidrofobne veze izmeĊu purinskih i pirimidinskih baza.

2

Dezoksiribonukleinska kiselina

Raspored baza u polinukleotidnom lancu DNA nosi genetsku informaciju, koja ima dvostruku ulogu. Ona je izvor informacija za sintezu svih proteina u ćeliji i istovremeno obezbjeĊuje informaciju koju nasljeĊuju ćelije-kćerke, ili potomstvo. Model strukture DNA dali su Watson i Crick. DNA se sastoji iz dva antiparalelna spiralna polinukleotidna lanca izuvijana oko zajedniĉke ose. Konstatacija da su dva lanca postavljena antiparalelno oznaĉava da u jednom lancu postoji 5',3' a u drugom 3',5'–fosfodiestarska veza izmeĊu njihovih dezoksiribonukleotida. Zato se i govori o 5',3' odnosno 3',5'- DNA nizu. Znaĉajan doprinos objašnjenju strukture molekule DNA dao je 1950. godine Chargaff sa saradnicima. Oni su uspostavili pravila: nukleotidni sastav DNA razliĉitih jedinki je razliĉit; DNA izolovana iz razliĉitih organa jednog organizma ima isti sastav nukleotida, koji se ne mijenja sa starenjem, ishranom, ili promjenom uslova spoljašnje sredine; koliĉina purinskih baza jednaka je koliĉini pirimidinskih baza (A+G=T+C); broj molekula timina jednak je broju molekula adenina,

3

dok je broj molekula guanina jednak broju molekula citozina; odnos izmeĊu komplementarnih baza A-T/G-C nikad nije jednak jedinici, već je specifiĉan, kod sisara i ĉovjeka je veći od jedan. Od ukupne koliĉine DNA manje od 0,3% je u mitohondrijama, a sav preostali dio se nalazi u jedru, kao hromozomalna DNA. Postoje podaci po kojima, kada bi se razmotala molekula hromozomalne DNA, imala bi dužinu oko 2 metra, što bi odgovaralo 5,5x109 parova purinskih i pirimidinskih baza. Na veliĉinu RMM DNA znaĉajno utiĉu i mnogobrojni molekuli alkalnih proteina histona, koji se nalaze duž DNA u mnogobrojnim prostorima izmeĊu dvostrukog heliksa. Zahvaljujući velikom broju rezidua fosforne kiseline, molekul DNA ispoljava osobine jake kiseline. Veliki broj disosovanih –OH grupa fosforne kiseline omogućava vezivanje katjona, naroĉito Mg2+ i Ca2+, kao i nekih polikatjonskih amina tipa spermina i spermidina. Hromozomalna DNA predstavlja skup genetskih informacija, koje su u molekuli zastupljene u obliku kodova. Genetski kod nastaje kombinacijom 4 dezoksiribonukleotida (dAMP, dGMP, dCMP i dTMP). Tri dezoksi-ribonukleotida daju jedan kod za jednu aminokiselinu, dok ĉetiri dezoksiribonukleotida mogu da daju 43=64 razliĉita tripleta dezoksiribonukleotida, pri ĉemu svaki triplet predstavlja šifru za jednu aminokiselinu. Dakle, molekula DNA sadrži niz šifrovanih zapisa za svaki protein, koji se u nekoj ćeliji sintetiše. RIBONUKLEINSKE KISELINE Ribonukleinske kiseline (RNK, RNA) su polinukleotidni molekuli. U sastav RNA ulaze ribonukleotidi, koji se sastoje iz jednog molekula ribonukleozida i fosforne kiseline, a svaki ribonukleozid ĉine riboza i jedna purinska, ili pirimidinska baza. Ribonukleozidi se razlikuju od dezoksiribonukleozida po tome što umjesto timina sadrže uracil. Ribonukleotidi AMP, GMP, CMP i UMP povezani 5',3'–fosfodiestarkom vezom predstavljaju jednostruki polinukleotidni lanac RNA. Broj nukleotida u RNA je znaĉajno manji u odnosu na DNA i iznosi od 75 do nekoliko hiljada. Lanac RNA može da se savije kao petlja, ukosnica, vezivanjem komplementarnih baza, tako da u nekim dijelovima molekuli RNA dobijaju dvolanĉanu strukturu. U tim dijelovima adenin se spaja sa uracilom, a guanin sa citozinom. Sadržaj citozina u RNA ne mora da bude jednak sadržaju guanina, niti sadržaj adenina sadržaju uracila. Ćelijska lokalizacija RNA je drugaĉija od DNA. Tako se najveći dio RNA, oko 50%, nalazi u ribozomima, oko 24% u citosolu, 15% u mitohondrijama, a preostali dio oko 11% u jedru. Postoje tri vrste RNA: informaciona, transportna i ribozomalna. Informaciona (messenger) RNA (iRNA, mRNA) Informaciona RNA nastaje u jedru prilikom transkripcije (prepisa) genske informacije iz hromozomalne DNA u jednostruki niz poliribonukleotida, koji je komplementaran 3',5' lancu DNA, tako da mRNA ima 5',3' redoslijed svojih nukleotida. Ideja o postojanju mRNA potiĉe od Francois Jacob-a i Jacques Monod-a iz 1961. godine. Oni su utvrdili da je logiĉno, pošto se proteini sintetišu u citoplazmi, a informacija za tu sintezu potiĉe od DNA iz jedra, da postoji informacioni meĊuproizvod u sintezi proteina. Tako je roĊena ideja o mRNA, koja predstavlja vezu izmeĊu gena i proteina. U odnosu na druge vrste molekula RNA, iRNA su veoma heterogene.

4

Danas se smatra da su u nukleusu ćelija sisara neposredni proizvodi transkripcije gena heterogene nuklearne RNA (hnRNA) koje su veće od 107 daltona. Molekuli hnRNA nastaju kao prethodnoci mRNA molekula, ĉija je RMM oko 106 daltona. Nastala mRNA prelazi iz jedra u citoplazmu i dolazi u ribozome, gdje služi kao matrica u procesu sinteze (translacije) polipeptidnog lanca, u kome aminokiseline zauzimaju svoja mjesta po taĉno utvrĊenom redoslijedu. Dužina mRNA odgovara dužini polipeptidnog lanca, za ĉiju biosintezu nosi prepisanu informaciju, iz odgovarajućeg strukturnog gena. Kako je svaka aminokiselina odreĊena tripletom baza u lancu DNA, odnosno mRNA, za sintezu polipeptidnog lanca koji sadrži 100 aminokiselinskih ostataka potrebna je mRNA koja sadrži najmanje 300 ribonukleotida. mRNA ima i dodatni niz od 20-250 AMP nukleotida u obliku "repa" na 3'hidroksilnom kraju, dok je na 5'-terminalnom dijelu "kapica" u vidu 7-metil-guanozintrifosfata. Izgleda da "rep" olakšava transport zrele mRNA iz nukleusa u citosol, povećava stabilnost molekule i daje signal u ribosomima za broj translacionih ciklusa mRNA. Transportne RNA (tRNA) Transportne RNA se sastoje iz jednog polinukleotidnog lanca, koga ĉini oko 80 ribonukleotida, tako da je RMM oko 25000 daltona. Ukupni broj tRNA je oko 60, iako se mislilo da ih je 20, tj. da je za transport jedne aminokiseline odgovorna jedna tRNA. Objašnjenje postojanja više tRNA leži u saznanju da se pojedine aminokiseline transportuju uz pomoć više tRNA. U molekuli tRNA nalaze se i neobiĉni (rijetki) nukleotidi: pseudouridinmonofosfat i ribotimidinmonofosfat. Primarna struktura tRNA omogućava uvijanje i sparivanje komplementarnih baza na pojedinim dijelovima jednolanĉanog tRNA, što rezultira stvaranjem sekundarne strukture tRNA, koja liĉi na trolisnu djetelinu.
A C , 5 kraj

pG

C , 3 kraj akceptorsko stablo T C "list"

DHU "list"

pomo}ni segment antikodonski "list" antikodon

Grubi prikaz sekundarne strukture tRNA

5

Na 3' terminalnom dijelu, predjelu "peteljke djeteline", nalazi se trinukleotid citidincitidin-adenozinmonofosfat (C-C-A), koji omogućava vezivanje aktivisane aminokiseline. Ovaj proces se ostvaruje nastajanjem estarske veze izmeĊu aminokiseline koja se transportuje i –OH grupe na C3 terminalnom adenozinmonofosfatu. Za nastajanje ovakvog specifiĉnog kompleksa potrebno je prisustvo enzima sintetaze aminoacil-tRNA. Smatra se da navedeni enzim prvo aktiviše aminokiselinu, a tek potom katalizuje stvaranje kompleksa. Na srednjem "listu" se nalazi specifiĉan trinukleotid za aminokiselinu koja se transportuje, a oznaĉava se kao triplet antikodon. Antikodon prepoznaje triplet kod u mRNA na ribozomima, tokom sinteze polipeptidnog lanca. Drugi "list" se oznaĉava kao DHU (dihidrouracil) i omogućava prepoznavanje tRNA od strane sintetaze aminoacil-tRNA, dok je treći "list" TΨC (timidin-pseudouridin-citidin) zadužen za vezivanje aminoacil-tRNA kompleksa na površini ribozoma. Na šemi je vidljiv i jedan detalj, ĉetvrti "list", izmeĊu antikodona i TΨC "lista", koji nije prisutan u svim tRNA. Ribozomalne RNA (rRNK, rRNA) Ribozom predstavlja citoplazmatsku nukleoproteinsku strukturu, koja služi za biosintezu proteina sa matrica iRNA. rRNA postoje u ĉetiri oblika, razliĉite veliĉine i sedimentacione konstante, a oznaĉavaju se kao ribozomalne RNA. One nastaju obradom (procesovanjem) primarnih prekursornih molekula (primarnih transkripta). Nastanak rRNA se odvija uz uĉešće RNA polimeraze I i RNA polimeraze III, pri ĉemu nastaju dva primarna transkripta: transkript 45S rRNA i 5S rRNA. Pored ĉetiri razliĉita molekula rRNA, u subjedinicama ribozoma (ima ih dvije) dokazano je prisustvo preko 100 specifiĉnih proteinskih molekula. U citoplazmi su ribozomi veoma stabilni i sposobni za mnoge translacije. REPLIKACIJA DNA Replikacija je proces udvostruĉavanja DNA materijala u jedru ćelije, a dešava se u ćelijama koje se pripremaju za diobu mitotiĉkim procesom. Na ovaj naĉin omogućeno je prenošenje genetskih informacija sa ćelije-majke na ćelije-kćerke, sa visokim stepenom taĉnosti, u cilju oĉuvanja genetskih sadržaja unutar organizma. Replikacija DNA je veoma složen proces, koji zahtijeva prisustvo enzima DNA-zavisne RNA polimeraze, DNA-polimeraze, DNA-ligaze, kao i tzv. proteina za rasplitanje dvostrukog DNA lanca, dovoljno molekula dezoksiribonukleozid-trifosfata i ribonukleozid-trifosfata. Brzina replikacije u ćelijama sisara je 50 nukleotida/sec. Pošto je molekula DNA velikih dimenzija i uz to višestruko ispresavijana, suviše bi dugo trajalo postepeno rasplitanje i razdvajanje, koje bi teklo postepeno od jednog, ili oba kraja. Duž dvostrukog DNA lanca postoje brojna tzv. inicirajuća mjesta, gdje se proces pokreće, djelovanjem proteina za rasplitanje. Na mjestima raskidanja veza izmeĊu purinskih i pirimidinskih baza dolazi do razmicanja dva antiparalelna DNA lanca. Mjesto ovakvog dešavanja ima izgled zadebljanja, ili ĉvora (mjehura). U replikacionom ĉvoru oba lanca DNA služe kao kalupi za proces replikacije komplementarnih lanaca DNA ćelije kćerke.

6

Nakon vezivanja proteina za rasplitanje djeluje specifiĉni enzim DNA-zavisna RNA polimeraza, koji iz ribonukleozid-trifosfata sintetiše jedan kraći RNA-fragment, sastavljen od 10-tak nukleozida. Ĉim se sintetišu i privremeno vežu RNA-fragmenti otpoĉinje sinteza DNA-segmenta (Okazaki-segmenta) dejstvom enzima DNA-polimeraze. Okazaki-segmenti se sastoje iz 150-250 dezoksiribonukleotida i vezuju se antiparalelno na osnovni DNA lanac. Kratki RNA-fragmenti služe samo za iniciranje sinteze Okazaki-segmenata, nakon ĉega se uklanjaju. Okazaki-segmenti se meĊusobno povezuju djelovanjem DNA-ligaze, a novosintetisani DNA lanac je komplementaran i antiparalelan u odnosu na osnovni DNA lanac. Svi navedeni procesi se istovremeno odvijaju na više mjesta u DNA molekuli i zato veoma brzo nastaju dva dvostruka lanca. DNA lanac sa 3',5'-fosfodiestarskom vezom postaje model za dobijanje novosintetisanog DNA niza sa 5',3'-fosfodiestarskom vezom i obrnuto drugi osnovni lanac sa 5',3'-fosfodiestarskom vezom postaje model za sintezu novog antiparalelnog lanca sa 3',5'-fosfodiestarskom vezom. Pošto nastaju ukupno 4 DNA lanca (2 stara i 2 nova), dvije ćelije-kćerke će imati isti hromozomski DNA materijal, kao i ćelija-majka. TRANSKRIPCIJA Transkripcija je prepisivanje genetskih informacija sa hromozomalne DNA, što je neophodno za sintezu više specijalizovanih oblika RNA. Za transkripciju je neophodno prisustvo enzima DNA-zavisne RNA polimeraze, koji omogućava nastajanje parova izmeĊu purinskih i pirimidinskih baza ĉetiri nukleotida (AMP, GMP, CMP i UMP) i komplementarnih baza osnovnog DNA lanca sa 3',5'-fosfodiestarskom vezom. Nastala RNA je komplementarna sa onim segmentom hromozomalne DNA prema kojoj se vrši sinteza. U toku transkripcije prepisuje se samo dio informacija sadržanih duž jednog DNA lanca, potrebnih za sintezu onog proteina koji se u tom trenutku sintetiše. Lanac DNA koji nosi sekvencu koja se prepisuje u molekul RNA naziva se matiĉni (templatni) lanac DNA. Smjer sinteze RNA je 5'→3', tj. lanac RNA raste u istom smjeru kao i lanac DNA pri replikaciji. Transkripcija poĉinje na odreĊenim mjestima templatnog lanca DNA, koja su oznaĉena kao promotori, koje prepoznaje RNA polimeraza. U toku biosinteze RNA lanca nastaje tzv. privremeni hibrid DNA-RNA, koji je male stabilnosti, pa se RNA lako odvaja od svog modela u trenutku okonĉanja sinteze. Nakon toga slijede post-transkripciona dotjerivanja nastalih specijalizovanih RNA molekula (mRNA, iRNA i rRNA). SINTEZA PROTEINA Sinteza proteina je veoma složen proces, koji zahtijeva prisustvo velikog broja enzima i specifiĉnih makromolekula. Uprkos tome, proces se odvija velikom brzinom, tako da ribozom sisara može, za samo 2 minuta, da izvrši translaciju 200 kodona mRNA u odgovarajući polipeptidni lanac. Sinteza proteina oznaĉava se terminom translacija (prevoĊenje). Prevodi se genetska informacija sadržana u hromozomalnoj DNA u obliku odgovarajućih triplet nukleotidnih šifara, koje se prepisuju i prenose uz pomoć ribozomalne mRNA u ribozome. Translacija se sastoji iz ĉetiri faze: aktivacije aminokiselina, inicijacije peptidnog lanca, elongacije (produžavanja) peptidnog lanca i završetka sinteze.

7

Aktivacija aminokiselina Svaka aminokiselina koja se ugraĊuje u odreĊeni peptidni lanac mora da bude prethodno aktivisana. Proces se odvija u citosolu ćelije i zahtijeva prisustvo: aminokiselina, odgovarajućih tRNA, enzima sintetaza aminoacil-tRNA, odgovarajućeg broja ATP molekula i katjona Mg2+. Aminoacil-tRNA sintetaze su visoko selektivne molekule. Sa jedne strane one prepoznaju aminokiselinu koju aktivišu, a sa druge strane odabiru akceptor-odgovarajuću tRNA. Ovakve osobine enzimske molekule moguće su zahvaljujući postojanju tri aktivna mjesta za vezivanje: aminokiseline, tRNA i ATP. Dok tRNA može da bude više za istu aminokiselinu, enzim sintetaza specifiĉna je samo za jednu aminokiselinu. Aktivacija aminokiselina se odvija u dvije etape. Prvo se razgraĊuje ATP na adenilnu kiselinu i pirofosfat, a zatim adenilna kiselina reaguje sa aminokiselinom i gradi intermedijarno jedinjenje aminoacil-adenilnu kiselinu. Aminoacil-adenilna kiselina je anhidrid nastao gubitkom molekula vode, nastale iz –OH grupe karboksilne grupe aminokiseline i –OH grupe fosforne kiseline adenilne kiseline. Na taj naĉin je aktivisana karboksilna grupa aminokiselina. Aminoacil-AMP (aktivisana aminokiselina) zatim se prenosi na odgovarajuću tRNA, uz katalitiĉko dejstvo odgovarajuće sintetaze, pri ĉemu se izdvaja AMP. Kompleks aminoacil-tRNA nastaje obrazovanjem estarske veze izmeĊu aktivisane karboksilne grupe aminokiseline i slobodne hidroksilne grupe na C3 ili C2 riboze adenilne kiseline (AMP), koja se nalazi u sastavu trinukleotida C-C-A na 3'terminalnom dijelu tRNA. aminoacil-t-RNA sintetaza ATP + aminokiselina aminoacil-t-RNA sintetaza aminoacil-AMP + tRNA aminoacil-tRNA + AMP aminoacil-AMP + PPi

Neorganski pirofosfat se hidrolizuje dejstvom pirofosfataze do ortofosfata, što pokreće sintezu aminoacil-tRNA. Reakcija je egzergoniĉna. Nastali kompleks aminoacil-tRNA oslobaĊa se enzima sintetaze aminoacil-tRNA, odlazi u citoplazmu, gdje će se u ribozomima da ukljuĉi u biosintezu peptidnog lanca.

Inicijacija peptidnog lanca Inicijacija peptidnog lanca lokalizovana je u ribozomima, a za proces je neophodno prisustvo: prvog aminoacil-tRNA kompleksa (to je po pravilu Met-tRNA), mRNA sa odgovarajućim kodom za ovu aminokiselinu (AUG), GTP, Mg2+, inicirajući faktori IF1, IF2 i IF3, kao i teške i lake subjedinice ribozoma, 60S i 40S. Na poĉetku ove faze ribozomi disociraju na dvije pomenute podjedinice, pri ĉemu laka subjedinica (40S) obrazuje inicirajući kompleks sa mRNA i aminoacil-tRNA kompleksom. Svi

8

proteini sintetisani u ribozomima poĉinju sa ostatkom metionina, koji se na ribozome donosi pomoću specifiĉne metionil-tRNA. Ostatak aminokiseline metionina može kasnije da se ukloni iz polipeptidnog lanca, dejstvom specifiĉne aminopeptidaze. Inicirajući kompleks postepeno ostvaruje vezu sa inicirajućim faktorima. Laka 40S subjedinica ribozoma, Met-tRNA i mRNA formiraju 40S inicijalni kompleks. Pojedini inicirajući faktori imaju razliĉite uloge. IF3 omogućava vezivanje mRNA, a IF2 služi za vezivanje Met-tRNA i fosfatnog jedinjenja GTP. Tako nastaje kompleks GTP-IF2-Met-tRNA, koji sa lakom jedinicom ribozoma ĉini inicirajući kompleks. Zatim slijedi asocijacija sa teškom jedinicom 60S i oslobaĊanje sva tri inicirajuća faktora i razlaganje GTP na GDP i ortofosfornu kiselinu. Formiranjem 80S ribozoma završena je ova faza i može da startuje elongacija peptidnog lanca. Elongacija peptidnog lanca U sklopu funkcionalno aktivnog ribozoma (80S) laka sujedinica (40S) ima dva mjesta za vezivanje aminoacil-tRNA. Jedno je P (peptidil) i drugo A (aminoacil). Inicirajuća Met-tRNA može da se veže samo za mjesto P, a sve aminoacil-tRNA se vezuju za mjesto A. Faza elongacije peptidnog lanca obuhvata tri procesa: vezivanje aminokiselinskog ostatka u obliku aminoacil-tRNA kompleksa, stvaranje peptidne veze i translokaciju (pomjeranje ribozoma duž mRNA). Elongacija poĉinje vezivanjem prve aminoacil-tRNA na prazno mjesto na ribozomu. Koja će se aminoacil-tRNA da veže odreĊuje kodon mRNA, koji se nalazi u mjestu A. AminoaciltRNA koja ulazi u ribozom stvara trojni kompleks sa faktorom elongacije 1(EF1) i GTP, pri ĉemu se faktor elongacije vezuje za aminokiselinu iz aminoacil-tRNA kompleksa i GTP samo kada odgovarajući antikodon doĊe u vezu sa prvim kodonom. Hidrolizom GTP na GDP i fosfat, uz istovremeno otpuštanje faktora elongacije, nastaje prva peptidna veza izmeĊu esterifikovane karboksilne grupe Met-tRNA, koji se nalazi na mjestu P i α-amino grupe aminoacil-tRNA na mjestu A. Reakciju katalizuje peptidil transferaza, koja je integralni dio 80S subjedinice ribozoma. Nastaje dipeptidil-tRNA, koji je privremeno vezan za mjesto A, a na mjestu P se nalazi slobodna tRNA iz ranijeg kompleksa Met-tRNA. U fazi translokacije, sa kojom se završava elongacija, omogućeno je pomjeranje funkcionalnog ribozoma duž lanca mRNA, što omogućava prebacivanje dipeptidil-tRNA sa mjesta A na mjesto P i u isto vrijeme vrši istiskivanje slobodne tRNA. Za ovaj složeni proces energiju obezbjeĊuje GTP uz uĉešće elongirajućeg faktora 2 (EF2). Upražnjeno mjesto A brzo može da se popuni sa novim aminoacil-tRNA kompleksom. Tako su stvoreni uslovi za formiranje naredne peptidne veze i nastajanje tripeptidil-tRNA. Sve navedene faze se ponavljaju do nastanka odgovarajućeg peptidnog lanca. Završetak sinteze peptidnog lanca Kada se polipeptidni lanac elongacijom produžio do odreĊene dužine nastupa završetak sinteze. To se ostvaruje putem ulaska jednog od tri besmislena kodona (UAA, UGA ili UAG) u mjesto A. To bi odgovaralo šifri stop, ali pošto ne postoji tRNA koja bi svojim antikodonom prepoznala stop signale, ovdje se ukljuĉuju proteini, tzv. faktori oslobaĊanja (RF). Oni prepoznaju besmislene kodone, nakon ĉega slijedi hidrolitiĉko odvajanje polipeptida od zadnje tRNA. tRNA se istiska iz mjesta P, a ribozom sa svojim podjedinicama je sposoban da ponovo uĊe u ciklus sinteze novog polipeptidnog lanca.

9

Efikasnost sinteze peptidnih lanaca postiže se zahvaljujući postojanju poliribozoma tj. više desetina, ili ĉak stotina ribozoma duž jednog lanca mRNA. U energetskom smislu sinteza proteina ima veliku "cijenu". Za svaku ugraĊenu aminokiselinu potrebno je da se utroši ĉetiri molekula fosfatnih jedinjenja bogatih energijom (ATP i GTP).

10

ISPITNA PITANJA IZ BIOHEMIJE
(za studente Poljoprivrednog fakulteta koji polažu biohemiju počevši od juna 2007. godine)

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Struktura enzima Aktivni centar enzima Specifičnost enzima Enzimi kao katalizatori (kinetika enzimskih reakcija) Uticaj temperature i pH na brzinu enzimski katalizovanih reakcija Uticaj koncentracije enzima i koncentracije supstrata na brzinu enzimski katalizovanih reakcija 7. Grafičko određivanje Km 8. Nomenklatura i klasifikacija enzima 9. Jedinice za izražavanje aktivnosti enzima 10. Koenzimi 11. Vitamin B1 12. Vitamin B2 13. Pantotenska kiselina 14. Vitamin B6 15. Vitami B12 16. Vitamin C 17. Vitamin A 18. Vitamin D 19. Vitamin E 20. Vitamin K 21. Vitamin F 22. Transport elektrona i oksidativna fosforilacija 23. Kompleksi respiratornog lanca (I-IV) 24. ATP-sintetaza 25. Izlazak sintetisanog ATP iz mitohondrija 26. Odnos P/O u respiratornom lancu 27. Ugljeni hidrati (struktura i podjela) 28. Skrob 29. Celuloza 30. Prva faza glikolize 31. Druga faza glikolize 32. Regulacija glikolize 33. Oksidativna dekarboksilacija piruvata 34. Sinteza oksalacetata 35. Reakcije ciklusa trikarbonskih kiselina 36. Regulacija ciklusa trikarbonskih kiselina 37. Energetski efekti oksidacije glukoze 38. Glikogenoliza 39. Pentozofosfatni put 40. Glukoneogeneza 41. Glikogeneza i regulacija glikogeneze 42. Fotosinteza 43. Masne kiseline 44. β-oksidacija masnih kiselina 45. Energetski bilans β-oksidacije masnih kiselina 46. Sporedni putevi oksidacije masnih kiselina 47. Biosinteza masnih kiselina

48. Elongacija masnih kiselina 49. Glicerofosfolipidi 50. Struktura, podjela i osobine aminokiselina 51. Nastajanje peptida i prirodni peptidi 52. Transaminacija aminokiselina 53. Oksidativna dezaminacija aminokiselina 54. Sinteza uree 55. Katabolizam ugljovodoničnog skeleta aminokiselina 56. Purinske i pirimidinske baze 57. Dezoksiribonukleinska kiselina 58. Ribonukleinske kiseline 59. Replikacija DNA, transkripcija 60. Sinteza proteina Banja Luka, 22. maj 2007. godine Prof. dr Jasminka Nikolić

Literatura: Jasminka Nikolić BIOHEMIJA ZA STUDENTE POLJOPRIVREDNOG FAKULTETA, Banja Luka 2007.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->